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Neuroscience

प्रयोगात्मक अभिव्यक्ती के लिए स्तनधारी CNS में ऑप्टिक तंत्रिका transection के बाद के तरीके

Published: May 12, 2011 doi: 10.3791/2261
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Surgery, University of Toronto
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

ऑप्टिक तंत्रिका transection वयस्क सीएनएस चोट के एक मॉडल व्यापक रूप से इस्तेमाल किया है. इस मॉडल प्रयोगात्मक अभिव्यक्ती है कि रेटिना विश्व स्तर पर लक्ष्य या सीधे रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं के घायल neuronal जनसंख्या लक्ष्य के एक नंबर प्रदर्शन करने के लिए आदर्श है.

Abstract

रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं (RGCs) सीएनएस न्यूरॉन्स रहे हैं कि उत्पादन रेटिना से मस्तिष्क के लिए ऑप्टिक तंत्रिका के माध्यम से दृश्य, सूचना. ऑप्टिक तंत्रिका आँख की कक्षा के भीतर पहुँचा जा सकता है और पूरी तरह से (axotomized) transected पूरे RGC जनसंख्या के axons काटने है. ऑप्टिक तंत्रिका transection वयस्क 1-4 सीएनएस में एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य apoptotic neuronal सेल मौत का मॉडल है. यह मॉडल विशेष रूप से आकर्षक है क्योंकि आँख के शीशे चैम्बर दवा रेटिना को प्रसव के लिए एक कैप्सूल के रूप में कार्य करता है, intraocular इंजेक्शन के माध्यम से प्रयोगात्मक अभिव्यक्ती की अनुमति है. कांच तरल पदार्थ के माध्यम से रसायनों के प्रसार सुनिश्चित करता है कि वे संपूर्ण RGC जनसंख्या पर कार्रवाई. वायरल वैक्टर, plasmids या कम दखल RNAs (siRNAs) भी शीशे चैम्बर के लिए दिया जा सकता है क्रम में रेटिना की कोशिकाओं को संक्रमित या transfect 5-12. एडिनो - एसोसिएटेड वायरस वैक्टर (AAV) के उच्च tropism लक्ष्य RGCs के लिए फायदेमंद है, एक संक्रमण दर इंजेक्शन साइट 6, 7, 13-15 के पास की कोशिकाओं के 90% आ के साथ, है. इसके अलावा, RGCs चुनिंदा 16-19 ऑप्टिक तंत्रिका या इंजेक्शन वैक्टर की कटौती अंत तक अपने लक्ष्य बेहतर 10 colliculus में siRNAs, plasmids, या वायरल vectors लागू करने के द्वारा ट्रांसफ़ेक्ट किया जा सकता है. यह शोधकर्ताओं अन्य दर्शक न्यूरॉन्स या आसपास glia पर confounding प्रभाव के बिना घायल neuronal आबादी में apoptotic तंत्र का अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है. RGC apoptosis को एक बार पाठ्यक्रम विशेषता है जिससे कोशिका मृत्यु 3-4 दिनों postaxotomy, जिसके बाद कोशिकाओं के तेजी से पतित देरी हो रही है. यह प्रयोगात्मक apoptosis में शामिल रास्ते के खिलाफ निर्देशित जोड़तोड़ के लिए एक खिड़की प्रदान करता है. जोड़तोड़ कि सीधे transected ऑप्टिक तंत्रिका स्टंप से RGCs लक्ष्य axotomy के समय में प्रदर्शन कर रहे हैं, तंत्रिका काटने के तुरंत बाद. इसके विपरीत, जब पदार्थ एक intraocular मार्ग के माध्यम से वितरित कर रहे हैं, वे सर्जरी से पहले या सर्जरी के बाद पहले 3 दिनों के भीतर इंजेक्शन जा सकता है, axotomized RGCs में apoptosis की दीक्षा पूर्ववर्ती. वर्तमान अनुच्छेद में, हम ऑप्टिक तंत्रिका transection के बाद प्रयोगात्मक जोड़तोड़ के लिए कई तरीकों का प्रदर्शन.

