ラットにおける乳腺の形態と乳癌リスクの変化

Summary

我々のプロトコルは、ラット腹部乳腺を細かく分析し、どのように乳腺全体のマウントを準備する方法について説明します。また、3つのエンドポイント（終端蕾の数、上皮伸長と分化）を使用して、乳腺の形態を分析し、食事の修飾にさらされたラットで乳腺がんのリスクを予測するためにこれらの結果を使用する方法について説明します。

Abstract

子宮と思春期の時の食事/ホルモン因子へのエクスポージャーその乳がんショーの齧歯類モデルでの研究は、乳腺が広範なモデリングとリモデリングを受けるとき、発癌物質誘発性乳腺腫瘍の感受性を変化させる。同様の知見がヒトに記載されている：例えば、高い出生時体重は、乳がんの発症後のリスク増大、および小児期の大豆の摂取は乳癌リスクを減少させる。それはこれらの出生前および出生後の食事の変更が順番に人生の後半で乳がんのリスクを変更することを乳腺の永続的な形態変化を誘導すると考えられている。これらの形態学的変化は、おそらくそのようなDNAメチル化の変化、ヒストンし、遺伝子の転写に影響を与えるmiRNAの発現などのエピジェネティックな変更を、反映している。この記事では、乳腺の形態の変化がラットで乳腺がんのリスクを予測する方法について説明します。我々のプロトコルは、特に細かく分析し、除去ラット腹部乳腺を、どのように乳腺全体のマウントを準備する方法について説明します。また、3つのエンドポイント（終端蕾の数、上皮伸長と分化）することと乳腺癌を発症するリスクを予測するためにデータを使用するに応じて乳腺の形態を分析する方法について説明します。

Protocol

1。腹部乳腺の除去と全山の準備

1. IACUCガイドラインに従って動物を安楽死させる。表面の板の上に針、またはテープの足でその足から背中に動物を固定し、エタノール（EtOH）でぬれた皮膚を拭いてください。皮膚を鉗子で少し持ち上げて、鋭いはさみが首に向かってペア＃5の乳首とカットの間に始まる皮膚に正中切開を行うことで。後脚に向かって正中線からの反転Yの切開を行います。胸部乳腺を収集することもある場合は、＃2乳首前足に向かってペア間の正中線からもYの切開を行います。
2. 腹部の第4乳腺を公開するために逆Yの切開の片側にハサミで開いている肌を細かく分析、乳腺、皮膚に添付されています。完全に腺を露出させる、表面の基板への針で皮膚をピン。一度に片側と腺を働く。
3. 近くに乳頭に近位領域から開始し、動物の背骨に向かって腺の遠位端に向かって作業を、鋭いはさみおよび/またはメスを使ってどちらかの皮膚からフリー乳腺を解剖。 （これは特に高齢ラットでは、数分かかる場合があります。）
4. すぐに適切にラベルをガラススライド（"ダイヤモンドのペン"適切な永続的なマーカーのペンと/またはを使用する）に分離された腺を広げ、そしてその場で元のサイズと形状に慎重に対応する腺を広げる。スライドガラスは、腺よりも大きい必要があります。スライドに腺を拡散した後、腺がスライド上に付着し、それを乾燥させないように、それはしばらくの間、テーブルの上に座ってみましょう。
5. カルノア固定液（75％氷酢酸、25％の無水エタノールを=エタノール）を含むjarファイルにスライドを入れ、それが2日以上のためのドラフト内で室温（RT）に固定させる。スライドはまた時間のより長い期間のための固定液にしておくことができます。
6. 室温で1時間、70％EtOH中でスライドを洗浄します。
7. 室温で30分間蒸留水ですすいでください。
8. スライドの裏面を見て）、（あなたがリンパ節が通過染色されていることが表示されるまで2日間以上）*を染色カルミネ明礬で染色。
9. - > 95％ - > 100％70％：エタノール、それぞれの1時間の増大シリーズで洗ってください。無水EtOHで最後の洗浄の後、キシレンで腺を置く。少なくとも2日間室温でドラフトに座ってみましょう。この最後のステップでは、乳房脂肪パッドの乳腺の意味の脱脂をクリアし、透明性のそれに続く増加しています。 fattier腺はより長いクリア時間が必要な場合があります。
10. このようなPermountとしてマウントメディアを、使用してカバースリップをマウントします。実体顕微鏡下で観察する前に（数日）もスライド乾かします。
    *カルミネ明礬は染色：
    
    場所1 500 mLの蒸留水と20分間沸騰のgカルミン（シグマC1022）と2.5gの硫酸アルミニウムカリウム（シグマA7167）。水で500 mLに、最終的な音量を調整します。フィルタリングと冷蔵。ソリューションは、数ヶ月のために使用することができます。色が弱くなったときに捨ててください。

