Metodi per manipolazioni sperimentali dopo resezione del nervo ottico nel sistema nervoso centrale dei mammiferi

Summary

Resezione del nervo ottico è un modello ampiamente utilizzato degli adulti lesioni del SNC. Questo modello è ideale per eseguire una serie di manipolazioni sperimentali che colpiscono la retina globalmente o direttamente alla popolazione bersaglio feriti neuronale delle cellule gangliari retiniche.

Abstract

Cellule gangliari della retina (RGCs) sono i neuroni del SNC che in uscita le informazioni visive dalla retina al cervello attraverso il nervo ottico. Il nervo ottico si può accedere nell'orbita dell'occhio e completamente sezionato (axotomized), tagliando gli assoni di tutta la popolazione RGC. Resezione del nervo ottico è un modello riproducibile di apoptosi morte delle cellule neuronali del sistema nervoso centrale adulto ^1-4. Questo modello è particolarmente interessante perché la camera vitreo dell'occhio agisce come una capsula per la somministrazione di farmaci alla retina, permettendo manipolazioni sperimentali attraverso iniezioni intraoculari. La diffusione di sostanze chimiche attraverso il fluido vitreo assicura che agiscono su tutta la popolazione RGC. Vettori virali, plasmidi o breve RNA interferenti (siRNA) può anche essere consegnata alla camera vitrea allo scopo di infettare o trasfezione delle cellule della retina ^5-12. Il tropismo alto virus adeno-associato (AAV) vettori è vantaggioso per RGCs bersaglio, con un tasso di infezione si avvicina al 90% delle cellule in prossimità del sito di iniezione ^{6, 7, 13-15.} Inoltre, RGCs possono essere selettivamente trasfettate mediante l'applicazione di siRNA, plasmidi o vettori virali per la fine taglio del nervo ottico ^16-19 o vettori iniettando nelle loro obiettivo il collicolo superiore ^10. Questo permette ai ricercatori di studiare i meccanismi apoptotici nella popolazione neuronale feriti senza effetti confondenti sui neuroni spettatore o glia circostante. RGC apoptosi è una caratteristica tempo-corso in cui viene ritardata la morte delle cellule postaxotomy 3-4 giorni, dopo di che le cellule degenerano rapidamente. Ciò fornisce una finestra per manipolazioni sperimentali diretti contro meccanismi coinvolti nella apoptosi. Manipolazioni che riguardano direttamente il RGCs dal tronco sezionato nervo ottico vengono eseguiti al momento della assotomia, subito dopo il taglio del nervo. Al contrario, quando le sostanze vengono consegnati attraverso un percorso intraoculare, che può essere iniettata prima dell'intervento o entro i primi 3 giorni dopo l'intervento, che precede l'avvio di apoptosi nelle RGCs axotomized. Nel presente articolo, dimostriamo diversi metodi per manipolazioni sperimentali dopo resezione del nervo ottico.

Protocol

1. Tecnica chirurgica

1. Gli esperimenti deve essere effettuata usando tecniche asettiche e seguendo i protocolli di uso di animali della vostra istituzione specifica. Strumenti e materiali (soluzioni, sostanze in esame, traccianti, aghi, ecc), entrando in contatto con tessuti vivi, devono essere sterili per prevenire l'infezione e impatti negativi sul benessere degli animali e il potenziale impatto negativo sullo studio.