Protocol

1. सर्जिकल तकनीक

  1. प्रयोगों से बाहर सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग कर और अपने विशिष्ट संस्थान के पशु का उपयोग प्रोटोकॉल का पालन किया जाना चाहिए. उपकरण और सामग्री (समाधान, परीक्षण पदार्थों, tracers, सुई, आदि) ऊतक रहने के साथ संपर्क में आने के पशु कल्याण और अध्ययन पर संभावित नकारात्मक प्रभावों पर संक्रमण और प्रतिकूल प्रभावों को रोकने के लिए बाँझ होना चाहिए.

2. बेहोशी

  1. चूहे anaesthetized एक पशु isoflurane vaporizer प्रणाली का उपयोग करेगा. 0.8 एल / मिनट isoflurane गैस भाप बनकर की दर पर चिकित्सा ग्रेड ऑक्सीजन का उपयोग करें. संलग्न संज्ञाहरण बॉक्स में पशु प्लेस और 4% की isoflurane एकाग्रता में डायल जब तक श्वास धीमा है और जानवर शांत है.
  2. अगला, गैस मास्क लगाव stereotaxic फ्रेम के लिए गैस प्रवाह और स्विच stereotaxic तंत्र में जानवरों की जगह. मुड़ें isoflurane एकाग्रता नीचे 2% और संज्ञाहरण की निगरानी. बड़े जानवरों (300g>) isoflurane के एक उच्च एकाग्रता की आवश्यकता हो सकती है. संज्ञाहरण सर्जरी के दौरान निगरानी की जानी चाहिए और isoflurane खुराक तदनुसार समायोजित. गहराई और साँस लेने की दर में लगातार हो, मूल्यांकन किया जाना चाहिए और गहरा दर्द के अभाव के लिए पैर के अंगूठे चुटकी मूल्यांकन (हर 5 मिनट) किया जाना चाहिए.
  3. एक बार शल्य चिकित्सा पूरा हो गया है, बंद isoflurane बारी और सांस ऑक्सीजन के लिए कई stereotaxic डिवाइस से हटाने से पहले मिनट के लिए जानवर की अनुमति. शारीरिक तापमान एक शल्य चिकित्सा और कंबल / के साथ जानवरों को कवर या सर्जरी के दौरान एक विनियमित हीटिंग कंबल का उपयोग करके बनाए रखा जाना चाहिए.

