在哺乳动物的中枢神经系统视神经横断后的实验操作方法

Summary

视神经横断是一个成人中枢神经系统损伤的广泛使用的模型。这种模式是执行的全球目标的视网膜或直接目标受伤的视网膜神经节细胞神经元群的实验操作的理想选择。

Abstract

视网膜神经节细胞（RGC的）是中枢神经系统的神经元，输出的视觉信息从视网膜到大脑，通过视神经。视神经眼轨道内可以访问，并完全切断（axotomized），切割研资局在整个人口的轴突。视神经横断重现模型在^1-4成人中枢神经系统的细胞凋亡的神经细胞死亡。这种模式是特别有吸引力，因为眼睛的玻璃体腔行为作为药物输送到视网膜的胶囊，允许通过人工注射的实验操作。通过玻璃体液体化学品的扩散，确保他们的行为后，整个研资局人口。病毒载体，质粒或短干扰RNAs（siRNAs），也可以传递到玻璃体腔感染或转染视网膜^细胞 5-12 。腺相关病毒（AAV）载体的高向性是有利于目标的视网膜神经节细胞，感染率接近90％的细胞^{注射部位6，7，13-15}附近。此外，视网膜神经节细胞，可以选择性地转，运用到自己的目标上^丘 10的siRNA，质粒或病毒载体的^削减 16-19视神经或注射载体结束。这使研究人员能够在受伤的神经元群细胞凋亡的机制研究没有其他旁观者神经元或神经胶质细胞周围的混杂影响。研资局凋亡有一个特点的时间进程，使细胞死亡是推迟3-4天postaxotomy后，这些细胞迅速退化。这提供了一个针对在细胞凋亡有关的途径的实验操作的窗口。操作直接针对视网膜神经节细胞从横断视神经残端后，立即切割神经干切断时间。相比之下，通过人工途径传递物质，它们可以被注射，手术前或在手术后第3天前开始axotomized RGC的凋亡。在本文中，我们展示了视神经横断后的实验操作的几种方法。

Protocol

1。外科技术

1. 使用无菌技术操作，并按照您的特定机构的动物使用协议，应进行实验。活体组织接触到的工具和材料（解决方案，测试物质，示踪剂，针等）必须是无菌的，以防止感染动物福利和研究的潜在的负面影响和不利影响。

2。麻醉

1. 老鼠将被麻醉的兽医异氟醚蒸发器系统。使用医疗级氧气在0.8 L / min的异氟醚气体蒸发的速度。放置在附加麻醉中的动物和异氟醚浓度在4％拨号，直到呼吸速度减慢和动物是稳重。
2. 接下来，气体流量开关防毒面具附件立体框架，放置在立体定位仪上的动物。关闭异氟醚的浓度下降到2％，并监测麻醉。大型动物（> 300克），可能需要较高浓度的异氟醚。麻醉手术过程中应监测和异氟醚用量相应调整。应不断评估的深度和呼吸频率，并应脚趾捏评价了深深的痛苦的情况下（每5分钟）。
3. 手术完成后，关闭异氟醚和切除脑立体定位装置前的几分钟，让动物呼吸的氧气。涵盖动物用手术毯和/或使用在手术过程中的受规管的加热毯，应保持体温。

3。眼内注射的注射器制备

1. 首先，执行人工注射的注射器系统组装。 10μL护士气密1701汉密尔顿注射器用于注射。删除任何注射器针头或RN螺母目前。
2. 插入的PEEK杯煤灰套圈，套圈，压缩接头。然后将其插入注射器年底完成装修和松散顶部的RN螺母，螺钉。
3. 的1 / 16英寸的PEEK管的一端插入到压缩接头，通过在RN螺母开放。确保PEEK管完全就位。护士螺母拧紧，压缩套圈，密封PEEK管。
4. 执行步骤3.2双RN玻璃耦合两端。通过紧缩的护士螺母，将PEEK管自由端的双RN玻璃耦合的一端。
5. 一把拉住玻璃微吸管将形成针注射系统和桶。使用1.5 mm外径的厚壁玻璃毛细管管制作的玻璃吸液管，玻璃吸管插入双RN玻璃耦合的自由端。护士螺母拧紧，修复到位的吸管。
6. 拉玻璃微量的精尖通常是太小了，执行人工注射。为了创造一个适当的直径的尖端，打破玻璃吸管的尖端视觉引导下，用手术显微镜。磨砂的玻璃标本幻灯片结束非常适合打破吸管。移液器保持在一个角度和擦沿玻璃结霜的提示创建一个突破。理想的情况下，最终尖应略有斜面。它可能需要几分钟的尝试产生一个很好的提示，所以拉多个移液器前使用。
7. 喷射系统是液压的。因此，注射器，PEEK管连接器，双RN玻璃耦合器和玻璃微量矿物油在使用前必须填写。使用底漆从汉密尔顿注射器有限公司（PRMKIT）试剂盒，填补与矿物油吸注射器。使用大直径的针，让稠油容易通过。更换适合每桶10μL汉密尔顿注射器内与汉密尔顿90030针针。下一步，放置一个橡胶隔在汉密尔顿90030针，以提供印章，同时注入矿物油。
8. 汉密尔顿90030针吸注射器插入回到每桶10μL汉密尔顿注射器喷射系统。按注射器结束对隔紧紧地创建一个密封。
9. 慢慢压低柱塞。你会看到通过喷射系统的玻璃元素的矿物油通过，终于填补了玻璃吸管。通过喷射系统推油，以去除气泡沿道的任何。如果灌装注射器是矿物油，慢慢退出针，同时不断配药油，以防止气泡的形成。笔芯的吸注射器和注射一次。
10. 当整个系统是用矿物油和泡沫填充，插入原来的10μL汉密尔顿注射器的柱塞。为了从系统中删除额外的矿物油压低，直到旅行结束柱塞。擦拭玻璃微吸管干净，清洁注射器用70％乙醇年底。
11. Withdraw为2μL桶大关注射器的柱塞。玻璃微吸管年底将填补与空气之间的矿物油和所需的液体被注入提供一个缓冲地带。吸管桶，现在可以充满，放置在理想​​的解决方案的微年底，撤回的汉密尔顿注射器的柱塞。不要超过4-5μL的溶液注入成年大鼠眼。

