स्तन ग्रंथि और चूहे में स्तन कैंसर के खतरे को आकृति विज्ञान में परिवर्तन

Summary

हमारी प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे चूहे पेट स्तन ग्रंथि टुकड़े करना करने के लिए और स्तन ग्रंथि पूरी mounts तैयार करने के लिए कैसे. यह भी बताता है कि कैसे स्तन ग्रंथि आकारिकी तीन अंत अंक (टर्मिनल अंत कलियों की संख्या, उपकला बढ़ाव और भेदभाव) का उपयोग का विश्लेषण करने के लिए और जो आहार संशोधनों से अवगत कराया गया चूहों में स्तन कैंसर के जोखिम की भविष्यवाणी करने के लिए इन परिणामों का उपयोग

Abstract

स्तन कैंसर शो के कृंतक मॉडल में अध्ययन है कि utero और pubertal अवधि, के दौरान आहार / हार्मोनल कारकों को जोखिम जब स्तन ग्रंथि व्यापक मॉडलिंग और फिर मॉडलिंग आए, कैसरजन प्रेरित स्तन ट्यूमर के लिए संवेदनशीलता बदल . इसी तरह के निष्कर्ष मानव में वर्णित किया गया है: उदाहरण के लिए, उच्च birthweight बाद स्तन कैंसर विकसित होने का जोखिम बढ़ जाती है, और बचपन के दौरान सोया के आहार का सेवन स्तन कैंसर के खतरे कम हो जाती है. यह सोचा है कि इन प्रसव पूर्व और प्रसवोत्तर आहार संशोधनों स्तन ग्रंथि में लगातार morphological परिवर्तन है कि बारी में स्तन कैंसर के खतरे को जीवन में बाद में संशोधित प्रेरित. इन morphological परिवर्तन की संभावना डीएनए मेथिलिकरण में परिवर्तन histones और miRNA अभिव्यक्ति है कि तो जीन प्रतिलेखन को प्रभावित के रूप में epigenetic संशोधनों, दर्शाते हैं. हम इस लेख में वर्णन कैसे स्तन ग्रंथि आकारिकी में परिवर्तन चूहों में स्तन कैंसर के जोखिम की भविष्यवाणी कर सकते हैं. हमारी प्रोटोकॉल विशेष रूप से वर्णन कैसे काटना और चूहा पेट स्तन ग्रंथि को निकालने और स्तन ग्रंथि पूरी mounts तैयार करने के लिए कैसे. यह भी बताता है कि कैसे तीन अंत अंक (टर्मिनल अंत कलियों की संख्या, उपकला बढ़ाव और भेदभाव) और डेटा का उपयोग करने के लिए स्तन कैंसर के विकसित होने का जोखिम की भविष्यवाणी के अनुसार स्तन ग्रंथि आकारिकी का विश्लेषण करने के लिए.

