变化在大鼠乳腺形态和患乳腺癌的风险

Summary

我们的协议描述了如何解剖大鼠腹部的乳腺和如何准备乳腺整个坐骑。它还介绍了如何分析乳腺形态，使用三个端点（末端芽数，上皮细胞伸长和分化），并利用这些结果来预测膳食修改暴露大鼠乳腺癌的风险

Abstract

在乳腺癌显示的啮齿类动物模型的研究时， 暴露在子宫内和青春期期间，饮食/荷尔蒙因素对乳腺进行广泛的建模和重新建模，改变致癌物诱发乳腺肿瘤的易感性。类似的研究结果已在人类描述：例如，高出生体重会增加以后患乳腺癌的风险，并在童年的大豆膳食摄入量减少患乳腺癌的风险。据认为，这些产前和产后的饮食修改诱发持久的形态在​​乳腺的变化，反过来说，修改以后的生活中患乳腺癌的风险。这些形态的变化可能反映了表观遗传修饰，如DNA甲基化的变化，组蛋白和miRNA的表达，进而影响基因的转录。在这篇文章中，我们描述了如何在乳腺形态的变化可以预测在大鼠乳腺癌的风险。我们的协议，具体介绍如何解剖和删除大鼠腹部乳腺，以及如何准备乳腺整个坐骑。它还介绍了如何根据三个终点（末端芽数，上皮细胞伸长和分化），并利用这些数据来预测发展乳腺癌的风险分析乳腺形态。

Protocol

1。去除腹部的乳腺和准备整装

1. 根据IACUC指引安乐死的动物。引脚从它的腿的动物在它的后面，用针或磁带的双腿上表面板，并用乙醇（酒精）擦拭皮肤湿。提起皮肤有点与钳，用锋利的剪刀，开始对＃5乳头和削减对颈部皮肤中线切口。请倒Y切口从中线对的后腿。如果胸部乳腺增生病也将被收集，使＃2乳头对一双前腿之间的中线也是Ÿ切口。
2. 解剖的皮肤倒Y切口一侧打开，用剪刀，暴露腹部＃4乳腺，乳腺是附着在皮肤上。引脚针在表面上板的皮肤，完全暴露腺体。工作的时候一边和腺体。
3. 剖析乳腺免费使用锋利的剪刀和/或手术刀，从近端面积接近乳头和腺体的末端对工作，对动物的脊椎从皮肤。 （这可能需要几分钟，尤其是在一个旧的大鼠。）
4. 立即蔓延到一个适当标记的玻片上（使用适当的永久性记号笔和/或“钻石笔”）的分离腺，并蔓延到原来的大小和形状在原地仔细相应的腺体。载玻片必须大于腺体。之后蔓延到幻灯片上的腺体，它坐在桌子上一段时间，使腺体坚持到幻灯片，但不让它干。
5. 放入包含一罐卡诺固定液（75％冰乙酸，25％的无水乙醇=乙醇）的幻灯片，让它在室温（RT）固定在2天或更长时间的通风柜。幻灯片也可以留在一个较长时期内的固定液。
6. 在室温下1小时，洗净，在70％乙醇的幻灯片。
7. 蒸馏水冲洗，在室温下30分钟。
8. 染色为2天或更长的时间（直到你看到淋巴结染色的胭脂红铝染色*）;看看背面的幻灯片）。
9. 洗涤系列的乙醇，在每1小时：70％ - > 95％ - 100％。最后一次洗涤后，在绝对乙醇在二甲苯中的腺体。让RT通风柜坐至少2天。这最后一步是结算的意义delipidation乳腺，乳腺脂肪垫，并在其后增加透明度。油腻腺体是结算时间是必需的。
10. 安装与使用安装的媒体，如Permount，盖单。干的好让幻灯片（数天）前一个立体显微镜下观察。
    *胭脂红铝染色：
    
    将1克朱砂（Sigma公司C1022）和2.5克硫酸铝钾（Sigma公司A7167）在500毫升蒸馏水，煮沸20分钟。调整最终体积500毫升水。过滤和冷藏。解决方案可用于几个月。丢弃时颜色变弱。