4。眼内注射程序：全球定位视网膜

1. 与动物麻醉和固定在立体定位框架（第2部分所述），使用Alcaine眼药水局部麻醉角膜。打开用手指和地方上的角膜表面麻醉的解决方案之一滴眼睑。
2. 注射需要两个人之一插入玻璃体腔玻璃吸管和保持吸液管的位置，和另一个压低提供了理想的解决方案注射器的柱塞。
3. 在手术显微镜，握的玻璃微管和双护士用手指玻璃耦合器。传播与另一只手的手指在眼皮，形成一个“V”对面的注射部位的形状。应用牵引眼睑，眼睛会升高轨道，露出了后面的角膜缘的后表面。通过创建与对面的注射部位的手指一个“V”字形，形成一个摇篮眼睛提供注射时的稳定性。
4. 通过眼结膜的玻璃微吸管尖端轻轻插入，在一个地区缺乏血管，并通过巩膜，在一个向下的角度。你应该感到一个小的“砰砰”，当吸管穿透巩膜。在稍微向下的角度插入吸管，减少击球时的镜头插入针的机会。
5. 拿着注射器的人现在应该注入郁闷柱塞2μL注射器上标记的溶液4μL。注射应采取合共约一到两秒。在一个非常缓慢的的速度注入> 3秒，减少了初步的解决方案通过玻璃体腔蔓延。您将可以看到注入的解决方案，通过在显微镜下玻璃体腔冲洗，从而验证程序的成功。
6. 保持约5秒钟的微管稳定，然后退出在同一方向，针插入。结膜瓣回小开放，帮助密封巩膜穿刺。
7. 在恢复过程中，以防止角膜干燥，并返回的动物恢复笼盖眼科眼膏（泪Naturale PM）的角膜表面。
8. 手术后止痛药，应根据动物保健当局的指引，管理，和动物手术后应仔细监测。

5。有选择地针对视网膜神经节细胞视神经残端

1. 应用示踪剂，药品，质粒，siRNAs的病毒载体视神经断端，干切断后，直接针对视网膜神经节细胞，通过逆行运输。这是通过先执行视神经横断根据“视神经横断议定书^”22。
2. 有两个主要的方法来完成此过程：用明胶海绵，或直接到视神经注射。
3. 明胶海绵的方法是类似逆行追踪的，然而，当它是可取的标签前的视网膜神经节细胞逆行示踪剂注入上丘1个星期之前，以干切断视神经提供试验性治疗。这是非常重要的细胞追踪，因为在某些情况下可干扰神经示踪逆行运输的实验物质，反之亦然。
4. 视神经后立即被切断，切断视神经残端放置在实验溶液中浸泡的明胶海绵小块。眶内容，然后返回到先前的位置。当眼睛恢复到中立的立场，有必要使用倒推入轨道的明胶海绵片钳，以确保它仍然在视神经年底。
5. 注射技术是更有效地交付的物质，必须获得轴突的细胞质，以便逆行轴浆流运输。这包括siRNA和质粒，并在某些情况下，病毒载体。 5-10μL汉密尔顿注射器注入切断视神经所需的解决方案。
6. 视神经与精尖杜蒙钳手柄的边缘。插入视神经针年底，平行的神经，直到锥不再可见。插入针头将包裹各方的神经。一个用短斜面的针头是可取的。
7. 一旦在Needle是插入到神经，用细尖镊子轻轻挤压神经的两侧，并同时转动四分之一圈顺时针或逆时针旋转的注射器注入一季度的解决方案。
8. 继续重复步骤5.7，直到完成一个完整的旋转针和注射器注射的全部内容。为了获得最佳结果，共注入10μL使用气密性的10μL汉密尔顿注射器解决方案。
9. 从神经取出注射器的尖端。保留的过剩注射液，从轨道内的神经回流，因为这将形成一个由轴突末端吸收池。
10. 眶内容返回到原来的位置，关闭伤口，让动物恢复。
11. 手术后止痛药，应根据动物保健当局的指引，管理，和动物手术后应仔细监测。

