Summary
CFSE covalentemente rótulos de longa duração de moléculas intracelulares com o corante fluorescente, carboxifluoresceína. Como tal, quando uma célula se divide CFSE marcado, a sua progenitura têm metade da quantidade de fluorescência, que pode assim ser utilizada para avaliar a divisão celular. Este artigo descreve os procedimentos normalmente utilizados para a rotulagem linfócitos mouse com CFSE.
Abstract
Carboxifluoresceína succinimidyl éster (CFSE) é um meio eficaz e popular para monitorar de linfócitos divisão 1-3. CFSE covalentemente rótulos de longa duração de moléculas intracelulares com o corante fluorescente, carboxifluoresceína. Assim, quando uma célula se divide CFSE marcado, a sua progenitura são dotados de metade do número de carboxifluoresceína marcadas moléculas e, assim, cada divisão celular pode ser avaliada medindo a diminuição correspondente na fluorescência celular via citometria de fluxo. A capacidade de CFSE para rotular as populações de linfócitos com uma alta intensidade fluorescente de variância excepcionalmente baixo, juntamente com a sua baixa toxicidade celular, torná-lo um corante ideal para medir a divisão celular. Uma vez que é um corante de fluoresceína baseado também é compatível com uma ampla variedade de fluorocromos outras que a torna aplicável a multi-cor citometria de fluxo. Este artigo descreve os procedimentos normalmente utilizados para a rotulagem linfócitos do mouse com a finalidade de monitorar até 8 divisões celulares. Estas células marcadas pode ser usado tanto para in vitro e in vivo.
Protocol
1) Configuração de reagente
1.1) solução estoque CFSE
O corante é CFSE compra diacetato carboxifluoresceína succinimidyl éster (CFDA, SE) (MW 557,47 g / mol), normalmente em 25 frascos mg. Dissolver a 25 mg em 8,96 mL de uma solução de DMSO estoque final de 5 mM (loja como 50-100 mL alíquotas a -20 ° C durante vários meses). CFDA, SE irá reagir com solução aquosa por isso, é fundamental que tal exposição ser evitadas durante o armazenamento.
1.2) Os linfócitos
Isolar linfócitos de baço e gânglios linfáticos ou de ratos e ressuspender em 1 ml de meio de cultura (por exemplo, RPMI) com 5% inativado pelo calor (HI) de soro fetal bovino (FCS), com uma concentração celular de 0,5 x 06-10 outubro x 10 7 / mL.
2) Rotulagem CFSE
2.1 Método de rotina):
- Completamente ressuspender as células no volume de 1 mL de meio e coloque cuidadosamente no fundo de um fresco (sem contato com o) tubo cônico de 10 mL.
- Coloque o tubo horizontalmente (usando um tubo sem contato com o vai impedir a 1 ml de suspensão de células de se mover e prematuramente mistura com o, CFDA SE soluções).
- Juntar cuidadosamente 110 mL de PBS para a parte não entram em contato com o plástico no topo do tubo que garante que não faz contato com a solução celular.
- Ressuspender 1,1 mL do estoque de 5 mm de CFDA, SE na PBS 110 mL.
- Rapidamente a tampa do tubo e inverter e vortex bem para obter uniforme rápida mistura das soluções. Note-se que o corante CFSE está em uma concentração final de 5 mM, no entanto, a concentração ótima pode ter que ser determinados para cada lote preparado, e então verificado a cada seis meses para garantir que ele é eficaz.
- Incubar as células por 5 minutos em temperatura ambiente. Note-se que após a conversão do CFDA, SE a CFSE (ver discussão) torna-se o corante fluorescente e, portanto, propenso ao branqueamento pela exposição à luz excessiva. Assim, é aconselhável proteger o tubo da luz a partir deste ponto, por exemplo, cobrindo-o com papel alumínio.
- Lave as células através da diluição em 10 volumes de 20 ° C PBS contendo 5% de HI FCS, sedimentando por centrifugação a 300 xg por 5 min a 20 ° C e descartando o sobrenadante. Repita lavar mais duas vezes.