3. Intraocular इंजेक्शन के लिए सिरिंज तैयार

  1. सबसे पहले, intraocular इंजेक्शन के प्रदर्शन के लिए सिरिंज प्रणाली को इकट्ठा. एक 10 μL आर.एन. Gastight 1701 हैमिल्टन सिरिंज इंजेक्शन के लिए प्रयोग किया जाता है. किसी भी सुई या सिरिंज के अंत पर आर.एन. अखरोट मौजूद निकालें.
  2. तिरछी नज़र कप में पीएफए ​​सामी सम्मिलित संपीड़न फिटिंग के सामी. फिर सिरिंज के अंत में पूरा फिटिंग डालने और शिथिल शीर्ष पर आर.एन. नट पेंच.
  3. संपीड़न फिटिंग में आर.एन. अखरोट में खोलने के माध्यम से 1 / 16 इंच तिरछी नज़र टयूबिंग की एक छोर डालें. सुनिश्चित करें कि तिरछी नज़र टयूबिंग पूरी तरह से बैठा है. आर.एन. अखरोट कस सामी सेक, तिरछी नज़र टयूबिंग सील.
  4. प्रदर्शन दोहरी आर.एन. कांच युग्मक के दोनों सिरों पर 3.2 चरण. आर.एन. नट कस द्वारा दोहरी आर.एन. कांच युग्मक के एक छोर पर तिरछी नज़र टयूबिंग के मुक्त अंत संलग्न.
  5. एक खींच लिया गिलास micropipette सुई और इंजेक्शन प्रणाली के लिए बैरल फार्म का होगा. 1.5 मिमी आयुध डिपो मोटी दीवारों गिलास केशिका टयूबिंग का उपयोग करने के लिए कांच pipettes बनाना, और दोहरी आर.एन. कांच युग्मक के मुक्त अंत में ग्लास विंदुक सम्मिलित. आर.एन. अखरोट कस जगह में पिपेट ठीक है.
  6. खींच कांच micropipettes के ठीक टिप intraocular इंजेक्शन के प्रदर्शन करने के लिए आमतौर पर बहुत छोटा है. आदेश में उचित व्यास का एक टिप बनाने के लिए, दृश्य मार्गदर्शन के तहत ग्लास विंदुक टिप को तोड़ने, एक शल्य माइक्रोस्कोप का उपयोग. एक गिलास नमूना स्लाइड के पाले सेओढ़ लिया अंत अच्छी तरह से विंदुक तोड़ने के लिए अनुकूल है. एक कोण पर विंदुक पकड़ो और गिलास frosting के साथ टिप रगड़ के लिए एक ब्रेक बनाने के. आदर्श रूप में, अंतिम टिप थोड़ा bevelled होना चाहिए. यह कुछ प्रयास के लिए एक अच्छी टिप उपज ले सकता है, तो पहले कई pipettes खींचने के उपयोग करने के लिए.
  7. इंजेक्शन प्रणाली हाइड्रोलिक है. इसलिए, सिरिंज, तिरछी नज़र टयूबिंग linker, दोहरी आर.एन. कांच युग्मक और गिलास micropipette पहले खनिज तेल का उपयोग करने के लिए के साथ भरा होना चाहिए. हैमिल्टन सिरिंज कं (PRMKIT) से भड़काना किट का प्रयोग, खनिज तेल के साथ भड़काना सिरिंज भरें. एक बड़े व्यास सुई का प्रयोग करने के लिए चिपचिपा तेल की आसान पारित होने की अनुमति. हैमिल्टन 90030 सुई कि 10 μL हैमिल्टन सिरिंज प्रति बैरल के अंदर फिट बैठता है के साथ सुई बदलें. अगला, हैमिल्टन सुई 90030 से अधिक एक रबर पट जगह क्रम में के लिए एक मुहर प्रदान करते हुए खनिज तेल इंजेक्शन.
  8. इंजेक्शन प्रणाली के 10 μL हैमिल्टन सिरिंज प्रति बैरल के पीछे में भड़काना सिरिंज के हैमिल्टन 90030 सुई डालें. पट सिरिंज के अंत के खिलाफ मजबूती से प्रेस के लिए एक मुहर बनाने.
  9. धीरे धीरे दबाना सवार. तुम खनिज तेल से गुजारें इंजेक्शन प्रणाली के कांच तत्वों के माध्यम से देख, और अंत में कांच विंदुक भरने. इंजेक्शन प्रणाली के माध्यम से तेल के सभी पुश क्रम में पथ साथ किसी भी हवाई बुलबुले को दूर. यदि भरने सिरिंज खनिज तेल के बाहर चल रहा है, सुई धीरे धीरे वापस लेने जबकि लगातार तेल वितरण के लिए हवा बुलबुला गठन को रोकने. भड़काना सिरिंज फिर से भरना और फिर इंजेक्षन.
  10. जब पूरे सिस्टम खनिज तेल और बुलबुला मुक्त से भरा है, 10 μL हैमिल्टन सिरिंज के मूल सवार सम्मिलित करें. अपनी यात्रा के अंत तक सवार दबाना क्रम में सिस्टम से अतिरिक्त खनिज तेल निकालने. कांच micropipette स्वच्छ और 70% इथेनॉल के साथ साफ सिरिंज के अंत साफ कर लें.
  11. Withdraw 2 प्रति बैरल पर μL निशान करने के लिए सिरिंज के सवार. कांच micropipette के अंत हवा खनिज तेल और वांछित द्रव इंजेक्शन जा के बीच एक बफर जोन प्रदान करने के साथ भर जाएगा. विंदुक बैरल अब वांछित समाधान में micropipette के अंत रखने और हैमिल्टन सिरिंज के सवार वापस लेने के द्वारा भरा जा सकता है. एक वयस्क चूहे आँख में समाधान का 4-5 से अधिक μL इंजेक्षन मत करो.