2. Anestesia

1. I ratti saranno anestetizzati con un sistema veterinario vaporizzatore isoflurano. Usare l'ossigeno per uso medico a una velocità di 0,8 L / min per vaporizzare il gas isoflurano. Posto l'animale nella casella di anestesia attaccato e comporre in una concentrazione di isoflurano del 4% fino a quando il respiro si è rallentato e l'animale è calmo.
2. Quindi, interruttore il flusso di gas per l'attaccamento maschera antigas per il telaio stereotassico e posto l'animale in dell'apparato stereotassico. Girare la concentrazione di isofluorano al 2% e monitorare l'anestesia. Animali più grandi (> 300g) può richiedere una maggiore concentrazione di isoflurano. L'anestesia deve essere monitorata durante l'intervento chirurgico e il dosaggio isoflurano aggiustato di conseguenza. La profondità e la velocità di respirazione deve essere costantemente valutata e un pizzico di valutazione tep (ogni 5 minuti) per l'assenza di dolore profondo deve essere eseguito.
3. Una volta che l'operazione è completata, spegnere l'isoflurano e permettere all'animale di respirare ossigeno per alcuni minuti prima della rimozione dal dispositivo stereotassico. La temperatura corporea deve essere mantenuta coprendo l'animale con una coperta chirurgico e / o utilizzando una coperta riscaldamento regolabile durante l'intervento.

3. Preparazione siringa per iniezioni intraoculari

1. Per prima cosa, montare il sistema siringa per effettuare le iniezioni intraoculari. A 10 L RN 1701 a tenuta di gas siringa Hamilton è utilizzato per l'iniezione. Rimuovere eventuali ago o RN presenti dado alla fine della siringa.
2. Inserire il puntale PFA nella coppa PEEK ghiera del raccordo. Quindi inserire il raccordo completo nella parte finale della siringa e vagamente avvitare il dado RN sopra la parte superiore.
3. Inserire un'estremità del tubo in PEEK 1 / 16 pollice nel raccordo di compressione, attraverso l'apertura nel dado RN. Assicurarsi che il tubo PEEK è completamente inserito. Serrare il dado RN di comprimere il puntale, sigillando il tubo PEEK.
4. Eseguire il passaggio 3.2 a entrambe le estremità del doppio attacco bicchiere RN. Collegare l'estremità libera del tubo PEEK a un'estremità del doppio attacco bicchiere RN serrando il dado RN.
5. Una micropipetta di vetro tirato formeranno l'ago e botte per il sistema di iniezione. Usare 1,5 mm di diametro tubi di spessore di pareti di vetro capillare per fabbricare le pipette di vetro, e inserire la pipetta di vetro nella estremità libera del doppio attacco bicchiere RN. Serrare il dado RN per fissare la pipetta in posizione.
6. La punta fine di micropipette di vetro tirato è solitamente troppo piccolo per l'esecuzione di iniezioni intraoculari. Al fine di creare una punta di diametro opportuno, rompere la punta della pipetta di vetro sotto la guida visiva, utilizzando un microscopio operatorio. La fine smerigliata di un vetrino di vetro si adatta bene a rompere la pipetta. Tenere la pipetta in un angolo e strofinare la punta lungo la glassa di vetro per creare una pausa. Idealmente, la punta finale dovrebbe essere leggermente smussati. Potrebbero essere necessari alcuni tentativi per produrre un buon consiglio, in modo da tirare pipette multiple prima dell'uso.
7. Il sistema di iniezione è di tipo idraulico. Pertanto, la siringa, tubi linker PEEK, Dual RN accoppiatore vetro e la micropipetta di vetro devono essere riempiti con olio minerale prima dell'uso. Utilizzando il kit di adescamento da Hamilton siringa Co. (PRMKIT), riempire la siringa di attivazione con olio minerale. Utilizzare un ago di grande diametro per consentire il passaggio facile del petrolio viscoso. Sostituire l'ago con l'ago 90030 Hamilton che si inserisce all'interno del cilindro della siringa 10 L Hamilton. Quindi, posto un setto di gomma sopra l'ago 90030 Hamilton, al fine di fornire un sigillo durante l'iniezione dell'olio minerale.
8. Inserire l'ago 90030 Hamilton della siringa di attivazione nella parte posteriore del cilindro della siringa Hamilton 10 L del sistema di iniezione. Premere il setto strettamente contro l'estremità della siringa per creare un sigillo.
9. Premere lentamente lo stantuffo. Si vedrà il passaggio di olio minerale attraverso gli elementi di vetro del sistema di iniezione e, infine, riempiendo la pipetta di vetro. Spingere tutto il petrolio attraverso il sistema di iniezione in modo da eliminare eventuali bolle d'aria lungo il tratto. Se la siringa è a corto di olio minerale, estrarre lentamente l'ago mentre costantemente l'erogazione dell'olio per evitare la formazione di bolle d'aria. Riempire la siringa di attivazione e iniettare di nuovo.
10. Quando l'intero sistema è riempito con olio minerale e bolle libero, inserire il pistone originale della siringa 10 L Hamilton. Spingere il pistone fino alla fine del suo viaggio al fine di rimuovere l'olio minerale aggiuntivi dal sistema. Pulire il vetro micropipetta pulito e la fine della siringa pulita con etanolo al 70%.
11. Prelievi dagliw lo stantuffo della siringa per la soglia del 2 microlitri sulla canna. La fine della micropipetta di vetro si riempirà con l'aria che fornisce una zona cuscinetto tra l'olio minerale e il liquido desiderato da iniettare. La canna pipetta può essere riempito da collocare alla fine della micropipetta nella soluzione desiderata e ritirare lo stantuffo della siringa Hamilton. Non iniettare più di 4-5 ml di soluzione in un occhio ratto adulto.

