Summary
우리 프로토콜은 쥐 복부 유선을 해부하다 방법과 유선 전체 마운트를 준비하는 방법에 대해 설명합니다. 또한 세 최종 포인트 (터미널 최종 꽃봉오리의 번호, 상피 연신율과 차별화)을 사용하여 유선의 형태를 분석하고식이 수정에 노출된 쥐의 유방암 위험을 예측하는 이러한 결과를 사용하는 방법에 대해 설명합니다
Abstract
utero 및 pubertal 기간에 동안식이 / 호르몬 요인에 노출은 유선은 광범위한 모델링 및 다시 모델링을 거쳐 때 발암 물질 유발 내유 종양을 느끼기 쉬운 상태를 변경되는 유방암 쇼의 쥐 모델에서 연구. 비슷한 연구 결과는 인간에서 설명되었습니다 : 예를 들면, 높은 birthweight 유방암을 개발하고 이후 리스크 증가, 그리고 어린 시절 동안 간장의식이 섭취가 유방암 위험을 감소시킵니다. 그것은 이러한 태아와 출생 후의식이 수정이 차례로 나중에 유방암 위험을 수정할 것을 유선으로 영구 형태학의 변화를 유도 생각이다. 이러한 형태학의 변경 가능성이 같은 DNA의 methylation의 변화, histones하고 유전자 전사에 영향을 miRNA 표현으로 epigenetic 수정을 반영합니다. 이 문서에서는 유선의 형태에 변화가 쥐의 유방암 위험을 예측할 수있는 방법에 대해 설명합니다. 우리 프로토콜은 특별히 해부하다하고 제거 쥐의 복부 유선과 방법을 유선 전체 마운트를 준비하는 방법에 대해 설명합니다. 또한 세 엔드 포인트 (터미널 최종 꽃봉오리의 번호, 상피 연신율과 차별화)과 유방암을 개발의 위험을 예측하기 위해 데이터를 사용에 따라 유선의 형태를 분석하는 방법에 대해 설명합니다.
Protocol
1. 복부 유선의 제거 및 전체 마운트 준비
- IACUC 지침에 따라 동물을 안락사. 표면 보드에 바늘, 또는 테이프 다리의 다리로부터 뒷면에있는 동물을 핀, 그리고 에탄올 (EtOH)와 젖은 피부를 닦아냅니다. 피부 포셉와 약간을 들어 날카로운 가위가 목쪽으로 한 쌍의 # 5 젖꼭지 컷 사이에 시작하는 피부에 정중선 절개를 함께. 뒷다리쪽으로 정중선에서 거꾸로 Y 자 절개를합니다. 흉부 내유 분비가 수집하는 것도있다면, # 2 유두 앞 다리를 향해 쌍 사이의 정중선에서 또한 Y 자 절개를합니다.
- 피부가 복부 # 4 유선을 폭로하기 위해 거꾸로 Y 절개의 한쪽에 가위로 오픈 절개하다, 내유 분비는 피부에 붙어있다. 완전히 선을 노출, 표면 보드에 바늘로 피부를 핀. 한 번에 하나의 측면과 선 (腺)을 작동합니다.
- 가까운 유두로 근위 지역에서 시작과 동물의 척추쪽으로 선 (腺)의 말초 끝 부분 작업, 날카로운 가위 및 / 또는 메스를 사용 중 피부에서 무료로 유선을 해부하다. (이것은 특히 기존의 밀고로, 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다.)
- 즉시 적절하게 레이블이 붙은 유리 슬라이드 (적절한 영구 마커 펜 및 / 또는 '다이아몬드 펜'을 사용)로 분리 선 (腺)을 전파하고, 원래의 크기와 현장의 모양 신중하게 대응하는 선 (腺)을 전파. 유리 슬라이드는 선보다 더해야합니다. 슬라이드에 선 (腺)을 확산하면, 그것은 선 (腺)이 슬라이드에 막대기 있도록 잠시 동안 테이블에 앉아 보자,하지만 건조하게하지 않습니다.