4. Intraocular इंजेक्शन प्रक्रिया: रेटिना ग्लोबली लक्ष्य निर्धारण

  1. जानवर anesthetized और stereotaxic फ्रेम (के रूप में धारा 2 में वर्णित) में सुरक्षित के साथ उपयोग, Alcaine आंख कॉर्निया topically anesthetize बूँदें. पलकों को अपनी उंगलियों और जगह कॉर्निया की सतह पर संवेदनाहारी समाधान की एक बूंद के साथ खोलें.
  2. एक कांच के चेंबर में कांच विंदुक सम्मिलित करने के लिए और विंदुक स्थिति को बनाए रखने, और एक और जो वांछित समाधान उद्धार सिरिंज पर सवार दबाना: इंजेक्शन दो लोगों की आवश्यकता है.
  3. एक सर्जिकल माइक्रोस्कोप, पकड़ कांच micropipette और अपनी उँगलियों के साथ दोहरी आर.एन. कांच युग्मक के तहत. अपने मुक्त हाथ की उंगलियों के साथ पलकें बिखरा हुआ है, इंजेक्शन स्थल के सामने एक "वी" आकार के गठन. पलकें कर्षण लागू करके, नेत्र कक्षा के बाहर ऊंचा होगा, किनारी पीछे पीछे सतह उजागर. इंजेक्शन साइट विपरीत उंगलियों के साथ एक "वी" आकार बनाकर, एक पालने आँख जब इंजेक्शन स्थिरता प्रदान करने के लिए बनाई है.
  4. धीरे कंजाक्तिवा के माध्यम से गिलास micropipette की नोक सम्मिलित, एक रक्त वाहिकाओं के रहित क्षेत्र में, और श्वेतपटल के माध्यम से एक नीचे कोण पर. आप एक छोटा "पॉप" लगता है जब विंदुक श्वेतपटल प्रवेश करना चाहिए. एक से थोड़ा नीचे कोण पर विंदुक सम्मिलित लेंस मार जब सुई डालने का मौका कम कर देता है.
  5. अब सिरिंज पकड़े व्यक्ति 2 सिरिंज पर μL निशान सवार निराशाजनक द्वारा समाधान के 4 μL इंजेक्षन चाहिए. इंजेक्शन में कुल दो सेकंड के लिए लगभग एक लेना चाहिए. एक बहुत ही धीमी दर पर इंजेक्शन> 3 सेकंड कांच कक्ष के माध्यम से समाधान की प्रारंभिक प्रसार को कम कर देता है. आप करने के लिए इंजेक्शन खुर्दबीन के नीचे शीशे कक्ष के माध्यम से निस्तब्धता समाधान देख, जिससे प्रक्रिया की सफलता की पुष्टि करने में सक्षम हो जाएगा.
  6. लगभग 5 सेकंड के लिए स्थिर micropipette पकड़ो और फिर एक ही दिशा में वापस लेने, के रूप में सुई डाला था. कंजाक्तिवा छोटे से खोलने पर वापस प्रालंब, scleral पंचर सील करने में मदद करेगा.
  7. नेत्र आँख मरहम (आँसू Naturale PM) के साथ कवर कॉर्निया की सतह के क्रम में करने के लिए वसूली के दौरान corneal सुखाने को रोकने के लिए, और एक वसूली के पिंजरे करने के लिए पशु वापसी.
  8. शल्य चिकित्सा के बाद दर्दनाशक दवाओं अपने जानवरों की देखभाल अधिकारियों के दिशा निर्देशों के अनुसार प्रशासित किया जा चाहिए, और जानवरों को ध्यान से सर्जरी के बाद निगरानी की जानी चाहिए.

5. चुनिंदा ऑप्टिक नर्व स्टंप से रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं का लक्ष्य निर्धारण