4. Iniezione intraoculare Procedura: Targeting la Retina Globalmente

1. Con l'animale anestetizzato e fissato nella cornice stereotassica (come descritto nella Sezione 2), l'uso degli occhi Alcaine gocce per anestetizzare topica della cornea. Aprire le palpebre con le dita e mettere una goccia della soluzione di anestetico sulla superficie della cornea.
2. Iniezione richiede due persone: una per inserire la pipetta di vetro nella camera di vitreo e mantenere la posizione di pipetta, e un altro a deprimere lo stantuffo sulla siringa che offre la soluzione desiderata.
3. Sotto un microscopio chirurgico, afferrare il bicchiere micropipetta e Dual accoppiatore RN vetro con le dita. Stendere le palpebre con le dita della mano libera, formando una forma a "V" di fronte al sito di iniezione. Applicando una trazione alle palpebre, l'occhio sarà elevata dalla orbita, esponendo la superficie posteriore dietro il limbus. Creando una forma a "V" con le dita di fronte al sito di iniezione, una culla è formata per l'occhio che fornisce stabilità durante l'iniezione.
4. Inserire delicatamente la punta della micropipetta di vetro attraverso la congiuntiva, in una zona priva di vasi sanguigni, e attraverso la sclera, in un angolo verso il basso. Dovreste sentire un piccolo "pop" quando la pipetta penetra la sclera. Inserimento della pipetta con un angolo leggermente verso il basso riduce la possibilità di colpire la lente quando si inserisce l'ago.
5. La persona che detiene la siringa dovrebbe iniettare i 4 ml di soluzione premendo il pistone per il segno 2 microlitri sulla siringa. L'iniezione dovrebbe durare circa 1-2 secondi in totale. Iniettando ad un ritmo molto lento> 3 secondi riduce la diffusione iniziale della soluzione attraverso la camera vitrea. Sarete in grado di vedere la soluzione di lavaggio iniettato attraverso la camera vitrea sotto il microscopio, in modo da verificare il successo della procedura.
6. Tenere la micropipetta stabile per circa 5 secondi e poi ritirare, nella stessa direzione come l'ago è stato inserito. La congiuntiva si lembo ripercorrere la piccola apertura, contribuendo a sigillare la puntura sclerale.
7. Coprire la superficie della cornea con pomata oftalmica occhio (Tears Naturale PM) al fine di prevenire l'essiccazione della cornea durante il recupero, e rispedire l'animale in una gabbia di recupero.
8. Post-chirurgica analgesici devono essere somministrati secondo le linee guida delle autorità animali vostre cure, e gli animali devono essere attentamente monitorati dopo l'intervento chirurgico.