- Carnoy의 정착액 (75 % 빙초산, 25 % 에탄올을 절대 EtOH =)가 들어있는 병에 덮개를 씌우고, 그것이 2 일 이상 연기 후드의 실내 온도 (RT)에 고정하자. 슬라이드도 시간이 긴 기간 동안 정착액에 남아있을 수 있습니다.
- RT에서 1 시간 동안 70 % EtOH에서 슬라이드를 씻으십시오.
- RT 30 분 증류수로 씻어.
- 슬라이드의 뒷면을 살펴 보길), (당신은 림프절이 통해 스테인드 것을 볼 때까지 이일 이상) *를 얼룩 카르민 알룸에 얼룩.
- EtOH의 증가 시리즈, 각 1 시간에 세척 : 70 % -> 95% -> 100 %. 절대 EtOH의 마지막 세척 후 크실렌의 분비를 넣어. 최소한 2 일 RT에서 퓸 후드에 앉아 보자. 이 마지막 단계는 내유 지방 패드의 유선의 의미 delipidation의 삭제, 그리고 투명성에 후속 증가합니다. fattier 선은 더 이상 비운 시간이 필요입니다.
- 같은 Permount로 설치 미디어를 사용하여 커버 - 전표로 마운트합니다. 스테레오 현미경으로 관찰하기 전에 (몇 일) 잘 슬라이드가 건조 보자.
* 카르민 알룸는 얼룩이 :
플레이스 1g 카민 (시그마 C1022) 20 분 500 ML 증류수와 끓여서 2.5 g 알루미늄 칼륨 황산 (시그마 A7167). 물 500 ML에 마지막으로 볼륨을 조정합니다. 필터 및 냉동. 솔루션은 몇 달 동안 사용할 수 있습니다. 색상이 약한되면 폐기하십시오.
2. 유선 전체 마운트 형태론 분석
유선의 평생 마운츠 형태는 다음과 같은 엔드 - 포인트와 유방암 위험과 상관 결과에 따라 분석됩니다.
- 유선 쿨러 21 전체 마운트 (미리 pubertal 나이) :
- 상피 성장 :
- 유두에서 상피 나무의 끝 부분 (mm)로 거리는 통치자를 사용하여 측정
- 악성 변화 가능성 :
- TEBs 수 (터미널 최종 꽃봉오리), 가벼운 현미경시켰다. TEBs는 내유 상피 나무의 말초 끝에있는 큰 주먹코 구조 아르
- 차별 :
- AB1 (폐포 버드) 점수 (0-5). 폐포 꽃봉오리는 상피를 통해 확산됩니다.
- AB2 점수 (0-5)
홀스의 탑재는 가벼운 현미경 점수입니다. AB1 AB2과에서 점수 값은 최종 차별화 점수에 대한 추가됩니다. - 상피 성장 :
- 유선은 전체 장착 쿨러 50 (사후 pubertal 세)에서 수집된 :
- 상피 성장 :
- 림프절에서 상피 트리의 끝을 (mm)로 거리는 통치자를 사용하여 측정.
- 상피 나무의 끝에서 지방 패드의 끝에 거리는 통치자를 사용하여 측정.
- 악성 변화 가능성 :
- 가벼운 현미경으로 계산 TEBs 수,
- 차별 :
- AB1 점수 (0-5)
- AB2 점수 (0-5)
- Lobules 점수 (0-5)
홀스의 탑재는 가벼운 현미경 점수입니다. 차별은 두 가지 방법으로 평가됩니다. 첫째, AB1, AB2 및 lobules에서 점수 값은 최종 차별화 점수에 대한 추가됩니다. 또한, lobules 점수와 AB1 + AB2 점수 사이의 비율이 계산됩니다. ABS가 lobules로 구분하고, lobules와 ABS의 높은 비율, 더 차별화된 선 (腺)입니다. - 상피 성장 :
3. 촉진과 고양이와 유선의 형태론에 상관 관계에 내유 종양 측정
- 이 절차를 시작하려면 머리 뒤쪽 집게손가락과 반대 겨드랑이에서 엄지와 둘째 손가락으로, 다시 위로 손바닥으로 몸 전체를 쥐고하여 쥐를 잡아. 그것은 사후에 누워되도록 밀고 돌려, 및 내유 종양을 탐지하는 만져보다, 만져서 알 수있는 종양은 "혹"같은 느낌한다.
