Summary
El protocolo describe cómo diseccionar la rata de las glándulas mamarias abdominales y la forma de preparar montajes de la glándula mamaria completa. También se describe la forma de analizar la morfología de la glándula mamaria con tres puntos finales (número de yemas terminales de final, la elongación y la diferenciación del epitelio) y utilizar estos resultados para predecir el riesgo de cáncer de mama en ratas que fueron expuestas a modificaciones en la dieta
Abstract
Los estudios en modelos de roedores de cáncer de mama muestran que la exposición a factores de la dieta / hormonal durante el período en el útero y la pubertad, cuando la glándula mamaria sufre de modelado amplia y re-modelado, alterar la susceptibilidad a carcinógenos inducida por tumores mamarios. Hallazgos similares han sido descritos en los seres humanos: por ejemplo, peso al nacer aumenta más alto riesgo de desarrollar cáncer de mama y la ingesta de soja durante la infancia reduce el riesgo de cáncer de mama. Se cree que estas modificaciones en la dieta prenatal y postnatal persistente inducir cambios morfológicos en la glándula mamaria que, a su vez modificar el riesgo de cáncer de mama en el futuro. Estos cambios morfológicos probablemente se deben a modificaciones epigenéticas, como los cambios en la metilación del ADN, histonas y la expresión de miRNA que luego afectan la transcripción de genes. En este artículo se describe cómo los cambios en la morfología de la glándula mamaria puede predecir el riesgo de cáncer de mama en ratas. El protocolo se describe específicamente cómo analizar y eliminar las ratas de la glándula mamaria abdominal y la forma de preparar montajes de la glándula mamaria completa. También se describe la forma de analizar la morfología de la glándula mamaria de acuerdo con tres puntos finales (número de yemas terminales de final, la elongación y la diferenciación del epitelio) y utilizar los datos para predecir el riesgo de desarrollar cáncer mamario.
Protocol
1. Extirpación de la glándula mamaria abdominal y Preparación de un monte se
- La eutanasia de los animales de acuerdo con las directrices IACUC. Pin del animal en la espalda de sus piernas con las agujas, o la cinta de las piernas sobre el tablero de la superficie, y limpie la piel húmeda con etanol (EtOH). Levante la piel un poco con pinzas y con unas tijeras afiladas hacer una incisión en la piel partida entre los dos pezones # 5 y cortar hacia el cuello. Hacer una incisión en Y invertida de la línea media hacia las patas traseras. Si torácica glándulas mamarias son también para ser recogidos, hacer también una incisión Y de la línea media entre el par # 2 pezones hacia las patas delanteras.
- Disección de la piel con una tijera abierta en un lado de la incisión en Y invertida para exponer la glándula mamaria abdominal # 4; las glándulas mamarias se adhiere a la piel. Pin de la piel con agujas en el tablero de la superficie, para exponer completamente la glándula. El trabajo de un lado y de la glándula en el momento.
- Disecar la glándula mamaria, libre de la piel, ya sea usando unas tijeras afiladas y / o un bisturí, a partir de la zona proximal cerca del pezón y de trabajo hacia el extremo distal de la glándula hacia la espina dorsal del animal. (Esto puede tardar varios minutos, especialmente en una rata más.)
- Inmediatamente se extendió la glándula separado en un portaobjetos de vidrio debidamente etiquetados (usar un lápiz adecuado marcador permanente y / o "una pluma de diamantes"), y la propagación de la glándula cuidado correspondiente a su tamaño y forma original in situ. La lámina de vidrio debe ser mayor que la glándula. Después de la difusión de la glándula en la diapositiva, dejar que repose en la mesa por un rato, para que la glándula se pega en la diapositiva, pero no deje que se seque.
- Poner la diapositiva en un frasco que contiene el fijador de Carnoy (75% de ácido acético glacial, 25% de etanol absoluto = EtOH), dejar que se fija a la temperatura ambiente (TA) en la campana extractora de humos de 2 días o más. Diapositivas también se pueden dejar en el fijador durante un largo periodo de tiempo.