Protocol

1. पेट स्तन ग्रंथि के हटाने और एक साबुत माउंट तैयारी

1. IACUC दिशा निर्देशों के अनुसार पशु euthanize. सुई, या टेप पैर के साथ अपने पैरों से सतह बोर्ड पर अपनी पीठ पर जानवरों पिन, और इथेनॉल (EtOH) के साथ गीली त्वचा को पोंछ. त्वचा संदंश के साथ एक छोटा सा लिफ्ट और तेज कैंची के साथ # 5 निपल्स गर्दन की ओर जोड़ी और कटौती के बीच शुरू त्वचा में एक midline चीरा बनाने. पिछले पैरों की ओर midline से एक औंधा वाई चीरा बनाओ. यदि वक्ष स्तन ग्रंथियों को भी एकत्र हो रहे हैं, सामने पैर की दिशा में # 2 निपल्स की जोड़ी के बीच midline से भी एक वाई चीरा बनाते हैं.
2. कैंची से काटना त्वचा उल्टे वाई चीरा के एक तरफ खोलने के लिए बेनकाब पेट # 4 स्तन ग्रंथि, स्तन ग्रंथियों की त्वचा से जुड़े होते हैं. सतह के बोर्ड पर सुई के साथ त्वचा पिन, ग्रंथि के लिए पूरी तरह से बेनकाब. समय पर एक तरफ और ग्रंथि कार्य करें.
3. स्तन ग्रंथि या तो तेज कैंची और / या एक स्केलपेल का उपयोग करते हुए, समीपस्थ क्षेत्र से निपल के करीब शुरू करने और जानवर की रीढ़ की दिशा में ग्रंथि के बाहर का अंत की दिशा में काम कर त्वचा से मुक्त काटना. (यह कई मिनट लग, विशेष रूप से एक बड़े चूहे में कर सकते हैं.)
4. तुरंत एक उचित लेबल गिलास स्लाइड (एक उचित स्थायी मार्कर पेन और / या एक हीरे पेन 'का उपयोग करें) पर अलग ग्रंथि फैला है, और ध्यान से अपने मूल आकार और बगल में आकार करने के लिए इसी ग्रंथि फैल. गिलास स्लाइड ग्रंथि से भी बड़ा होना चाहिए. स्लाइड पर ग्रंथि के प्रसार के बाद, यह थोड़ी देर के लिए मेज पर बैठते हैं, ताकि ग्रंथि स्लाइड पर चिपक जाती है, लेकिन इसे सूखा नहीं है.
5. एक Carnoy लगानेवाला (75% हिमनदों एसिटिक एसिड, 25% पूर्ण इथेनॉल = EtOH) से युक्त जार में स्लाइड रखो, यह कमरे के तापमान (आर टी) पर 2 दिन या उससे अधिक समय के लिए धूआं हुड में तय हो. स्लाइड्स भी समय की एक लंबी अवधि के लिए लगानेवाला में छोड़ा जा सकता.
6. आरटी से कम 1 घंटे के लिए 70% EtOH में स्लाइड्स धो.
7. आरटी पर 30 मिनट के लिए आसुत पानी में कुल्ला.
8. 2 दिन या उससे अधिक समय के लिए कारमाइन फिटकिरी * दाग) दाग (जब तक आप देखते हैं कि लिम्फ नोड्स के माध्यम से सना हुआ है, स्लाइड के पीछे की ओर देखो).
9. EtOH की बढ़ती श्रृंखला, प्रत्येक में 1 घंटे में धो: 70% - 95% -> 100%. निरपेक्ष EtOH में पिछले धोने के बाद xylene में ग्रंथियों डाल दिया. आरटी में धूआं हुड में कम से कम 2 दिनों के लिए बैठते हैं. यह अंतिम कदम स्तन वसा पैड के स्तन ग्रंथि अर्थ delipidation के समाशोधन है, और पारदर्शिता में बाद में वृद्धि. fattier ग्रंथि अब समाशोधन समय की आवश्यकता है.
10. Permount जैसे बढ़ते मीडिया का उपयोग कर कवर फिसल जाता है के साथ माउंट. स्लाइड्स सूखी अच्छी तरह से एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के अंतर्गत देख से पहले कई दिनों चलो.
    * कारमाइन फिटकिरी दाग:
    
    प्लेस 1 ग्राम (C1022 सिग्मा) लाल रंग और 500 एमएल आसुत और 20 मिनट के लिए पानी उबालने में 2.5 छ एल्यूमीनियम पोटेशियम सल्फेट (A7167 सिग्मा). 500 एमएल पानी के साथ अंतिम मात्रा समायोजित करें. फ़िल्टर और सर्द. समाधान कई महीनों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. त्यागें जब रंग कमजोर हो जाता है.

2. स्तन ग्रंथि पूरे माउंट आकृति विज्ञान के विश्लेषण

स्तन ग्रंथि पूरे mounts आकारिकी निम्नलिखित अंत अंक और स्तन कैंसर के खतरे के साथ सहसंबद्ध परिणामों के अनुसार विश्लेषण किया है.

