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Immunology and Infection

O Uso de diacetato carboxifluoresceína Succinimidyl Ester (CFSE) para monitorar a proliferação de linfócitos

doi: 10.3791/2259 Published: October 12, 2010

Summary

CFSE covalentemente rótulos de longa duração de moléculas intracelulares com o corante fluorescente, carboxifluoresceína. Como tal, quando uma célula se divide CFSE marcado, a sua progenitura têm metade da quantidade de fluorescência, que pode assim ser utilizada para avaliar a divisão celular. Este artigo descreve os procedimentos normalmente utilizados para a rotulagem linfócitos mouse com CFSE.

Abstract

Carboxifluoresceína succinimidyl éster (CFSE) é um meio eficaz e popular para monitorar de linfócitos divisão 1-3. CFSE covalentemente rótulos de longa duração de moléculas intracelulares com o corante fluorescente, carboxifluoresceína. Assim, quando uma célula se divide CFSE marcado, a sua progenitura são dotados de metade do número de carboxifluoresceína marcadas moléculas e, assim, cada divisão celular pode ser avaliada medindo a diminuição correspondente na fluorescência celular via citometria de fluxo. A capacidade de CFSE para rotular as populações de linfócitos com uma alta intensidade fluorescente de variância excepcionalmente baixo, juntamente com a sua baixa toxicidade celular, torná-lo um corante ideal para medir a divisão celular. Uma vez que é um corante de fluoresceína baseado também é compatível com uma ampla variedade de fluorocromos outras que a torna aplicável a multi-cor citometria de fluxo. Este artigo descreve os procedimentos normalmente utilizados para a rotulagem linfócitos do mouse com a finalidade de monitorar até 8 divisões celulares. Estas células marcadas pode ser usado tanto para in vitro e in vivo.

Protocol

1) Configuração de reagente

1.1) solução estoque CFSE

O corante é CFSE compra diacetato carboxifluoresceína succinimidyl éster (CFDA, SE) (MW 557,47 g / mol), normalmente em 25 frascos mg. Dissolver a 25 mg em 8,96 mL de uma solução de DMSO estoque final de 5 mM (loja como 50-100 mL alíquotas a -20 ° C durante vários meses). CFDA, SE irá reagir com solução aquosa por isso, é fundamental que tal exposição ser evitadas durante o armazenamento.

1.2) Os linfócitos

Isolar linfócitos de baço e gânglios linfáticos ou de ratos e ressuspender em 1 ml de meio de cultura (por exemplo, RPMI) com 5% inativado pelo calor (HI) de soro fetal bovino (FCS), com uma concentração celular de 0,5 x 06-10 outubro x 10 7 / mL.

2) Rotulagem CFSE

2.1 Método de rotina):

  1. Completamente ressuspender as células no volume de 1 mL de meio e coloque cuidadosamente no fundo de um fresco (sem contato com o) tubo cônico de 10 mL.
  2. Coloque o tubo horizontalmente (usando um tubo sem contato com o vai impedir a 1 ml de suspensão de células de se mover e prematuramente mistura com o, CFDA SE soluções).
  3. Juntar cuidadosamente 110 mL de PBS para a parte não entram em contato com o plástico no topo do tubo que garante que não faz contato com a solução celular.
  4. Ressuspender 1,1 mL do estoque de 5 mm de CFDA, SE na PBS 110 mL.
  5. Rapidamente a tampa do tubo e inverter e vortex bem para obter uniforme rápida mistura das soluções. Note-se que o corante CFSE está em uma concentração final de 5 mM, no entanto, a concentração ótima pode ter que ser determinados para cada lote preparado, e então verificado a cada seis meses para garantir que ele é eficaz.
  6. Incubar as células por 5 minutos em temperatura ambiente. Note-se que após a conversão do CFDA, SE a CFSE (ver discussão) torna-se o corante fluorescente e, portanto, propenso ao branqueamento pela exposição à luz excessiva. Assim, é aconselhável proteger o tubo da luz a partir deste ponto, por exemplo, cobrindo-o com papel alumínio.
  7. Lave as células através da diluição em 10 volumes de 20 ° C PBS contendo 5% de HI FCS, sedimentando por centrifugação a 300 xg por 5 min a 20 ° C e descartando o sobrenadante. Repita lavar mais duas vezes.