- Se lavan los portas en un 70% EtOH durante 1 hora a temperatura ambiente.
- Enjuague con agua destilada durante 30 min a temperatura ambiente.
- Mancha en Alum Carmine mancha *) durante 2 días o más (hasta que vea que los ganglios linfáticos se han manchado a través, buscar en la parte posterior de la diapositiva).
- De lavado en serie creciente de EtOH, 1 hora en cada uno: 70% -> 95% -> 100%. Después del último lavado en EtOH absoluto puesto que las glándulas en xileno. Deje reposar en la campana extractora de humos en RT por lo menos durante 2 días. Este último paso es la limpieza de la delipidación glándula mamaria significado de la almohadilla de grasa mamaria, y el consiguiente aumento de la transparencia. El más grasa de la glándula es el mayor tiempo de limpieza es necesaria.
- Montar con cubreobjetos utilizando un medio de montaje, como Permount. Deje secar bien las diapositivas (varios días) antes de observar bajo un microscopio estereoscópico.
* Alum Carmine manchas:
Coloque 1 g de carmín (Sigma C1022) y 2,5 g de aluminio sulfato de potasio (Sigma A7167) en 500 ml de agua destilada y hervir durante 20 minutos. Ajustar el volumen final de 500 ml con agua. Filtro y el refrigerador. Solución puede ser utilizada por varios meses. Desechar cuando el color se debilita.
2. Análisis de la morfología de la glándula mamaria monte entero
Toda la glándula mamaria se monta la morfología se analiza de acuerdo a los siguientes criterios de valoración y los resultados correlacionados con el riesgo de cáncer de mama.
- Glándula mamaria todo el montaje en el PND 21 (pre-púberes edad):
- Crecimiento epitelial:
- Distancia desde el pezón hasta el final del árbol epiteliales (en milímetros), medido con una regla
- Potencial de transformación maligna:
- Número de TEBS (yemas terminales final), se contaron bajo un microscopio de luz. TEBS son las mayores estructuras de bulbo situado a tan sólo en el extremo distal del árbol epiteliales mamarias
- Diferenciación:
- AB1 (alveolar yema) puntuación (0-5). Brotes alveolares se propagan a través del epitelio.
- AB2 puntuación (0-5)
Montajes conjuntos se anotó con un microscopio óptico. El valor de la puntuación de AB1 y AB2 se añaden a una puntuación final de la diferenciación. - Crecimiento epitelial:
- Glándula mamaria todo el montaje recogidos en PND 50 (post-puberal edad):
- Crecimiento epitelial:
- Distancia desde el ganglio linfático hasta el final del árbol epiteliales (en milímetros), medido con una regla.
- Distancia desde la punta del árbol del epitelio hasta el final de la almohadilla de grasa, medido con una regla.
- Potencial de transformación maligna:
- Número de TEBS, contados bajo un microscopio de luz
- Diferenciación:
- AB1 puntuación (0-5)
- AB2 puntuación (0-5)
- Lóbulos puntuación (0-5)
Montajes conjuntos se anotó con un microscopio óptico. La diferenciación se evalúa de dos maneras. En primer lugar, las puntuaciones de AB1, AB2 y lobulillos se añaden a una puntuación final de la diferenciación. Además, la relación entre la puntuación de los lobulillos y los resultados AB1 + AB2 será calculada. ABs diferenciar a los lóbulos, y la mayor es la relación entre los lobulillos y los abdominales, el más diferenciado de la glándula. - Crecimiento epitelial:
3. Palpación y valoración del tumor de mama en ratas y la correlación con morfología de la glándula mamaria
- Para iniciar este procedimiento, mantenga la rata, sujetando el cuerpo con la palma de la mano sobre la espalda, con el dedo índice detrás de la cabeza y el pulgar y el segundo bajo la axila opuesta. A su vez la rata por lo que está mintiendo en su posterior, y palpar para detectar tumores de mama, los tumores palpables debe sentirse como un "bulto".