2.2 O método alternativo), que também é adequado para um maior número de células (10 - 30 x 10 7):
- Prepare um 2 x (10 mM) CFDA, SE solução pela adição de 2 mL do estoque mM 5-1 mL de PBS e rapidamente adicionar este a 1 mL de células ressuspenso cuidadosamente, em seguida, rapidamente a tampa do tubo e inverter e vortex bem para obter uniforme rápida mistura.
- Incubar as células por 5 min à temperatura ambiente e lave como nos passos 2.1 (f) e 2.1 (g).
2.3) As células podem então ser aplicado a um protocolo de interesse para a indução da divisão celular. Células marcadas pode ser usado em ambos in vitro e em ensaios in vivo.
2.4) Ao término do ensaio de proliferação, as células são colhidas e analisadas por citometria de fluxo (veja abaixo exemplos representativos).
3) Resultados Representante
Para avaliar a proliferação de linfócitos por diluição CFSE, é útil conhecer a fluorescência das células indivisível (ou seja, máximo de fluorescência) e não-rotulados células (ou seja, a fluorescência mínima). Portanto, seu projeto experimental deve levar em conta esses controles. Abaixo estão alguns exemplos de ensaios in vitro e em ensaios in vivo utilizando CFSE para medir T CD8 + a divisão celular por citometria de fluxo.
3.1) Em estimulação in vitro
A Figura 1 mostra os perfis de CFSE CFSE marcado com ovalbumina (OVA) específicos de células T CD8 + receptor transgênicos OT-I de células T após três dias da cultura com as células dendríticas pulsadas com várias quantidades de OVA. Células T CD8 + purificada a partir do baço e gânglios linfáticos da OT-I ratos foram marcados com CFSE e 1 x 10 5 células cultivadas com 3,3 x 10 4 DC. DC, onde pulsava com OVA por 1 hora a 37 ° C e lavadas duas vezes antes da cultura. Após 3 dias, as células onde colhidas e rotulados com anti-CD8-APC anticorpos e Hoechst 33258 e depois analisados por citometria de fluxo (50 mil eventos coletados). Live (Hoechst 33258 -) CD8 + células são mostrados. Como controles, as células CD8 + T cultivadas por si só, mostra a intensidade CFSE de não-dividida células, enquanto as células não-rotulados mostra a auto-fluorescência das células e os limites de divisões celulares detectáveis. Note-se que quatro picos CFSE pode ser visto em cada um dos painéis, neste exemplo, indicando que as células foram submetidas até 3 divisões.
3.2) Na estimulação vivo
A Figura 2 mostra os perfis de CFSE CFSE marcado com receptor de células T OVA-específicas transgênicos CD8 + T OT-I células após 3 dias in vivo in a presença de 20 mg OVA. Células T CD8 + purificada a partir do baço e gânglios linfáticos da CD45.1 congênitas OT-I ratos foram marcados com CFSE e 5 x 10 6 células injetadas iv na veia lateral da cauda C56BL/6J (CD45.2 +) ratos. Depois de 2 hr camundongos foram injetados iv com 20 mg de OVA. Após 3 dias, baços de camundongos foram coletados, feita em uma suspensão de células individuais, rotulada com anti-B220-PerCP, anti-CD8-APC-Cy7 e anti-CD45.1-PE-Cy7 anticorpos e Hoechst 33258 e depois analisados por citometria de fluxo (1.000.000 eventos coletados). Live (Hoechst 33258 -) B220-células são mostrados no painel esquerdo e gated CD8 + + CD45.1 células mostrado no painel direito. Como controles, desestimulado CFSE marcado células T CD8 +, mostra a intensidade CFSE de não-dividida células, enquanto os não-rotulados células mostra a auto-fluorescência das células e os limites de divisões celulares detectáveis. Note que o uso da diferença CD45 allotypic é vital para resolver o CD8 + células T transferidos do host, como eles são um subconjunto menor do total de células CD8 + T (painel esquerdo). Note-se que a maioria das células cair dentro de 7 picos CFSE neste exemplo (painel direito), indicando que as células foram submetidas até 6 divisões.