1. स्तन ग्रंथि 21 PND में पूरी माउंट (उम्र पूर्व pubertal):
   • उपकला वृद्धि:
     • निपल से उपकला पेड़ के अंत (मिलीमीटर में) से दूरी, एक शासक का उपयोग करके मापा
   • घातक परिवर्तन के लिए संभावित:
     • TEBs की संख्या (टर्मिनल अंत कलियों), एक रोशनी खुर्दबीन के तहत गिना. TEBs सबसे बड़ा बल्बनुमा स्तन उपकला पेड़ के बाहर अंत में ही स्थित संरचनाओं हैं
   • भेदभाव:
     • AB1 स्कोर (वायुकोशीय कली) (0-5). वायुकोशीय कलियों उपकला भर में फैले हुए हैं.
     • AB2 स्कोर (0-5)
   
   Wholes mounts एक रोशनी खुर्दबीन के तहत रन बनाए हैं. AB1 और AB2 से स्कोर मानों एक अंतिम भेदभाव स्कोर के लिए जोड़ रहे हैं.
2. स्तन ग्रंथि पूरे माउंट 50 PND (पोस्ट - pubertal उम्र) में एकत्र:
   • उपकला वृद्धि:
     • लसीका नोड से उपकला पेड़ के अंत (मिलीमीटर में) से दूरी, एक शासक का उपयोग करके मापा.
     • उपकला पेड़ की नोक से वसा पैड के अंत करने के लिए दूरी, एक शासक का उपयोग करके मापा.
   • घातक परिवर्तन के लिए संभावित:
     • TEBs की संख्या, एक रोशनी खुर्दबीन के तहत गिना
   • भेदभाव:
     • AB1 स्कोर (0-5)
     • AB2 स्कोर (0-5)
     • Lobules स्कोर (0-5)
   
   Wholes mounts एक रोशनी खुर्दबीन के तहत रन बनाए हैं. भेदभाव दो तरीकों में आकलन किया जाएगा. सबसे पहले, AB1, AB2 और lobules से स्कोर मानों एक अंतिम भेदभाव स्कोर के लिए जोड़ रहे हैं. इसके अलावा, lobules स्कोर और AB1 + AB2 स्कोर के बीच अनुपात की गणना की जाएगी. ABS lobules अंतर है, और उच्च lobules और पेट के बीच का अनुपात अधिक विभेदित ग्रंथि है.

3. स्पर्श क्रिया और चूहे और स्तन ग्रंथि आकृति विज्ञान के लिए सहसंबंध में स्तन ट्यूमर मापन

1. इस प्रक्रिया को शुरू करने के लिए, पीठ पर हथेली के साथ पूरे शरीर लोभी से सिर के पीछे तर्जनी और अंगूठे और विपरीत कांख के तहत दूसरी उंगली के साथ चूहे पकड़. चूहा मुड़ें तो इसके पीछे पर झूठ बोल रही है, और किसी भी स्तन ट्यूमर का पता लगाने के लिए टटोलना, स्पर्शनीय ट्यूमर एक "गांठ" की तरह महसूस करना चाहिए.
2. अगला चौड़ाई, लंबाई, और ट्यूमर की ऊंचाई मापने के लिए उपयोग करने के लिए एक नली का व्यास. ट्यूमर दीर्घवृत्ताभ सूत्र, वॉल्यूम = 1/6πabc, जहां 'एक' चौड़ाई = 'ख' = लंबाई, और 'ग' = ऊंचाई. उपयोग कर वॉल्यूम की गणना
3. मैन्युअल रूप से स्थान और एक साप्ताहिक आधार पर एक नोटबुक में ट्यूमर का आकार रिकॉर्ड. इस डेटा स्प्रेडशीट के लिए बाद में हस्तांतरित किया जाएगा.