2.2 O método alternativo), que também é adequado para um maior número de células (10 - 30 x 10 7):

  1. Prepare um 2 x (10 mM) CFDA, SE solução pela adição de 2 mL do estoque mM 5-1 mL de PBS e rapidamente adicionar este a 1 mL de células ressuspenso cuidadosamente, em seguida, rapidamente a tampa do tubo e inverter e vortex bem para obter uniforme rápida mistura.
  2. Incubar as células por 5 min à temperatura ambiente e lave como nos passos 2.1 (f) e 2.1 (g).

2.3) As células podem então ser aplicado a um protocolo de interesse para a indução da divisão celular. Células marcadas pode ser usado em ambos in vitro e em ensaios in vivo.

2.4) Ao término do ensaio de proliferação, as células são colhidas e analisadas por citometria de fluxo (veja abaixo exemplos representativos).

3) Resultados Representante

Para avaliar a proliferação de linfócitos por diluição CFSE, é útil conhecer a fluorescência das células indivisível (ou seja, máximo de fluorescência) e não-rotulados células (ou seja, a fluorescência mínima). Portanto, seu projeto experimental deve levar em conta esses controles. Abaixo estão alguns exemplos de ensaios in vitro e em ensaios in vivo utilizando CFSE para medir T CD8 + a divisão celular por citometria de fluxo.

3.1) Em estimulação in vitro

A Figura 1 mostra os perfis de CFSE CFSE marcado com ovalbumina (OVA) específicos de células T CD8 + receptor transgênicos OT-I de células T após três dias da cultura com as células dendríticas pulsadas com várias quantidades de OVA. Células T CD8 + purificada a partir do baço e gânglios linfáticos da OT-I ratos foram marcados com CFSE e 1 x 10 5 células cultivadas com 3,3 x 10 4 DC. DC, onde pulsava com OVA por 1 hora a 37 ° C e lavadas duas vezes antes da cultura. Após 3 dias, as células onde colhidas e rotulados com anti-CD8-APC anticorpos e Hoechst 33258 e depois analisados ​​por citometria de fluxo (50 mil eventos coletados). Live (Hoechst 33258 -) CD8 + células são mostrados. Como controles, as células CD8 + T cultivadas por si só, mostra a intensidade CFSE de não-dividida células, enquanto as células não-rotulados mostra a auto-fluorescência das células e os limites de divisões celulares detectáveis. Note-se que quatro picos CFSE pode ser visto em cada um dos painéis, neste exemplo, indicando que as células foram submetidas até 3 divisões.

3.2) Na estimulação vivo

A Figura 2 mostra os perfis de CFSE CFSE marcado com receptor de células T OVA-específicas transgênicos CD8 + T OT-I células após 3 dias in vivo in a presença de 20 mg OVA. Células T CD8 + purificada a partir do baço e gânglios linfáticos da CD45.1 congênitas OT-I ratos foram marcados com CFSE e 5 x 10 6 células injetadas iv na veia lateral da cauda C56BL/6J (CD45.2 +) ratos. Depois de 2 hr camundongos foram injetados iv com 20 mg de OVA. Após 3 dias, baços de camundongos foram coletados, feita em uma suspensão de células individuais, rotulada com anti-B220-PerCP, anti-CD8-APC-Cy7 e anti-CD45.1-PE-Cy7 anticorpos e Hoechst 33258 e depois analisados por citometria de fluxo (1.000.000 eventos coletados). Live (Hoechst 33258 -) B220-células são mostrados no painel esquerdo e gated CD8 + + CD45.1 células mostrado no painel direito. Como controles, desestimulado CFSE marcado células T CD8 +, mostra a intensidade CFSE de não-dividida células, enquanto os não-rotulados células mostra a auto-fluorescência das células e os limites de divisões celulares detectáveis. Note que o uso da diferença CD45 allotypic é vital para resolver o CD8 + células T transferidos do host, como eles são um subconjunto menor do total de células CD8 + T (painel esquerdo). Note-se que a maioria das células cair dentro de 7 picos CFSE neste exemplo (painel direito), indicando que as células foram submetidas até 6 divisões.