2。乳腺整装形态分析

乳腺整个坐骑形态是根据以下的终点和乳腺癌的风险相关的结果分析。

1. 乳腺整个PND的21安装（青春期前年龄）：
   • 上皮生长：
     • 从乳头上皮树（毫米）的距离，用一把尺子测量
   • 恶变的可能性：
     • TEBs（末端芽），光学显微镜下计数。 TEBs是只有在乳腺上皮树的末端位于最大的球根结构
   • 辨证：
     • AB1类（肺泡芽）评分（0-5）。肺泡芽遍布上皮。
     • AB2型得分（0-5）
   
   光显微镜下取得Wholes坐骑。从AB1和AB2型的得分值增加为最终分化得分。
2. 乳腺整个安装收集的PND 50（后青春期的年龄）：
   • 上皮生长：
     • 从淋巴结上皮树（毫米）的距离，用一把尺子衡量。
     • 从上皮树的一角，脂肪垫的距离，用一把尺子衡量。
   • 恶变的可能性：
     • 数TEBs，光学显微镜下计数
   • 辨证：
     • AB1得分（0-5）
     • AB2型得分（0-5）
     • 小叶得分（0-5）
   
   光显微镜下取得Wholes坐骑。分化将评估在两个方面。首先，从AB1，AB2型和小叶的评分值增加最终分化得分。此外，小叶得分和AB1 + AB2得分之间的比例计算。 ABS区分小叶，小叶和ABS之间的比例越高，越有区别的腺体。

3。触诊大鼠乳腺肿瘤的测量及相关乳腺形态

1. 要开始此过程中，按住老鼠，抓在背后的手掌整个身体的头部后面用食指和拇指和相反的腋窝下第二个手指。所以它是躺在它的后路，将大鼠和触诊检测到任何乳腺肿瘤;​​扪及肿瘤应该感到像一个“疙瘩”。
2. 接下来，使用一个游标卡尺测量的宽度，长度，高度和肿瘤。计算肿瘤体积，使用椭球体公式，卷=1/6πabc，其中'A'，'B'=宽度=长度，'C'=身高。
3. 手工记录肿瘤的位置和大小在每周的笔记本。这些数据将被转移到电子表格后。

4。代表性的成果

乳腺脂肪垫和处理，以wholemount小心剥离将使乳腺的发育状态的评估。当每一步都做得正确，整个乳腺上皮树是清晰可见的脂肪垫内，这使得容易测定TEBs和肺泡芽和小叶的密度计算。在准备wholemounts的失误可能包括解剖，整个脂肪垫，固定不足，和不足，结算失败。

评估将提供乳腺形态结构，目前的数量，可能会引起乳腺肿瘤（TEBs），（肺泡芽和小叶）上皮结构的分化程度，以及增长的措施（导管伸长）的信息。重要的是单独TEBs终端两端的，后者是位于末端的上皮细胞，同样以TEBs，但他们是比TEBs小，不引起恶性肿瘤。也看到终端两端的上皮树内。

图1：代表性的结果做好准备乳腺整装 ，腺体的所有组件已正确解剖和胭脂红染色是最优的。

图2：一个准备不足的乳腺整装代表性的结果，腺体已经正确的解剖（远端部分腺体缺失），一直没有得到很好的拉伸和delipidation还没有完全发生。

Discussion

评估乳腺形态的最终点和上皮树的生长，可用于预测是否早期的生活饮食的操作，或在子宫内或青春期的激素环境改变的其他操作，修改后乳腺癌的风险。由于在人类乳腺癌是乳腺结构（终端导管小叶单位，TDLUs）大鼠TEBs相似的启动，这种技术可用于确定早期生活中的接触可能会影响到患乳腺癌的风险。此外，乳腺密度高的妇女增加乳腺癌的4-6倍的风险，并评估乳腺上皮树的生长，可用于识别的决定因素乳腺密度和减少这种密度的因素。要获得此信息，应充分解剖乳腺，适当在玻片上捉襟见肘，因此，它的所有组件可以在显微镜下可视化。此外，适当胭脂红染色和二甲苯delipidation将提供适用于乳腺癌的风险评估的整个坐骑。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glacial acetic acid	Electron Microscopy Sciences	AX0073-9	Carnoy’s Fixative
Absolute ethanol	The Waner-Graham Co.	64-17-5	Carnoy’s Fixative
Carmine	Sigma-Aldrich	C1022	Carmine solution
Aluminum potassium sulfate	Sigma-Aldrich	A7167	Carmine solution