5. Selettivamente cellule gangliari della retina dal tronco nervo ottico

1. L'applicazione di traccianti, droghe, plasmidi, siRNA o vettori virali per moncone del nervo ottico, seguito assotomia, obiettivi direttamente le cellule gangliari della retina attraverso il trasporto retrogrado. Questo si ottiene primo che esegue una resezione del nervo ottico secondo il "protocollo Optic Nerve transezione" ^22.
2. Ci sono due metodi principali per realizzare questa procedura: utilizzando Gelfoam, o iniezione diretta nel nervo ottico.
3. Il metodo è simile a Gelfoam retrograda tracciamento, tuttavia quando offrendo trattamenti sperimentali al nervo ottico è auspicabile pre-etichettare le cellule gangliari della retina, iniettando traccianti retrogradi nel collicolo superiore 1 settimana prima della assotomia. Questo è importante per il tracciamento delle cellule in quanto, in alcuni casi traccianti neuronali possono interferire con il trasporto retrogrado di sostanze sperimentali o viceversa.
4. Subito dopo il nervo ottico viene tagliato, un piccolo pezzo di Gelfoam imbevuto nella soluzione sperimentale è posto sopra il tronco sezionato nervo ottico. I contenuti orbitali sono poi tornati alla loro posizione precedente. Quando l'occhio è tornato a una posizione neutrale, è necessario usare il forcipe per spingere il pezzo di Gelfoam giù nell'orbita, assicurando che essa rimanga sopra l'estremità del nervo ottico.
5. La tecnica di iniezione è più efficace per la consegna di sostanze che devono accedere al citoplasma dell'assone per essere trasportati dal flusso retrogrado axoplasmic. Questo include siRNA e plasmidi, e in alcuni casi vettori virali. Una siringa 5-10 microlitri Hamilton è usata per iniettare la soluzione desiderata nel nervo ottico transected.
6. Afferrare il bordo del nervo ottico con sottile punta Dumont pinze. Inserire l'estremità del l'ago nel nervo ottico, in parallelo con il nervo, fino a quando la coppia conica non è più visibile. L'ago inserito sarà racchiuso da tutti i lati dal nervo. Un ago con uno smusso breve è auspicabile.
7. Una volta che il needle viene inserito nel nervo, premere delicatamente i lati del nervo con le pinze punta fine e iniettare un quarto della soluzione durante la rotazione della siringa un quarto di giro in senso orario o antiorario.
8. Continua a ripetere Passo 5,7 fino a completare una rotazione completa del ago e iniettato l'intero contenuto della siringa. Per ottenere i migliori risultati iniettare un totale di 10 ml di soluzione con una tenuta di gas siringa da 10 microlitri Hamilton.
9. Rimuovere la punta della siringa dal nervo. Lasciare l'eccesso di liquido iniettato che ha reflusso dal nervo all'interno dell'orbita in quanto ciò forma un ulteriore fondo per l'assorbimento da parte le estremità degli assoni.
10. Restituire il contenuto orbitale alla loro posizione originale, chiudere la ferita e permettere all'animale di recuperare.
11. Post-chirurgica analgesici devono essere somministrati secondo le linee guida delle autorità animali vostre cure, e gli animali devono essere attentamente monitorati dopo l'intervento chirurgico.

6. Rappresentante dei risultati:

Iniezioni intraoculari obiettivo di tutte le cellule della retina a livello globale, e sono perfetti per le sostanze consegna RGCs feriti dall'inizio cellule gangliari si trovano nello strato più interno neuronali della retina, adiacente alla camera vitrea. RGCs possono anche essere direttamente interessati dalle sostanze fornendo al moncone sezionato nervo ottico. RGCs Fluorogold retrogrado etichettati possono essere mirati con peptidi, farmaci, vettori, plasmidi, o siRNA dal tronco del nervo, come illustrato nella figura 1. Figura 1A-C dimostra la localizzazione di un peptide Cy3 etichettato nel somata di RGCs che sono stati pre-etichettati, iniettando Fluorogold nel collicolo superiore. Cy3 peptidi etichettati sono state iniettate nel nervo ottico, subito dopo assotomia, e la retina è stato ripreso in vita per evitare che i peptidi di lisciviazione del tessuto durante la fissazione. Figura 1D-F dimostra la localizzazione di Cy3 siRNA etichettati e il tracciante retrogrado Fluorogold in RGCs axotomized. Cy3 siRNA etichettati sono stati iniettati nel tronco del nervo ottico subito dopo assotomia, e la retina è stato ripreso in vita.