  1. ऑप्टिक तंत्रिका स्टंप tracers, दवाओं, plasmids, siRNAs या वायरल vectors लागू, निम्नलिखित axotomy, सीधे प्रतिगामी परिवहन के माध्यम से रेटिनल नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं लक्ष्य है. यह पहली बार "ऑप्टिक तंत्रिका transection प्रोटोकॉल" 22 के अनुसार एक ऑप्टिक तंत्रिका transection प्रदर्शन के द्वारा पूरा किया है.
  2. Gelfoam का उपयोग कर, या तंत्रिका ऑप्टिक में प्रत्यक्ष इंजेक्शन: वहाँ दो मुख्य तरीकों के लिए इस प्रक्रिया को पूरा कर रहे हैं.
  3. gelfoam विधि अनुरेखण प्रतिगामी के समान है, लेकिन जब ऑप्टिक तंत्रिका यह पूर्व लेबल बेहतर colliculus एक सप्ताह में प्रतिगामी tracers axotomy से पहले इंजेक्शन द्वारा रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं के लिए वांछनीय है पर प्रयोगात्मक उपचार देने. यह सेल अनुरेखण, क्योंकि कुछ मामलों में neuronal tracers प्रयोगात्मक पदार्थ या इसके विपरीत के प्रतिगामी परिवहन के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं के लिए महत्वपूर्ण है.
  4. तुरंत बाद ऑप्टिक तंत्रिका काट रहा है, प्रयोगात्मक समाधान में भिगो gelfoam का एक छोटा सा टुकड़ा transected ऑप्टिक तंत्रिका स्टंप पर रखा गया है. कक्षीय सामग्री को फिर से अपने पिछले स्थान को लौट रहे हैं. जब आँख यह संदंश का उपयोग करने के लिए कक्षा में नीचे gelfoam का टुकड़ा धक्का करने के लिए आवश्यक है, सुनिश्चित करना है कि यह ऑप्टिक तंत्रिका के अंत से अधिक रहता है एक तटस्थ स्थान में लौट रहा है.
  5. इंजेक्शन कि अक्षतंतु के cytoplasm के लिए पहुँच प्राप्त करने में retrogradely axoplasmic प्रवाह द्वारा जाया जा पदार्थों के वितरण के लिए और अधिक प्रभावी तकनीक है. यह siRNAs और plasmids, और कुछ मामलों में वायरल vectors शामिल हैं. एक 5-10 μL हैमिल्टन सिरिंज transected ऑप्टिक तंत्रिका में वांछित समाधान इंजेक्षन करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
  6. पकड़ ठीक टिप Dumont संदंश के साथ ऑप्टिक तंत्रिका के किनारे. ऑप्टिक तंत्रिका में सुई के अंत सम्मिलित करना, तंत्रिका के साथ समानांतर, जब तक बेवल नहीं रह गया है दिखाई. डाला सुई तंत्रिका द्वारा सभी पक्षों पर encased जाएगा. एक छोटी बेवेल के साथ एक सुई वांछनीय है.
  7. N एक बारeedle तंत्रिका में डाला जाता है, धीरे ठीक टिप संदंश के साथ तंत्रिका के पक्ष निचोड़ और समाधान का एक चौथाई इंजेक्षन जबकि सिरिंज एक तिमाही बारी दक्षिणावर्त या काउंटर दक्षिणावर्त rotating.
  8. 5.7 चरण दोहरा जब तक आप सुई की एक पूरी रोटेशन पूरा कर लिया है और इंजेक्शन सिरिंज के संपूर्ण सामग्री जारी रखें. सर्वोत्तम परिणामों के लिए एक gastight 10 μL हैमिल्टन सिरिंज का उपयोग कर समाधान के 10 μL की कुल इंजेक्षन.
  9. तंत्रिका से सिरिंज की नोक निकालें. अतिरिक्त इंजेक्शन तरल पदार्थ है कि कक्षा के भीतर तंत्रिका से refluxed है के रूप में इस axons की छोर से एक तेज लिए अतिरिक्त पूल फार्म का होगा छोड़ दें.
  10. अपनी मूल स्थिति के लिए कक्षीय सामग्री वापसी के लिए, घाव बंद है, और जानवर को ठीक करने के लिए अनुमति देते हैं.
  11. शल्य चिकित्सा के बाद दर्दनाशक दवाओं अपने जानवरों की देखभाल अधिकारियों के दिशा निर्देशों के अनुसार प्रशासित किया जा चाहिए, और जानवरों को ध्यान से सर्जरी के बाद निगरानी की जानी चाहिए.

6. प्रतिनिधि परिणाम:

Intraocular इंजेक्शन रेटिना में सभी कक्षों में विश्व स्तर पर लक्ष्य है, और घायल RGCs को प्रसव के पदार्थों के लिए अच्छी तरह से काम के बाद से नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं रेटिना के अंतरतम neuronal परत, कांच कक्ष के निकट में स्थित हैं. RGCs भी सीधे transected ऑप्टिक तंत्रिका स्टंप पदार्थ पहुंचाने द्वारा लक्षित किया जा सकता है. Fluorogold retrogradely लेबल RGCs चित्रा 1 में सचित्र के रूप में तंत्रिका स्टंप से पेप्टाइड्स, दवाओं, वैक्टर, plasmids, या siRNAs का उपयोग करने के लिए लक्षित किया जा सकता है है. चित्रा 1A - सी RGCs गया है कि पूर्व बेहतर colliculus में Fluorogold इंजेक्शन द्वारा लेबल के somata में एक लेबल Cy3 पेप्टाइड का स्थानीयकरण दर्शाता है. Cy3 लेबल पेप्टाइड्स axotomy के तुरंत बाद ऑप्टिक तंत्रिका में अंतःक्षिप्त थे, और रेटिना जिंदा imaged किया गया था क्रम में ऊतक के leaching बाहर से निर्धारण के दौरान पेप्टाइड्स रोकने के. चित्रा 1D - एफ Cy3 लेबल siRNAs और प्रतिगामी axotomized RGCs में Fluorogold ट्रेसर का स्थानीयकरण दर्शाता है. Cy3 लेबल siRNAs ऑप्टिक तंत्रिका स्टंप में axotomy के तुरंत बाद अंतःक्षिप्त थे और रेटिना जिंदा imaged था.