Figura 1
Figura 1. Capacidade de CFSE marcado com ovalbumina (OVA) específicos de células T do receptor transgênicos CD8 + células OT-I T para responder in vitro para DC pulsado com diferentes concentrações de OVA, os dados mostraram estar após três dias de cultura. Nota população não-dividida de CD8 + T células na ausência de antígeno (histograma cinza claro) e auto-fluorescência da população não-rotulados (histograma cinza escuro). A figura mostra células T CD8 + que têm dividido 1-3 vezes com base em picos de diluição CFSE, com mais células T dividindo nas concentrações mais elevadas de antígeno.

Figura 2
Figura 2. Capacidade de CFSE marcado com ovalbumina (OVA) específicos de células T do receptor transgênicos células CD8 + OT-I T, quando adotivamente transferidos em camundongos C57BL / 6 para responder a OVA, os dados apresentados três dias após a transferência adotiva Painel esquerdo:. CD8 +, CD45. 1 + células T OT-1 em ratos destinatário. Painel da direita: perfil proliferação CFSE. Nota da população não-divididas de células T CD8 + em camundongos destinatário não receber o antígeno (histograma cinza claro) e auto-fluorescência de não-rotulados linfócitos (histograma cinza escuro). A figura mostra as células CD8 + T que têm dividido 1-6 vezes com base em picos de diluição CFSE.

Figura 3
Figura 3. A representação dos vários eventos moleculares que ocorrem durante a marcação das células com diacetato carboxifluoresceína succinimidyl éster (CFDA, SE). Para mais detalhes do processo veja o texto de discussão. Nota: 'CFSE' A sigla genérica, não CFDA, SE, é usado para descrever o reagente rotulagem e do processo de rotulagem em geral. Figura baseada em Parish 4.

Discussion

, A fim de apreciar como funciona e porque CFSE rotulagem uniforme, rápido é necessário para seu uso na análise de proliferação, é útil para compreender a base molecular da célula CFSE rotulagem. Isto pode ser dividido em duas fases, 1) entrada de célula e 2) rotulagem Protein (Figura 3). 1) entrada Cell: Entrada do corante para a célula é mediada pela forma diacetilados do corante, diacetato carboxifluoresceína succinimidyl éster (CFDA, SE). Os acetatos fazer a membrana permeante corante altamente permitindo seu fluxo rápido através da membrana plasmática. Esterases, presente dentro da célula, pegará o acetatos de CFDA, SE e, assim, dar lugar à forma CFSE do corante que é permeante de membranas muito menos, portanto, concentrar o corante dentro da célula. 2) rotulagem Proteína: Embora ambos CFDA, SE e CFSE têm amino-reativa cadeias laterais succinimidyl, apenas o CFSE é fluorescente. A alta concentração intracelular de CFSE facilita rotulagem nível rápido e de alta intracelular de proteínas. Rotulagem CFSE de células deve ser realizada rapidamente, a fim de obter uma população homogênea rotulados de células, que é crítico para a resolução de células que sofreram diversas divisões, como mostrado nos resultados representativos (Figura 1 e 2).

Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgments

O trabalho relatado neste artigo foi apoiado por uma Nacional de Saúde e Pesquisa Médica do Conselho (NHMRC) da Austrália Grant Program (CRP) e um Projeto NHMRC Grant (CRP e BJCQ). BJCQ também é um NHMRC Peter Doherty Fellow Pós-Doutorado.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CFDA,SE Molecular Probes, Life Technologies
DMSO Cambridge Isotope Laboratories
Lymphocytes eg mouse or human
RPMI GIBCO, by Life Technologies
FCS SAFC Global
10-15ml conical tubes Falcon BD
PBS GIBCO, by Life Technologies
Aluminium foil Capral Aluminium
Vortex Scientific Industries Inc.
Centrifuge Eppendorf
Flow cytometer BD Biosciences

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References

  1. Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 171, 131-137 (1994).
  2. Parish, C. R., Glidden, M. H., Quah, B. J., Warren, H. S. Use of the intracellular fluorescent dye CFSE to monitor lymphocyte migration and proliferation. Current protocols in immunology. Coligan, J. E. (2009).
  3. Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nature Protocols. 2, 2049-2056 (2007).
  4. Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol Cell Biol. 77, 499-508 (1999).
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Quah, B. J. C., Parish, C. R. The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation. J. Vis. Exp. (44), e2259, doi:10.3791/2259 (2010).More

Quah, B. J. C., Parish, C. R. The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation. J. Vis. Exp. (44), e2259, doi:10.3791/2259 (2010).

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