- Luego, use una pinza para medir la anchura, longitud y altura del tumor. Calcular el volumen del tumor utilizando la fórmula del elipsoide de volumen, = 1/6πabc, donde 'a' = anchura, la longitud 'b' = y 'c' = altura.
- Manual de registro de la ubicación y el tamaño del tumor en un cuaderno sobre una base semanal. Estos datos serán transferidos a una hoja de cálculo más tarde.
4. Resultados representante
Disección cuidadosa de la almohadilla de grasa mamaria y su procesamiento para wholemount permitirá evaluar el estado de desarrollo de la glándula mamaria. Cuando cada paso se realiza correctamente, el conjunto de árboles epiteliales mamarias es claramente visible en la almohadilla de grasa, lo que permite determinar fácilmente el número de TEBS y el cálculo de la densidad de brotes alveolares y lobulillos. Errores en la preparación de wholemounts pueden incluir falta de analizar toda la almohadilla de grasa, la fijación insuficiente, y la limpieza inadecuada.
Evaluación de la morfología de la glándula mamaria proporcionará información sobre el número de las actuales estructuras que pueden dar lugar a tumores de mama (TEBS), grado de diferenciación de las estructuras epiteliales (brotes alveolares y lóbulos), y la medida del crecimiento (alargamiento ductal). Es importante separar TEBS a los fines de terminales, este último se encuentra en el extremo distal del epitelio, de manera similar a TEBS, pero son más pequeños que TEBS y no dan lugar a tumores malignos. Extremos terminales también se ven en el árbol del epitelio.
Figura 1:. Representante de resultado bien preparado montar toda la glándula mamaria Todos los componentes de la glándula han sido debidamente disecados y manchas de carmín es óptima.
Figura 2:. Representante resultado de un mal preparados montar toda la glándula mamaria La glándula ha sido debidamente disecada (la porción distal de la glándula no se encuentra), no se ha estirado bien y delipidación no se ha producido por completo.
Discussion
Evaluación de la glándula mamaria morfológicas puntos finales y el crecimiento del árbol epiteliales se puede utilizar para predecir si las manipulaciones tempranas de la vida la dieta, u otras manipulaciones que alteran el medio ambiente en el útero o prepuberal hormonal, modificar el riesgo de cáncer de mama más tarde. Dado que el cáncer de mama en humanos se inicia en las estructuras mamarias (unidades de terminal ductal lobular, TDLUs), similar a TEBS en ratas, esta técnica se puede utilizar para determinar el potencial de las exposiciones de la primera infancia para afectar el riesgo de cáncer de mama. Además, en las mujeres la densidad mamográfica de alta aumenta el riesgo de cáncer de mama por 4-6 veces, y la evaluación del crecimiento de árboles epiteliales mamarias se puede utilizar para identificar los factores que determinan la densidad mamográfica y los factores que reducen la densidad. Para obtener esta información, la glándula mamaria debe estar completamente disecados, bien tirante en un portaobjetos de vidrio de modo que todos sus componentes pueden ser visualizados con un microscopio. Además, adecuada coloración carmín y delipidación en xileno proporcionará toda monta que son adecuados para la evaluación del riesgo de cáncer de mama.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Instituto Nacional del Cáncer (U54 CA00100970), Instituto Nacional del Cáncer (1 R03 CA150040-01), ACS (116602-PF-09-018-01-CNE)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glacial acetic acid | Electron Microscopy Sciences | AX0073-9 | Carnoy’s Fixative |
| Absolute ethanol | The Waner-Graham Co. | 64-17-5 | Carnoy’s Fixative |
| Carmine | Sigma-Aldrich | C1022 | Carmine solution |
| Aluminum potassium sulfate | Sigma-Aldrich | A7167 | Carmine solution |
References
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