2。乳腺全山のモルフォロジーの解析

乳腺の全体のマウントの形態は、以下のエンドポイントと乳癌リスクとの相関結果に基づいて分析されます。

1. 生後21日で、乳腺のホールマウント（思春期前の年齢）：
   • 上皮成長：
     • 定規を用いて測定した乳首から上皮木の端（単位：mm）までの距離、
   • 悪性転換の可能性：
     • TEBsの数（末端の芽）、光学顕微鏡下で数えた。 TEBsは乳腺上皮ツリーの先端に位置する最大の球根状の構造であり、
   • 分化：
     • AB1（肺芽）スコア（0-5）。歯槽芽が上皮に分散されています。
     • AB2スコア（0-5）
   
   ホールズのマウントは、光学顕微鏡下で採点されます。 AB1およびAB2からスコアの値は、最終分化のスコアに追加されています。
2. 乳腺は、ホールマウントPND 50（後の思春期の年齢）で収集：
   • 上皮成長：
     • リンパ節から上皮木の端（単位：mm）までの距離は、定規を用いて測定。
     • 上皮ツリーの先端からの脂肪パッドの端までの距離は、定規を用いて測定。
   • 悪性転換の可能性：
     • 光学顕微鏡下でカウントTEBsの数、
   • 分化：
     • AB1スコア（0-5）
     • AB2スコア（0-5）
     • 小葉のスコア（0-5）
   
   ホールズのマウントは、光学顕微鏡下で採点されます。差別化は、2つの方法で評価することになります。最初に、AB1、AB2および小葉からスコアの値は、最終分化のスコアに追加されています。さらに、小葉のスコアとAB1 + AB2のスコアとの比率が計算されます。 ABSは小葉に分化する、と小葉とABSとの間の比率が高いほど、より分化腺があります。

3。触診とラットと乳腺の形態との相関性の乳腺腫瘍の測定

1. この手順を開始するには、頭の後ろで人差し指と反対側の腋窩の下に親指と中指で、戻って上の手のひらで全身を把握し、ラットを保持する。それは、その後部の上に横たわっているように、ラットを回し、任意の乳腺腫瘍を検出するために触診、触知腫瘍が"塊"のように感じるはず。
2. 次の幅、長さ、および腫瘍の高さを測定するためにキャリパーを使用。楕円の式を使用して腫瘍体積を計算する、ボリューム=1/6πabc、'A'=幅、'B'=長さ、および'c'=高さ。
3. 手動で週単位でノートブックの腫瘍の位置とサイズを記録。このデータは、後でスプレッドシートに転送されます。

4。代表的な結果

乳腺脂肪体とwholemountにその処理を慎重に解剖は乳腺の発達状態の評価が可能になります。各ステップが正しく完了すると、全体の乳腺上皮ツリーは、明らかに脂肪パッド内に表示されており、これはTEBsと肺芽や小葉の密度の計算の数を容易に決定することができます。準備wholemountsの失策は、全体の脂肪パッド、不十分な固定、および不十分なクリアを解明するため、障害が含まれる場合があります。

乳腺の形態の評価は、乳腺腫瘍（TEBs）、上皮構造（歯槽の芽と小葉）の分化の程度、および成長の尺度（管伸長）を生じさせることができる構造の現在の数に関する情報を提供します。後者は、上皮の遠位端に配置されて、同様にTEBsに、彼らはTEBsより小さく、悪性腫瘍を生じさせることはありません。それは、ターミナルの端にTEBsを分離することが重要です。ターミナルの端は、上皮ツリー内で見られている。

図1：よく準備乳腺全体のマウントの代表的な結果は、腺のすべてのコンポーネントが適切に解剖されており、カルミン染色は最適です。

図2：不十分な準備乳腺全体のマウントの代表的な結果は腺が正しく適切に引き伸ばされていないと脱脂が完全に発生していない、（腺の先端部分が欠落している）解剖されています。

Discussion

乳腺の形態学的エンドポイントおよび上皮木の成長の評価は、初期の生活食事の操作、または子宮内あるいは思春期前のホルモン環境に変化させる他の操作は、後で乳癌のリスクを変更するかどうかを予測するために使用することができます。ヒトの乳がんは、ラットにおけるTEBsに似て乳腺構造（端子乳管小葉単位、TDLUs）で開始されるため、この手法は乳癌リスクに影響を与える初期生活の暴露の可能性を決定するために使用することができます。さらに、女性に高いマンモグラフィ密度は4〜6倍に乳癌のリスクを増加し、乳腺上皮木の成長の評価は、マンモグラフィ濃度とこの密度を下げる要因を決定する要因を特定するために使用することができます。この情報を取得するには、乳腺が完全に、解剖し適切にそのすべてのコンポーネントは、顕微鏡下で可視化できるように、スライドガラス上に引き伸ばすことがあります。さらに、適切なカルミン染色とキシレンに脱脂は、乳癌のリスク評価に適している全体のマウントを提供します。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glacial acetic acid	Electron Microscopy Sciences	AX0073-9	Carnoy’s Fixative
Absolute ethanol	The Waner-Graham Co.	64-17-5	Carnoy’s Fixative
Carmine	Sigma-Aldrich	C1022	Carmine solution
Aluminum potassium sulfate	Sigma-Aldrich	A7167	Carmine solution