Summary
Unser Protokoll beschreibt, wie die Ratte abdominale Brustdrüse sezieren und wie Brustdrüse ganzen mounts vorzubereiten. Es beschreibt auch, wie Brustdrüse Morphologie mit drei Endpunkten (Anzahl der terminalen Ende Knospen-, Epithel-Dehnung und Differenzierung) zu analysieren und diese Ergebnisse nutzen, um Brustkrebs Risiko bei Ratten, die zu Änderungen der Ernährung ausgesetzt waren vorhersagen
Abstract
Studien in Tiermodellen von Brustkrebs zeigen, dass die Forderungen der Nahrung / hormonelle Faktoren während der in utero und pubertären Zeiten, in denen der Brustdrüse umfangreiche Modellierungs-und Re-Modellierung erfährt, verändern die Anfälligkeit für karzinogen-induzierten Mammatumoren. Ähnliche Ergebnisse wurden beim Menschen beschrieben worden: zum Beispiel erhöht hohen Geburtsgewicht später Risiko an Brustkrebs zu erkranken, und der Aufnahme von Soja in der Kindheit verringert Brustkrebs-Risiko. Es wird vermutet, dass diese prä-und postnatalen Änderungen der Ernährung anhaltenden morphologischen Veränderungen in der Brustdrüse, die wiederum zu ändern Brustkrebsrisiko im späteren Leben zu induzieren. Diese morphologischen Veränderungen wahrscheinlich reflektieren epigenetische Modifikationen, wie zum Beispiel Änderungen in der DNA-Methylierung, Histon-und miRNA-Expression, die dann Auswirkungen auf Gen-Transkription. In diesem Artikel beschreiben wir, wie sich Änderungen in Brustdrüse Morphologie Brustkrebs Risiko bei Ratten vorherzusagen. Unser Protokoll ausdrücklich beschreibt, wie zu sezieren und entfernen Sie die Ratte abdominale Brustdrüse und wie Brustdrüse ganzen mounts vorzubereiten. Es beschreibt auch, wie Brustdrüse Morphologie nach drei Endpunkte (Anzahl der terminalen Ende Knospen-, Epithel-Dehnung und Differenzierung) und die Daten verwenden, um Risiko der Entwicklung von Brustkrebs vorhersagen zu analysieren.
Protocol
1. Die Entfernung der Abdominal Brustdrüse und Vorbereiten einer Whole Berg
- Euthanize das Tier nach dem IACUC Richtlinien. Pin das Tier auf seinem Rücken aus den Beinen mit Nadeln oder Klebeband die Beine auf die Oberfläche Bord, und wischen Sie die Haut nass mit Ethanol (EtOH). Heben Sie die Haut ein wenig mit einer Pinzette und mit einer scharfen Schere einen Medianschnitt in die Haut, die zwischen dem Paar Nr. 5 Brustwarzen und schneiden gegen den Hals. Machen Sie ein umgekehrtes Y Einschnitt von der Mittellinie in Richtung der Hinterbeine. Wenn Thorax Milchdrüsen auch gesammelt werden sollen, machen auch ein Y Einschnitt von der Mittellinie zwischen den beiden # 2 Nippel auf die Vorderbeine.
- Präparieren Sie die Haut mit einer Schere auf einer Seite offen der invertierten Y Schnitt mit der Bauchwand Nr. 4 Brustdrüse aussetzen, die Milchdrüsen sind auf der Haut angebracht. Pin der Haut mit Nadeln auf der Oberfläche Bord, vollständig freizulegen der Drüse. Die Arbeit der einen Seite und Drüse an der Zeit.
- Präparieren Sie die Brustdrüse frei von der Haut entweder mit einer scharfen Schere und / oder ein Skalpell, ausgehend von der proximalen Bereich in der Nähe der Brustwarze und Arbeiten in Richtung des distalen Endes der Drüse in Richtung der Wirbelsäule des Tieres. (Dies kann einige Minuten dauern, vor allem in einer älteren Ratte.)
- Sofort verbreitete das freistehende Drüse auf eine entsprechend beschriftete Objektträger aus Glas (mit einem richtigen Filzstift Stift und / oder "ein Diamant pen"), und die Ausbreitung der Drüse sorgfältig entsprechend seiner ursprünglichen Größe und Form in situ. Die Glasplatte muss größer sein als die Drüse. Nach Ausbreitung der Drüse auf die Folie, lassen Sie es auf den Tisch zu setzen für eine Weile, so dass die Drüse auf der Folie klebt, aber nicht trocknen lassen.