- 다음 너비, 길이, 그리고 종양의 높이를 측정하는 캘리퍼스를 사용합니다. 타원체 공식 볼륨에게 = 1/6πabc, 'A'= 폭, 'B'= 길이, 그리고 'C'= 높이.를 사용하여 종양 볼륨을 계산
- 수동으로 주 단위로 노트북에있는 종양의 위치와 크기를 기록합니다. 이 데이터는 나중에 스프레드 시트로 전송됩니다.
4. 대표 결과
내유 지방 패드와 wholemount하기 위해 처리주의 절개는 유선의 발달 상태를 평가하실 수 있습니다. 각 단계가 올바르게 완료되면 전체 내유 상피 나무는 지방 패드 내에 명확하게 볼 수 있으며, 이것은 TEBs 및 폐포 꽃봉오리와 lobules의 밀도의 계산의 수를 쉽게 결정 수 있습니다. 준비 wholemounts에 잘못하면는 전체 지방 패드, 불충 분한 고정, 그리고 불충 분한 삭제를 해부하다하는 실패를 포함할 수 있습니다.
유선의 형태의 평가는 내유 종양 (TEBs), 상피 구조 (폐포의 꽃봉오리와 lobules)의 분화 정도, 그리고 성장의 측정 (ductal 신장)에 상승을 줄 수 구조의 현재의 수에 대한 정보를 제공합니다. 터미널 엔드에 TEBs을 구분하는 것이 중요하고, 후자는 마찬가지로 TEBs하는 상피의 말초 끝에있는,하지만 그들은 TEBs보다 작은 있으며, 악성 종양을 일으키다 아닙니다. 터미널 종료 또한 상피 트리 내에서 볼 수 있습니다.
그림 1 :. 잘 준비 유선의 전체 탑재 대표 결과는 선 (腺)의 모든 구성 요소를 제대로 해부되어 있고 카르민 얼룩이 최적입니다.
그림 2 :. 제대로 준비 유선의 전체 탑재 대표 결과 글랜드가 제대로 (선의 말초 부분이 누락)를 해부했습니다 제대로 뻗어되지 않았습니다 및 delipidation가 완전히 발생하지 않았습니다.
Discussion
유선 형태학의 최종 지점과 상피 나무의 성장을 평가 일찍 삶 식단 조작, 또는 utero 또는 prepubertal 호르몬 환경에서 변경 기타 조작은 나중에 유방암 위험을 수정 여부를 예측하는 데 사용될 수 있습니다. 인간의 유방암이 쥐에 TEBs와 비슷한 내유 구조 (터미널 ductal 소엽 단위, TDLUs)에서 시작되기 때문에,이 기법은 유방암 위험에 영향을 조기 삶의 노출의 가능성을 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 여성의 높은 mammographic 밀도는 4-6 배로 유방암의 위험을 증가 시키며, 내유 상피 나무의 성장 평가가 mammographic 밀도이 밀도를 감소 요인을 결정하는 요인을 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 이 정보를 얻으려면 유선이 완전히 해부를 제대로 모든 구성 요소가 현미경 시각 수 있도록 유리 슬라이드에 뻗어 있어야합니다. 또한, 적절한 카르민 얼룩과 크실렌의 delipidation은 유방암 위험 평가에 적합 전체 마운트를 제공합니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
NCI (U54 CA00100970), NCI (1 R03 CA150040 - 01), ACS (116602 - PF - 09 - 018-01 - 척수)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glacial acetic acid | Electron Microscopy Sciences | AX0073-9 | Carnoy’s Fixative |
| Absolute ethanol | The Waner-Graham Co. | 64-17-5 | Carnoy’s Fixative |
| Carmine | Sigma-Aldrich | C1022 | Carmine solution |
| Aluminum potassium sulfate | Sigma-Aldrich | A7167 | Carmine solution |
References
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