Summary
Il nostro protocollo descrive come sezionare la ghiandola mammaria di ratto addominale e come preparare monta ghiandola mammaria intero. Descrive anche come analizzare la morfologia della ghiandola mammaria utilizzando tre end-point (numero di gemme fine terminale, allungamento epiteliali e la differenziazione) e di utilizzare questi risultati per predire il rischio di cancro mammario nei ratti che sono stati esposti a modificazioni dietetiche
Abstract
Studi in modelli di roditori di spettacolo cancro al seno che l'esposizione a fattori dietetici / ormonali durante il periodo in utero e puberale, quando la ghiandola mammaria subisce modellazione estesa e ri-modellazione, alterare la suscettibilità ai tumori mammari cancerogeno indotto. Risultati simili sono stati descritti negli esseri umani: per esempio, alto peso alla nascita aumenta poi il rischio di sviluppare il cancro al seno, e assunzione di soia durante l'infanzia si riduce il rischio di cancro al seno. Si pensa che queste modifiche prenatali e postnatali alimentari inducono persistenti cambiamenti morfologici nella ghiandola mammaria, che a loro volta modificano il rischio di cancro al seno nel corso della vita. Questi cambiamenti morfologici probabilmente riflettono modifiche epigenetiche, quali i cambiamenti nella metilazione del DNA, istoni e l'espressione miRNA che poi influenzano la trascrizione del gene. In questo articolo viene descritto come i cambiamenti nella morfologia della ghiandola mammaria può predire il rischio di cancro mammario nei ratti. Il nostro protocollo descrive specificatamente come sezionare e rimuovere la ghiandola mammaria di ratto addominale e come preparare i supporti ghiandola mammaria intero. Descrive anche come analizzare la morfologia della ghiandola mammaria in base a tre end-point (numero di gemme fine terminale, allungamento epiteliali e la differenziazione) e di utilizzare i dati per predire il rischio di sviluppare il cancro mammario.
Protocol
1. La rimozione della ghiandola mammaria e addominale Preparazione di un monte intero
- Eutanasia degli animali secondo le linee guida IACUC. Perno l'animale al suo ritorno da gambe con aghi o nastro le gambe sul bordo della superficie, e pulire la pelle umida con etanolo (EtOH). Sollevare la pelle un po 'con una pinza e con forbici affilate fare una incisione mediana nella pelle di partenza tra la coppia # 5 capezzoli e tagliare verso il collo. Fare un'incisione a Y rovesciata dalla linea mediana verso le zampe posteriori. Se toracica ghiandole mammarie sono da raccogliere, fare anche un'incisione Y dalla linea mediana tra la coppia # 2 capezzoli verso le zampe anteriori.
- Sezionare la pelle aperto con le forbici su un lato l'incisione a Y rovesciata per esporre la ghiandola mammaria addominale # 4, le ghiandole mammarie sono attaccati alla pelle. Perno la pelle con aghi sulla tavola di superficie, per esporre completamente la ghiandola. Lavoro da un lato e la ghiandola al momento.
- Sezionare la ghiandola mammaria libero dalla pelle usando forbici affilate e / o un bisturi, a partire dalla zona prossimale vicino al capezzolo e di lavoro verso la fine distale della ghiandola verso la colonna vertebrale dell'animale. (Questo può richiedere alcuni minuti, specialmente in un ratto vecchio.)
- Immediatamente diffondere la ghiandola staccata su un vetrino adeguatamente etichettati (con una penna adeguata pennarello indelebile e / o 'una penna di diamante'), e diffondere la ghiandola attentamente corrispondente alla sua dimensione originale e la forma in situ. Il vetrino deve essere più grande della ghiandola. Dopo la diffusione della ghiandola sul vetrino, lasciare riposare sul tavolo per un po ', in modo che la ghiandola bastoni sul vetrino, ma non lasciate asciugare.