4. प्रतिनिधि परिणाम

स्तन वसा पैड और इसके प्रसंस्करण wholemount की सावधानी से विच्छेदन स्तन ग्रंथि के विकास राज्य के मूल्यांकन की अनुमति देगा. जब हर कदम सही ढंग से किया है, पूरे स्तन उपकला पेड़ वसा पैड के भीतर स्पष्ट रूप से दिखाई है, और इस TEBs और वायुकोशीय कलियों और lobules के घनत्व की गणना की संख्या की आसान दृढ़ संकल्प की अनुमति देता है. तैयारी wholemounts में missteps विफलता के लिए पूरी वसा पैड, अपर्याप्त फिक्सिंग, और अपर्याप्त समाशोधन टुकड़े करना शामिल हो सकता है.

स्तन ग्रंथि आकारिकी का आकलन संरचनाओं वर्तमान की संख्या है कि वृद्धि स्तन ट्यूमर (TEBs), उपकला संरचनाओं (वायुकोशीय कलियों और lobules) की भिन्नता की डिग्री, और वृद्धि के उपाय (ductal बढ़ाव) के लिए दे सकते हैं के बारे में जानकारी प्रदान करेगा. यह महत्वपूर्ण है टर्मिनल छोर तक TEBs अलग; बाद उपकला के बाहर अंत में स्थित हैं, इसी तरह TEBs के लिए, लेकिन वे TEBs की तुलना में छोटे होते हैं और घातक ट्यूमर के लिए वृद्धि नहीं देते. टर्मिनल समाप्त होता है उपकला पेड़ के भीतर भी देखा जाता है.

चित्रा 1: अच्छी तरह से तैयार स्तन ग्रंथि पूरे माउंट के प्रतिनिधि परिणाम ग्रंथि के सभी घटकों ठीक से dissected है और लाल रंग धुंधला हो जाना इष्टतम है.

चित्रा 2: एक खराब तैयार स्तन ग्रंथि पूरे माउंट के प्रतिनिधि परिणाम ग्रंथि ठीक से किया गया है (ग्रंथि के बाहर का भाग लापता है) dissected है, ठीक से नहीं बढ़ाया गया और delipidation पूरी तरह से नहीं हुई है .

Discussion

स्तन ग्रंथि रूपात्मक अंक - अंत और उपकला पेड़ के विकास का आकलन करने के लिए भविष्यवाणी है कि प्रारंभिक जीवन आहार जोड़तोड़, या अन्य जोड़तोड़ जो utero या prepubertal हार्मोनल वातावरण में बदल, बाद में स्तन कैंसर के खतरे को संशोधित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. के बाद से मानव में स्तन कैंसर स्तन संरचनाओं (टर्मिनल वाहिनीपरक lobular इकाइयों, TDLUs) चूहों में TEBs के समान में शुरू की है, इस तकनीक के लिए प्रारंभिक जीवन जोखिम स्तन कैंसर के खतरे को प्रभावित करने की क्षमता निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, महिलाओं में उच्च mammographic घनत्व 4-6 गुना से स्तन कैंसर का खतरा बढ़ जाता है, और स्तन उपकला पेड़ के विकास का आकलन करने के लिए कारक हैं जो mammographic घनत्व और कारक हैं जो इस घनत्व कम निर्धारित की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस जानकारी को प्राप्त करने के लिए, स्तन ग्रंथि पूरी तरह से हो सकता है, dissected चाहिए ठीक से एक गिलास स्लाइड एक खुर्दबीन के नीचे इतना है कि अपने सभी घटकों visualized किया जा सकता पर बढ़ाया. इसके अलावा, उचित लाल रंग धुंधला हो जाना और xylene में delipidation पूरे mounts है कि स्तन कैंसर के जोखिम मूल्यांकन के लिए उपयुक्त हैं प्रदान करेगा.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glacial acetic acid	Electron Microscopy Sciences	AX0073-9	Carnoy’s Fixative
Absolute ethanol	The Waner-Graham Co.	64-17-5	Carnoy’s Fixative
Carmine	Sigma-Aldrich	C1022	Carmine solution
Aluminum potassium sulfate	Sigma-Aldrich	A7167	Carmine solution