चित्रा 1
चित्रा 1 axotomy और ऑप्टिक तंत्रिका स्टंप में या तो लेबल पेप्टाइड्स या siRNAs इंजेक्शन के बाद एक दिन में flatmounted retinas में RGCs के Epifluorescence micrographs. (ए) 1 दिन postaxotomy Fluorogold axotomized RGCs में प्रतिगामी लेबलिंग (बी) लेबल पेप्टाइड्स के प्रतिगामी परिवहन, axotomy और ऑप्टिक तंत्रिका में पेप्टाइड इंजेक्शन के बाद एक दिन के बाद RGCs में Cy3 प्रतिदीप्ति. (सी) के ओवरले (ए) और (ख) Fluorogold लेबल RGCs में Cy3 लेबल पेप्टाइड्स के चयनात्मक स्थानीयकरण का प्रदर्शन. (लोमो) Fluorogold लेबल RGCs (डी) के सेल शरीर भी Cy3 लेबल (ई) siRNAs ऑप्टिक तंत्रिका स्टंप में 24 घंटे पहले इंजेक्शन, के रूप में उपरिशायी (एफ) में दिखाया के साथ भर रहे हैं. एसी में स्केल बार 50 सुक्ष्ममापी है. लोमो में स्केल बार 20 सुक्ष्ममापी है.

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Discussion

ऑप्टिक तंत्रिका transection वयस्क सीएनएस न्यूरॉन apoptosis की एक अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मॉडल है. इस पांडुलिपि में प्रदर्शन प्रयोगात्मक जोड़तोड़ चोट के बाद RGC apoptosis के तंत्र के अध्ययन की अनुमति.

Intraocular इंजेक्शन रेटिना की वैश्विक लक्ष्यीकरण के लिए उपयोगी होते हैं. यह प्रक्रिया कुछ अभ्यास की आवश्यकता है, के रूप में यह महत्वपूर्ण है ग्लास विंदुक टिप के साथ लेंस घायल नहीं. वृद्धि कारकों की रिहाई के कारण, सेल अस्तित्व और 20 उत्थान, 21 फेरबदल लेंस नुकसान दिखाया गया है . यह भी ध्यान से सम्मिलित करते हैं और कांच विंदुक टिप की दिशा करने के लिए समानांतर वापस लेने के लिए महत्वपूर्ण है. ग्लास विंदुक टिप पर कोई पार्श्व बल एक गिलास टुकड़ा कारण कांच लेंस या रेटिना हानिकारक कक्ष में प्रवेश कर सकते हैं. एक टिप है कि बहुत ठीक है के साथ एक विंदुक का प्रयोग चिपचिपा समाधान की डिलीवरी नहीं की अनुज्ञा दे सकेगा. इसके अलावा, एक अत्यंत ठीक टिप स्पर्श राय नहीं दे जब श्वेतपटल गलती लेंस puncturing के मौका बढ़ती पंचर करता है. लेंस स्पष्ट और मुक्त किसी भी पंचर के निशान से रहना चाहिए जब खुर्दबीन के नीचे देखा. यदि लेंस क्षतिग्रस्त है, एक मोतियाबिंद अक्सर फार्म और लेंस खत्म बादल जाएगा और इन प्रयोगात्मक परिणाम बाहर रखा जाना चाहिए.