- Mettere il vetrino in un vaso contenente fissativo di Carnoy (75% di acido acetico glaciale, 25% di etanolo assoluto = EtOH), lasciare che si fissa a temperatura ambiente (RT) nella cappa per 2 giorni o più. Diapositive può anche essere lasciato in fissativo per un periodo di tempo più lungo.
- Lavare i vetrini in 70% EtOH per 1 ora a temperatura ambiente.
- Lavare in acqua distillata per 30 minuti a RT.
- Colorare con Alum Carmine macchia *) per 2 giorni o più (fino a vedere che i linfonodi hanno macchiato attraverso; guardare il retro della diapositiva).
- Lavare in serie crescente di EtOH, 1 ora ciascuno: 70% -> 95% -> 100%. Dopo l'ultimo lavaggio in assoluto EtOH mettere le ghiandole in xilene. Lasciate riposare nella cappa in RT almeno per 2 giorni. Questo ultimo passo è di compensazione del delipidation ghiandola mammaria significato del cuscinetto di grasso mammaria, e conseguente aumento della trasparenza. La più grassa la ghiandola è il più lungo tempo di decolorazione è richiesto.
- Montare con cover-scivola con un altro supporto di montaggio, come Permount. Lasciate asciugare bene le diapositive (alcuni giorni) prima di osservare al microscopio stereo.
* Allume Carmine Stain:
Mettere 1 g di carminio (Sigma C1022) e 2,5 g di potassio solfato di alluminio (Sigma A7167) in 500 ml di acqua distillata e fate bollire per 20 min. Regolare il volume finale a 500 ml con acqua. Filtrare e conservare in frigorifero. Soluzione può essere utilizzata per diversi mesi. Scartare quando il colore diventa debole.
2. Analisi di Monte ghiandola mammaria Morfologia Whole
Tutta la ghiandola mammaria monta morfologia viene analizzata secondo i seguenti end-point ed i risultati correlati con il rischio di cancro mammario.
- Ghiandola mammaria intera-mount a PND 21 (pre-puberale età):
- Crescita epiteliale:
- Distanza dal capezzolo al fine di albero epiteliale (in millimetri), misurata con un righello
- Potenziale di trasformazione maligna:
- Numero di TEBS (gemme fine terminale), contate al microscopio ottico. TEBS sono le più grandi strutture bulbose trova solo al termine distale della struttura epiteliali mammarie
- Differenziazione:
- AB1 (alveolare gemma) punteggio (0-5). Gemme alveolare sono diffuse in tutta l'epitelio.
- AB2 punteggio (0-5)
Monti interi sono segnati con un microscopio ottico. I valori di punteggio da AB1 e AB2 sono aggiunti per un punteggio finale di differenziazione. - Crescita epiteliale:
- Ghiandola mammaria intera-mount raccolti in PND 50 (post-puberale età):
- Crescita epiteliale:
- Distanza dal linfonodo alla fine di albero epiteliale (in millimetri), misurata con un righello.
- Distanza dalla punta dell'albero epiteliale alla fine del cuscinetto adiposo, misurata con un righello.
- Potenziale di trasformazione maligna:
- Numero di TEBS, contate al microscopio ottico
- Differenziazione:
- AB1 punteggio (0-5)
- AB2 punteggio (0-5)
- Lobuli punteggio (0-5)
Monti interi sono segnati con un microscopio ottico. La differenziazione sarà valuta in due modi. In primo luogo, i valori di punteggio da AB1, AB2 e lobuli sono aggiunti per un punteggio finale di differenziazione. Inoltre, il rapporto tra il punteggio lobuli e AB1 + AB2 punteggio verrà calcolato. AB differenziare a lobuli, e maggiore è il rapporto tra lobuli e AB, il più differenziato è la ghiandola. - Crescita epiteliale:
3. Palpazione e misurazione tumore mammario nei ratti e Correlazione di Morfologia ghiandola mammaria
- Per iniziare questa procedura, tenere il ratto afferrando tutto il corpo con il palmo sul dorso, con l'indice dietro la testa e il pollice e secondo dito sotto l'ascella opposta. Girare il ratto quindi è sdraiato sul suo posteriore, e palpare di rilevare eventuali tumori mammari, tumori palpabili dovrebbe sentire come un "grumo".
