Förändringar i bröstkörtlarna Morfologi och bröstcancerrisk hos råttor

Summary

Vår protokoll beskriver hur man dissekera råttan buken mjölkkörtlarna och hur man förbereder bröstkörtlarna hela fästen. Den beskriver också hur man analyserar bröstkörtlarna morfologi med tre end-points (antal knoppar terminalen slutet, epiteliala töjning och differentiering) och att använda dessa resultat för att förutsäga mammary cancerrisk hos råttor som utsattes för kosten modifieringar

Abstract

Studier i gnagare modeller av bröstcancer visar att exponering för kost / hormonella faktorer under in utero och pubertal perioder, när bröstkörteln genomgår omfattande modellering och omformning, ändra känslighet för cancerframkallande-inducerad juvertumörer. Liknande resultat har beskrivits hos människa: till exempel ökar med hög födelsevikt senare risk att utveckla bröstcancer, och intaget av soja under barndomen minskar risken bröstcancer. Det är tänkt att dessa prenatal och postnatal kosten modifieringar framkalla ihållande morfologiska förändringar i mjölkkörtlarna som i sin tur ändrar risken bröstcancer senare i livet. Dessa morfologiska förändringar speglar troligen epigenetiska förändringar, såsom förändringar i DNA-metylering, histoner och miRNA uttryck som sedan påverkar gentranskription. I denna artikel beskriver vi hur förändringar i bröstkörtlarna morfologi kan förutsäga mammary cancerrisken hos råttor. Vår protokoll beskriver specifikt hur man dissekera och ta bort råttan buken mjölkkörtlarna och hur man förbereder bröstkörtlarna hela fästen. Den beskriver också hur man analyserar bröstkörtlarna morfologi enligt tre slutpunkter (antal knoppar terminalen slutet, epiteliala töjning och differentiering) och att använda uppgifterna för att förutsäga risken att utveckla bröst cancer.

Protocol

1. Borttagning av buken bröstkörtlarna och förbereda en hel Mount

1. Euthanize djuret enligt IACUC riktlinjer. Pin djuret på rygg från sitt ben med nålar eller tejp benen på ytan styrelsen, och torka av huden fuktig med etanol (EtOH). Lyft huden lite med pincett och med vassa saxar gör en mittlinje snitt i huden börjar mellan paret # 5 bröstvårtor och skära mot nacken. Gör en inverterad Y-snitt från mittlinjen mot bakbenen. Om bröstkorg bröstkörtlarna ska också samlas in, gör också en Y-snitt från mittlinjen mellan paret # 2 bröstvårtor mot frambenen.
2. Dissekera huden öppna med en sax på ena sidan av den inverterade Y-snitt för att exponera buken # 4 mjölkkörtlarna, mjölkkörtlar är fästa på huden. Nåla fast huden med nålar på ytan styrelsen, att helt avslöja körteln. Arbetet ena sidan och körtel på den tiden.
3. Dissekera mjölkkörtlarna fri från huden antingen med vass sax och / eller en skalpell, från den proximala området nära bröstvårtan och arbetar mot den distala änden av körteln mot ryggraden av djuret. (Detta kan ta flera minuter, särskilt i en äldre råtta.)
4. Omedelbart sprida lossnat körteln på ett korrekt märkta glasskiva (använd en lämplig permanent tuschpenna och / eller "en diamant penna") och sprida körteln noga motsvarar dess ursprungliga storlek och form på plats. Glaset bilden måste vara större än den körteln. Efter att sprida körtel på bilden, låt det sitta på bordet en stund, så att körteln fastnar på bild, men låt det inte torka.
5. Sätt bilden i en burk som innehåller Carnoy är fixativ (75% isättika, 25% absolut etanol = EtOH), låt det bli fast i rumstemperatur (RT) i dragskåp i 2 dagar eller längre. Diabilder kan också vara kvar i fixativ för en längre tid.
6. Tvätta objektglasen i 70% EtOH i 1 timme vid RT.
7. Skölj i destillerat vatten i 30 min vid RT.
8. Fläck på Carmine Alum bets *) i 2 dagar eller längre (tills du ser att lymfkörtlar har målat igenom, titta på baksidan av bilden).
9. Tvätta i ökande serie av EtOH, 1 timme i varje: 70% -> 95% -> 100%. Efter den sista tvättningen i absoluta EtOH sätta körtlar i xylen. Låt sitta i dragskåp i RT i minst 2 dygn. Det sista steget är clearing av bröstkörteln innebörden delipidation av juverfett pad, och påföljande ökning av öppenheten. Den fetare körteln är längre avfärgningstiden krävs.
10. Montera med cover-glider med hjälp av en montage media, såsom Permount. Låt objektglasen torka väl (flera dagar) innan observera under lupp.
    * Carmine Alum Stain:
    
    Placera 1 g karmin (Sigma C1022) och 2,5 g aluminium kaliumsulfat (Sigma A7167) i 500 ml destillerat vatten och koka i 20 min. Anpassa den slutliga volymen till 500 ml med vatten. Filter och kyla. Lösningen kan användas i flera månader. Kassera när färgen blir svagt.

2. Analys av bröstkörtlarna Hela Mount morfologi

Mjölkkörteln hela fästen morfologi analyseras enligt följande slutpunkter och resultaten korrelerade med bröst cancerrisk.