6。代表性的成果：

眼内注射细胞在视网膜上的所有目标从全球来看，和受伤的视网膜神经节细胞的传递物质以及神经节细胞位于最内层的视网膜神经元层，相邻的玻璃体腔。视网膜神经节细胞，也可以直接切断视神经残端提供物质针对性。使用图1所示的神经断端的肽，药物，载体，质粒，或siRNA荧光金逆行标记视网膜神经节细胞，可以有针对性。图1A - C的演示一个Cy3标记的标记肽，前到上丘注射荧光金标记的视网膜神经节细胞somata本地化。 Cy3标记标记肽分别注入后立即干切断视神经，视网膜成像活着，以防止从浸出组织在固定的肽。图1D - F演示Cy3标记标记的siRNA和axotomized RGC的荧光金逆行示踪本地化。 Cy3标记标记的siRNA被注射到视神经残端后立即干切断和视网膜成像活着。

图1。flatmounted视网膜视网膜神经节细胞Epifluorescence的照片，在1天或者标记肽或到视神经残端的siRNAs后干切断和注射。 （一）荧光金逆行标记axotomized RGC的1天postaxotomy（二）在下面的标记肽的逆行运输，干切断和肽注射到视神经后1天的视网膜神经节细胞的荧光Cy3标记。 （三）覆盖（A）和（二）展示Cy3标记标记肽的荧光金标记的视网膜神经节细胞的选择性本地化。 （DF）的细胞的荧光金标记的视网膜神经节细胞（四）机构也充满了标记Cy3标记的siRNA注射到视神经残端24小时前（五），覆盖（六）所示。在交流的比例尺为50μm。在DF规模的酒吧是20微米。

Discussion

视神经横断是一个成人中枢神经系统神经细胞凋亡的高度重复性的模型。在这个手稿中表现出的实验操作许可证伤后RGC的凋亡机制的研究。

全球定位视网膜，眼内注射是有用的。这个过程需要一定的实践，关键是不要伤害了的玻璃吸管尖端的镜头。晶状体的损害已经造成生长因子的释放，改变细胞的存活和再生^20，21。同样重要的是要小心地插入和退出提示的方向平行的玻璃吸管。玻璃吸管尖上的任何侧向力可能会导致玻璃碎片进入损坏镜头或视网膜玻璃体腔。使用一个尖，太细的吸管，不得允许粘性的解决方案的交付。此外，不给一个极其精尖的触觉反馈，巩膜被刺破时不小心刺破了镜头的机会增加。镜头从任何穿刺引号应保持清晰和自由时，在显微镜下观察。如果镜头受损，往往会形成白内障和镜头将云和这些实验结果应被排除在外。

注射器系统最好的作品时，有没有气泡沿道的。空气可以扩大和压缩减少的解决方案撤回或交付的响应。如果是可见的气泡，冲洗出来的吸注射器和矿物油。护士双压缩配件玻璃适配器使得改变吸管之间的不同的动物，治疗，或在一个破损的情况下高效。这个系统是稳健和前套圈需要更换，只要吸液管小心插入，将持续多年。

直接针对视网膜神经节细胞注入视神经是一个相当快的过程，几个注意事项。如果视神经残端太短，使注射困难。短残端也增加了机会，中针会损伤视网膜血管附近的视神经头，因为它是插入到斜角水平。因此，约2毫米长的视神经残端，是可取的，这种技术进行神经注射时。注射器锥内视神经完全封闭注射工作。必须采取不通过一侧的神经针尖，因为这将创建一个低电阻区域，使液体退出注射部位，从而减少注射的有效性。

潜在的生物危害，如病毒颗粒，或转化细胞工作时，重要的是要按照机构的指引和安全程序。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereotaxic Frame	Stoelting Co.
Rat Gas Mask	Stoelting Co.
Anesthesia System	VetEquip	901806
Isoflurane (PrAErrane)	Baxter Internationl Inc.	DIN 02225875
Surgical Microscope	WPI, Zeiss, Leica
Alcaine Eye Drops	Alcon
Tears Naturale P.M.	Alcon
Fine tip Dumont forceps	Fine Science Tools	11252-00
10 μl Hamilton Syringe (1701RN; 26s/2”/2)	Hamilton Co	80030
1/16 inch Compression Fittings	Hamilton Co	55751-01
1/16 inch OD, 0.010 inch ID, PEEK Tubing	Supelco, Sigma-Aldrich	Z226661
Dual RN Glass Coupler	Hamilton Co	55752-01
Mineral Oil Priming Kit: includes syringe, needles, rubber septa	Hamilton Co	PRMKIT