- Avanti utilizzare un calibro per misurare la larghezza, la lunghezza e l'altezza del tumore. Calcolare il volume del tumore utilizzando la formula dell'ellissoide, Volume = 1/6πabc, dove 'a' = larghezza, lunghezza = 'b', e 'c' = altezza.
- Registrare manualmente la posizione e le dimensioni del tumore in un quaderno su base settimanale. Questi dati saranno trasferiti a un foglio di calcolo più tardi.
4. Rappresentante Risultati
Dissezione attenta del cuscinetto di grasso mammaria e la sua elaborazione per wholemount permetterà accertamento del suo stato di sviluppo della ghiandola mammaria. Quando ogni passo è fatto correttamente, l'intero albero epiteliali mammarie è chiaramente visibile all'interno del cuscinetto adiposo, e questo permette una facile determinazione del numero di TEBS e calcolo della densità di gemme alveolare e lobuli. Passi falsi in wholemounts preparazione possono includere il mancato sezionare il pad tutto grasso, fissaggio insufficiente, inadeguata e di compensazione.
Valutazione della morfologia della ghiandola mammaria fornirà informazioni sul numero di presenti strutture che possono dare origine a tumori mammari (TEBS), grado di differenziazione delle strutture epiteliali (gemme alveolare e lobuli), e la misura della crescita (allungamento duttale). È importante separare TEBS a fini terminale, la seconda si trova alla fine distale dell'epitelio, analogamente a TEBS, ma sono più piccoli TEBS e non danno luogo a tumori maligni. Le estremità terminali sono visto anche all'interno della struttura epiteliale.
Figura 1:. Rappresentante del risultato ben preparati montare tutto ghiandola mammaria Tutti i componenti della ghiandola sono stati adeguatamente sezionato e colorazione carminio è ottimale.
Figura 2:. Rappresentante risultato di un monte mal preparato tutto ghiandola mammaria La ghiandola è stato correttamente sezionato (la porzione distale della ghiandola è mancante), non è stato adeguatamente allungata e delipidation non è completamente avvenuta.
Discussion
Valutazione della ghiandola mammaria morfologiche end-point e la crescita dell'albero epiteliale può essere usato per prevedere se manipolazioni primi anni di vita alimentari, o altre manipolazioni che alterano in ambiente utero o in età prepuberale ormonali, modificare il rischio di cancro mammario in seguito. Dato che il cancro al seno negli esseri umani è iniziato in strutture mammaria (unità terminali duttale lobulare, TDLUs) simile a TEBS nei ratti, questa tecnica può essere usata per determinare il potenziale di esposizioni primi anni di vita di influenzare il rischio di cancro al seno. Inoltre, nelle donne ad alta densità mammografica aumenta il rischio di cancro al seno di 4-6 volte, e la valutazione della crescita di alberi epiteliali mammarie possono essere utilizzate per identificare i fattori che determinano la densità mammografica e fattori che riducono la densità. Per ottenere queste informazioni, ghiandola mammaria dovrebbe essere completamente sezionato, opportunamente allungato su un vetrino in modo che tutti i suoi componenti possono essere visualizzati al microscopio. Inoltre, proprio colorazione carminio e delipidation in xilene fornirà supporti intero che sono adatti per la valutazione del rischio di cancro mammario.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
NSC (U54 CA00100970), NCI (1 CA150040 R03-01), ACS (116602-PF-09-018-01-CNE)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glacial acetic acid | Electron Microscopy Sciences | AX0073-9 | Carnoy’s Fixative |
| Absolute ethanol | The Waner-Graham Co. | 64-17-5 | Carnoy’s Fixative |
| Carmine | Sigma-Aldrich | C1022 | Carmine solution |
| Aluminum potassium sulfate | Sigma-Aldrich | A7167 | Carmine solution |
References
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