1. Mjölkkörteln hela montera på PND 21 (pre-pubertal ålder):
   • Epitelial tillväxt:
     • Avstånd från bröstvårtan till slutet av epiteliala träd (i millimeter), mätt med en linjal
   • Potential för malign transformation:
     • Antal TEBS (terminal slutet knoppar), räknat i ett ljusmikroskop. TEBS är de största bulbous strukturer som ligger endast på den distala änden av bröst epitelceller trädet
   • Differentiering:
     • AB1 (alveolär BUD) poäng (0-5). Alveolära knoppar är spridda över hela epitelet.
     • AB2 poäng (0-5)
   
   Helheter fästen poängsätts i ett ljusmikroskop. Poängen värden från AB1 och AB2 läggs för en slutlig differentiering poäng.
2. Mjölkkörteln hela montera samlats vid PND 50 (post-pubertal ålder):
   • Epitelial tillväxt:
     • Avstånd från lymfkörteln till slutet av epiteliala träd (i millimeter), mätt med en linjal.
     • Avståndet från spetsen av epitelceller trädet till slutet av fett pad, mätt med en linjal.
   • Potential för malign transformation:
     • Antal TEBS, räknat under ett ljusmikroskop
   • Differentiering:
     • AB1 poäng (0-5)
     • AB2 poäng (0-5)
     • Lobules poäng (0-5)
   
   Helheter fästen poängsätts i ett ljusmikroskop. Differentiering kommer att utvärderas på två sätt. Först är poängen värden från AB1, AB2 och lobules till för en slutlig differentiering poäng. Dessutom kommer förhållandet mellan lobules poäng och AB1 + AB2 poäng beräknas. ABs differentiera till lobules, och ju högre kvoten mellan lobules och ABS, desto mer differentierade körteln är.

3. Palpation och juvertumör Mätning hos råtta och Korrelation att bröstkörtel morfologi

1. Till att börja den här proceduren, håll råttan genom att ta tag i hela kroppen med handflatan över ryggen med pekfingret bakom huvudet och tummen och andra finger under motsatt axill. Vänd råttan så det är liggande på bakre och palpera att upptäcka eventuella brösttumörer, palpabel tumör ska kännas som en "klump".
2. Nästa använder ett ok för att mäta bredd, längd och höjd av tumören. Beräkna tumören volymen med ellipsoiden formel, Volym = 1/6πabc, där "a" = bredd, "b" = längd, och 'c' = höjd.
3. Manuellt registrera placering och storlek av tumören i en anteckningsbok på veckobasis. Dessa data kommer att överföras till ett kalkylprogram senare.

4. Representativa resultat

Noggrann dissektion av juverfett pad och dess behandling för att wholemount att kunna bedöma vilka utvecklande tillståndet i bröstkörtlarna. När varje steg görs korrekt, är hela bröst epitelceller trädet tydliga i fett pad, och detta gör det lätt att bestämma antalet TEBS och beräkning av tätheten av alveolära knoppar och lobules. Felsteg i förberedelserna wholemounts kan omfatta underlåtenhet att dissekera hela fett pad, otillräcklig fastställande och otillräcklig röjning.

Bedömning av bröstkörtlarna morfologi kommer att ge information om antal strukturer närvarande som kan ge upphov till brösttumörer (TEBS), grad av differentiering av epitelceller strukturer (alveolär knoppar och lobules) och mått på tillväxt (duktal förlängning). Det är viktigt att skilja TEBS till terminal ändar, de senare finns på den distala änden av epitel, i likhet med TEBS, men de är mindre än TEBS och inte ger upphov till elakartade tumörer. Terminal slutar ses också inom epiteliala trädet.

Figur 1:. Representativt resultat av väl förberedda bröstkörtlarna hela montera alla delar av körteln har blivit riktigt dissekeras och karmin färgning är optimal.

Figur 2:. Representant resultatet av ett dåligt förberedda bröstkörtlarna hela mount körteln blivit behörigen dissekerat (distala delen av körteln saknas), har inte riktigt sträckt och delipidation har inte helt inträffat.

Discussion

Bedömning av bröstkörtlarna morfologiska slutpunkter och tillväxten av epitelceller trädet kan användas för att förutsäga om tidigt liv kost manipulationer eller andra manipulationer som ändrar i livmodern eller prepubertala hormonella miljön, ändra senare bröst cancerrisk. Eftersom bröstcancer hos människor inleds i bröst strukturer (plint duktal lobulär enheter TDLUs) liknande TEBS på råttor, kan denna metod användas för att avgöra potentialen i tidiga liv exponeringar påverka risken bröstcancer. Vidare hos kvinnor med hög mammografiska täthet ökar risken för bröstcancer med 4-6 gånger, och bedömning av tillväxten av bröst epitelceller träd kan användas för att identifiera faktorer som avgör mammografiska täthet och faktorer som minskar denna densitet. För att få denna information bör mjölkkörtlar vara fullt dissekeras, väl utsträckt på en glasplatta så att alla dess komponenter kan visualiseras i mikroskop. Dessutom kommer korrekt karmin färgning och delipidation i xylen förse hela fästen som är lämpliga för bröst cancer riskbedömning.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glacial acetic acid	Electron Microscopy Sciences	AX0073-9	Carnoy’s Fixative
Absolute ethanol	The Waner-Graham Co.	64-17-5	Carnoy’s Fixative
Carmine	Sigma-Aldrich	C1022	Carmine solution
Aluminum potassium sulfate	Sigma-Aldrich	A7167	Carmine solution