सिरिंज प्रणाली सबसे अच्छा काम करता है जब वहाँ कोई हवा पथ साथ वर्तमान बुलबुले हैं. एयर विस्तार और समाधान वापसी या प्रसव की जवाबदेही घटते सेक कर सकते हैं. यदि हवा बुलबुले दिखाई दे रहे हैं, उन्हें भड़काना सिरिंज और खनिज तेल के साथ बाहर फ्लश. संपीड़न फिटिंग के साथ दोहरी आर.एन. गिलास अनुकूलक विंदुक बदलते विभिन्न जानवरों, उपचार, या टूटना के मामले में के बीच कुशल बनाता है. इस प्रणाली मजबूत है और पिछले कई वर्षों से पहले ferrules के लिए जगह के रूप में लंबे समय के रूप pipettes सावधानी से डाला जाता है की जरूरत है.

सीधे ऑप्टिक तंत्रिका इंजेक्शन द्वारा RGCs लक्ष्यीकरण कुछ caveats के साथ एक काफी जल्दी प्रक्रिया है. यदि ऑप्टिक तंत्रिका स्टंप बहुत छोटा है, यह इंजेक्शन कठिन बना देता है. एक छोटी स्टंप भी मौका है कि सुई ऑप्टिक तंत्रिका सिर के पास रेटिनल वाहिकाओं को नुकसान के रूप में यह बेवेल के स्तर के लिए डाला जाता है बढ़ जाती है. इस प्रकार, लंबाई में लगभग 2 मिमी की एक ऑप्टिक तंत्रिका स्टंप वांछनीय है जब इस तकनीक के साथ तंत्रिका इंजेक्शन प्रदर्शन. इंजेक्शन सबसे अच्छा काम है जब सिरिंज के बेवल ऑप्टिक तंत्रिका के भीतर पूरी तरह से संलग्न है. केयर तंत्रिका के पक्ष के माध्यम से सुई टिप पारित नहीं के रूप में यह कम प्रतिरोध का एक क्षेत्र बनाता है, तरल पदार्थ इंजेक्शन साइट जिससे इंजेक्शन के प्रभाव को कम से बाहर निकलने के लिए अनुमति देता है लिया जाना चाहिए.

जब वायरल कणों या बदल कोशिकाओं के रूप में संभावित biohazards के साथ काम, यह संस्थागत दिशा निर्देशों और सुरक्षा प्रक्रियाओं का पालन करने के लिए महत्वपूर्ण है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

पी डी CIHR ऑपरेटिंग अनुदान (86,523 एमओपी) द्वारा समर्थित है

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stereotaxic Frame Stoelting Co.
Rat Gas Mask Stoelting Co.
Anesthesia System VetEquip 901806
Isoflurane (PrAErrane) Baxter Internationl Inc. DIN 02225875
Surgical Microscope WPI, Zeiss, Leica
Alcaine Eye Drops Alcon
Tears Naturale P.M. Alcon
Fine tip Dumont forceps Fine Science Tools 11252-00
10 μl Hamilton Syringe (1701RN; 26s/2”/2) Hamilton Co 80030
1/16 inch Compression Fittings Hamilton Co 55751-01
1/16 inch OD, 0.010 inch ID, PEEK Tubing Supelco, Sigma-Aldrich Z226661
Dual RN Glass Coupler Hamilton Co 55752-01
Mineral Oil Priming Kit: includes syringe, needles, rubber septa Hamilton Co PRMKIT

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तंत्रिका विज्ञान 51 अंक केन्द्रीय तंत्रिका तंत्र रेटिना नाड़ीग्रन्थि सेल Axotomy ऑप्टिक तंत्रिका transection intraocular इंजेक्शन तंत्रिका स्टंप अभिकर्मक वायरल वेक्टर लघु दखल शाही सेना

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Formal Correction: Erratum: Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS
Posted by JoVE Editors on 05/31/2011. Citeable Link.

A correction was made to Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS. There was an error in the order of the authors. The authors ordering has been corrected to:

Philippe M. D'Onofrio, Mark M. Magharious, Paulo D. Koeberle

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Mark M. Magharious, Philippe M. D'Onofrio, Paulo D. Koeberle

प्रयोगात्मक अभिव्यक्ती के लिए स्तनधारी CNS में ऑप्टिक तंत्रिका transection के बाद के तरीके
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D'Onofrio, P. M., Magharious, M. M., … More

D'Onofrio, P. M., Magharious, M. M., Koeberle, P. D. Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS. J. Vis. Exp. (51), e2261, doi:10.3791/2261 (2011).

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