- Legen Sie die Folie in ein Gefäß mit Carnoy Fixativ (75% Eisessig, 25% absolutem Ethanol = EtOH), lassen Sie es bei Raumtemperatur (RT) in den Abzug, der für 2 Tage oder länger fest zu bekommen. Dias können auch in das Fixiermittel für einen längeren Zeitraum belassen werden.
- Waschen Sie die Slides in 70% EtOH für 1 Stunde bei RT.
- Spülen in destilliertem Wasser für 30 min bei RT.
- Stain in Carmine Alum Fleck *) für 2 Tage oder länger (bis Sie sehen, dass die Lymphknoten durch gefärbt; Blick auf die Rückseite der Folie).
- Wash in zunehmenden Reihe von EtOH, 1 Stunde in jeder: 70% -> 95% -> 100%. Nach der letzten Waschung in absolutem EtOH stellen die Drüsen in Xylol. Lassen Sie sitzen in den Dunstabzug in RT mindestens für 2 Tage. Dieser letzte Schritt ist der Brustdrüse Bedeutung Delipidierung der Brustfettpolster Lichtung, und die anschließende Erhöhung der Transparenz. Die fetthaltiger der Drüse ist die längere Clearing Zeit benötigt wird.
- Berg mit Deckgläschen mit einer Montageplatte Medien, wie Permount. Lassen Sie die Folien gut trocknen (mehrere Tage), bevor die Beobachtung unter einem Stereomikroskop.
* Carmine Alum Stain:
Platz 1 g Karmin (Sigma C1022) und 2,5 g Aluminium-Kalium-Sulfat (Sigma A7167) in 500 ml destilliertem Wasser und kochen für 20 min. Passen Endvolumen von 500 mL mit Wasser. Filter und kalt stellen. Die Lösung kann für mehrere Monate eingesetzt werden. Verwerfen, wenn Farbe schwach wird.
2. Analyse der Brustdrüse Whole Mount Morphologie
Brustdrüse ganzen mounts Morphologie ist nach der folgenden Endpunkte und die Ergebnisse mit Brustkrebs Risiko korreliert analysiert.
- Brustdrüse ganzen Berg an PND 21 (präpubertären Alter):
- Epitheliale Wachstum:
- Entfernung von der Brustwarze bis zum Ende des epithelialen Baum (in Millimetern), gemessen mit einem Lineal
- Potenzial für eine maligne Transformation:
- Anzahl der TEBS (terminalen Ende Knospen), zählte unter einem Lichtmikroskop. TEBS sind die größten bauchige Strukturen nur am distalen Ende des Brustepithelzellen Baum entfernt
- Differenzierung:
- AB1 (alveoläre bud) Partitur (0-5). Alveolar Knospen sind über das Epithel ausbreiten.
- AB2 Score (0-5)
Ganze montiert sind unter einem Lichtmikroskop gezählt. Die Score-Werte von AB1 und AB2 sind für eine endgültige Differenzierung addiert. - Epitheliale Wachstum:
- Brustdrüse ganzen Berg an PND 50 (post-pubertären Alter) gesammelt:
- Epitheliale Wachstum:
- Entfernung der Lymphknoten bis zum Ende des epithelialen Baum (in Millimetern), gemessen mit einem Lineal.
- Entfernung von der Spitze der epithelialen Baum bis zum Ende der Fettpolster, gemessen mit einem Lineal.
- Potenzial für eine maligne Transformation:
- Anzahl der TEBS, unter einem Lichtmikroskop gezählt
- Differenzierung:
- AB1 Score (0-5)
- AB2 Score (0-5)
- Läppchen Score (0-5)
Ganze montiert sind unter einem Lichtmikroskop gezählt. Differenzierung wird in zweierlei Hinsicht beurteilt. Erstens sind die Score-Werte von AB1, AB2 und Läppchen für eine endgültige Differenzierung addiert. Darüber hinaus wird das Verhältnis zwischen Läppchen Partitur und AB1 + AB2 Score berechnet werden. ABs zu Läppchen zu unterscheiden, und je höher das Verhältnis zwischen Läppchen und ABS, je differenzierter die Drüse. - Epitheliale Wachstum:
3. Palpation und Brusttumor Measurement in Ratten und Korrelation zum Milchdrüse Morphologie
- Zu Beginn dieses Verfahren, halten die Ratte durch Ergreifen der ganze Körper mit der Handfläche über den Rücken, mit dem Zeigefinger hinter dem Kopf und dem Daumen und dem zweiten Finger unter das Gegenteil Achselhöhle. Schalten Sie die Ratte so dass es an seiner hinteren lügt, und tasten jede Brusttumoren zu entdecken; tastbaren Tumoren sollte wie ein "Klumpen" zu fühlen.