Figura 1. Capacidade de CFSE marcado com ovalbumina (OVA) específicos de células T do receptor transgênicos CD8 + células OT-I T para responder in vitro para DC pulsado com diferentes concentrações de OVA, os dados mostraram estar após três dias de cultura. Nota população não-dividida de CD8 + T células na ausência de antígeno (histograma cinza claro) e auto-fluorescência da população não-rotulados (histograma cinza escuro). A figura mostra células T CD8 + que têm dividido 1-3 vezes com base em picos de diluição CFSE, com mais células T dividindo nas concentrações mais elevadas de antígeno.
Figura 2. Capacidade de CFSE marcado com ovalbumina (OVA) específicos de células T do receptor transgênicos células CD8 + OT-I T, quando adotivamente transferidos em camundongos C57BL / 6 para responder a OVA, os dados apresentados três dias após a transferência adotiva Painel esquerdo:. CD8 +, CD45. 1 + células T OT-1 em ratos destinatário. Painel da direita: perfil proliferação CFSE. Nota da população não-divididas de células T CD8 + em camundongos destinatário não receber o antígeno (histograma cinza claro) e auto-fluorescência de não-rotulados linfócitos (histograma cinza escuro). A figura mostra as células CD8 + T que têm dividido 1-6 vezes com base em picos de diluição CFSE.
Figura 3. A representação dos vários eventos moleculares que ocorrem durante a marcação das células com diacetato carboxifluoresceína succinimidyl éster (CFDA, SE). Para mais detalhes do processo veja o texto de discussão. Nota: 'CFSE' A sigla genérica, não CFDA, SE, é usado para descrever o reagente rotulagem e do processo de rotulagem em geral. Figura baseada em Parish 4.
Discussion
, A fim de apreciar como funciona e porque CFSE rotulagem uniforme, rápido é necessário para seu uso na análise de proliferação, é útil para compreender a base molecular da célula CFSE rotulagem. Isto pode ser dividido em duas fases, 1) entrada de célula e 2) rotulagem Protein (Figura 3). 1) entrada Cell: Entrada do corante para a célula é mediada pela forma diacetilados do corante, diacetato carboxifluoresceína succinimidyl éster (CFDA, SE). Os acetatos fazer a membrana permeante corante altamente permitindo seu fluxo rápido através da membrana plasmática. Esterases, presente dentro da célula, pegará o acetatos de CFDA, SE e, assim, dar lugar à forma CFSE do corante que é permeante de membranas muito menos, portanto, concentrar o corante dentro da célula. 2) rotulagem Proteína: Embora ambos CFDA, SE e CFSE têm amino-reativa cadeias laterais succinimidyl, apenas o CFSE é fluorescente. A alta concentração intracelular de CFSE facilita rotulagem nível rápido e de alta intracelular de proteínas. Rotulagem CFSE de células deve ser realizada rapidamente, a fim de obter uma população homogênea rotulados de células, que é crítico para a resolução de células que sofreram diversas divisões, como mostrado nos resultados representativos (Figura 1 e 2).
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
O trabalho relatado neste artigo foi apoiado por uma Nacional de Saúde e Pesquisa Médica do Conselho (NHMRC) da Austrália Grant Program (CRP) e um Projeto NHMRC Grant (CRP e BJCQ). BJCQ também é um NHMRC Peter Doherty Fellow Pós-Doutorado.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CFDA,SE | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| DMSO | Cambridge Isotope Laboratories | ||
| Lymphocytes | eg mouse or human | ||
| RPMI | GIBCO, by Life Technologies | ||
| FCS | SAFC Global | ||
| 10-15ml conical tubes | Falcon BD | ||
| PBS | GIBCO, by Life Technologies | ||
| Aluminium foil | Capral Aluminium | ||
| Vortex | Scientific Industries Inc. | ||
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| Flow cytometer | BD Biosciences |
References
- Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 171, 131-137 (1994).
- Parish, C. R., Glidden, M. H., Quah, B. J., Warren, H. S. Use of the intracellular fluorescent dye CFSE to monitor lymphocyte migration and proliferation. Current protocols in immunology. Coligan, J. E. , (2009).
- Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nature Protocols. 2, 2049-2056 (2007).
- Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol Cell Biol. 77, 499-508 (1999).