- Next mit einem Messschieber die Breite, Länge und Höhe des Tumors zu messen. Berechnen Sie das Volumen des Tumors mit dem Ellipsoid Formel, Volume = 1/6πabc, wo 'a' = Breite, 'b' = Länge und 'c' = Höhe.
- Manuelles Eintragen der Lage und Größe des Tumors in einem Notebook auf einer wöchentlichen Basis. Diese Daten werden in eine Tabelle übertragen später.
4. Repräsentative Ergebnisse
Eine sorgfältige Präparation des Brustfettpolster und ihre Verarbeitung zu wholemount wird die Abschätzung des Entwicklungsstandes der Brustdrüse. Wenn jeder Schritt richtig ausgeführt wird, ist die ganze Brustepithelzellen Baum deutlich sichtbar in der Fettpolster, und dies ermöglicht die einfache Bestimmung der Anzahl der TEBS und Berechnung der Dichte des alveolären Knospen und Läppchen. Fehltritte bei der Vorbereitung wholemounts können Fehler, die ganze Fettpolster, ungenügende Befestigung und unzureichende Clearing sezieren.
Beurteilung der Brustdrüse Morphologie gibt Auskunft über die Anzahl der vorhandenen Strukturen, die zu Mammatumoren (TEBS), Grad der Differenzierung der epithelialen Strukturen (alveoläre Knospen und Läppchen), und messen des Wachstums (duktales Dehnung) geben kann. Es ist wichtig, TEBS zur terminalen Enden zu trennen; die letzteren sind am distalen Ende des Epithels befindet sich, ähnlich wie bei TEBS, aber sie sind kleiner als TEBS und keinen Anlass zu bösartigen Tumoren. Terminalen Enden sind auch innerhalb der epithelialen Baum gesehen.
Abbildung 1:. Repräsentatives Ergebnis von gut vorbereitet Brustdrüse whole mount Alle Komponenten der Drüse wurden ordnungsgemäß zerlegt und Carmin-Färbung ist optimal.
Abbildung 2:. Repräsentatives Ergebnis einer schlecht vorbereiteten Brustdrüse whole mount Die Drüse wurde ordnungsgemäß zerlegt (den distalen Teil der Drüse fehlt), wurde nicht richtig gedehnt und Delipidierung noch nicht vollständig eingetreten ist.
Discussion
Beurteilung der Brustdrüse morphologischen Endpunkten und das Wachstum der epithelialen Baum kann verwendet werden, um vorherzusagen, ob eine frühe Leben diätetische Manipulationen oder sonstige Manipulationen, die in utero oder präpubertären hormonelle Umfeld verändern, modifizieren später Brustkrebs Risiko. Da Brustkrebs bei Menschen in Brust-Strukturen (terminale duktale lobuläre Einheiten, TDLUs) ähnlich TEBS bei Ratten ausgelöst wird, kann diese Technik verwendet, um das Potenzial des frühen Lebens Forderungen an das Brustkrebsrisiko beeinflussen zu bestimmen. Weitere, in den Frauen hohe mammographische Dichte erhöht das Risiko für Brustkrebs um 4-6 fache, und Beurteilung des Wachstums der Brustepithelzellen Baum kann verwendet werden, um Faktoren, die mammographische Dichte und Faktoren, die diese Dichte zu reduzieren bestimmen zu identifizieren. Um diese Informationen zu erhalten, sollte Brustdrüse voll zerlegt werden, ordnungsgemäß auf einem Glasträger, so dass alle seine Komponenten können unter dem Mikroskop sichtbar gestreckt. Darüber hinaus werden geeignete carmine Färbung und Delipidierung in Xylol liefern ganzen mounts, die sich für Brustkrebs Risikobewertung sind.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
NCI (U54 CA00100970), NCI (1 R03 CA150040-01), ACS (116602-PF-09-018 bis 01-CNE)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glacial acetic acid | Electron Microscopy Sciences | AX0073-9 | Carnoy’s Fixative |
| Absolute ethanol | The Waner-Graham Co. | 64-17-5 | Carnoy’s Fixative |
| Carmine | Sigma-Aldrich | C1022 | Carmine solution |
| Aluminum potassium sulfate | Sigma-Aldrich | A7167 | Carmine solution |
References
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