Figura 1. Micrografie epifluorescenza di RGCs in retine flatmounted a 1 giorno dopo assotomia e l'iniezione di due peptidi etichettati o siRNA nel tronco del nervo ottico. (A) Fluorogold marcatura retrograda in RGCs axotomized a 1 giorno postaxotomy (B) Cy3 fluorescenza in seguito RGCs trasporto retrogrado di peptidi etichettati, 1 giorno dopo assotomia e l'iniezione del peptide nel nervo ottico. (C) Sovrapposizione di (A) e (B) dimostrare la localizzazione selettiva di peptidi Cy3 etichettate in RGCs Fluorogold etichettati. (DF) I corpi cellulari dei Fluorogold RGCs etichettati (D) sono pieni di Cy3 siRNA etichettati (E) iniettato nel tronco del nervo ottico 24 ore prima, come mostrato nella sovrapposizione (F). Barra di scala in CA è di 50 micron. Barra di scala nel DF è di 20 micron.

Discussion

Resezione del nervo ottico è un modello estremamente riproducibile di adulti apoptosi neuronale del SNC. Le manipolazioni sperimentali hanno dimostrato in questo manoscritto permesso lo studio dei meccanismi di apoptosi RGC dopo l'infortunio.

Iniezioni intraoculari sono utili per indirizzare globale della retina. Questa procedura richiede una certa pratica, in quanto è fondamentale per non ferire l'obiettivo con la punta della pipetta di vetro. Danno al cristallino ha dimostrato di causare il rilascio di fattori di crescita, alterando la sopravvivenza delle cellule e la rigenerazione ^{20, 21.} E 'anche importante inserire con attenzione e ritirare la pipetta di vetro parallele alla direzione della punta. Qualsiasi forza laterale sulla punta della pipetta di vetro può causare un frammento di vetro per entrare nella camera vitrea di danneggiare la lente o retina. Utilizzando una pipetta con una punta che è troppo fine può non permettere la consegna di soluzioni viscose. Inoltre, una punta estremamente fine non dare un feedback tattile quando la sclera è perforato aumentando il rischio di puntura accidentale della lente. L'obiettivo deve rimanere chiaro e libero da qualsiasi segni di puntura quando osservate al microscopio. Se l'obiettivo è danneggiato, una cataratta spesso forma e l'obiettivo sarà appannarsi e questi risultati sperimentali devono essere escluse.

Il sistema siringa funziona al meglio quando non ci sono bolle d'aria presenti lungo il tratto. L'aria può espandere e comprimere diminuire la reattività del ritiro soluzione o di consegna. Se le bolle d'aria sono visibili, sciacquarli con la siringa di attivazione e olio minerale. Il Dual adattatore RN vetro con raccordi a compressione fa cambiare la pipetta efficiente tra diversi animali, trattamenti, o, nel caso di una rottura. Questo sistema è robusto e durerà molti anni prima le boccole devono essere sostituiti, a patto che pipette sono accuratamente inseriti.

Direttamente targeting RGCs iniettando il nervo ottico è una procedura abbastanza veloce con alcune precisazioni. Se il moncone del nervo ottico è troppo breve, rende le iniezioni difficile. Un ceppo breve aumenta anche la probabilità che l'ago può danneggiare i vasi retinici vicino alla testa del nervo ottico in quanto è inserito al livello della smussatura. Così, un ceppo del nervo ottico di circa 2 mm di lunghezza è auspicabile durante l'esecuzione di iniezioni di coraggio con questa tecnica. Le iniezioni funzionano meglio quando lo smusso della siringa è completamente racchiuso all'interno del nervo ottico. Bisogna fare attenzione a non passare la punta dell'ago attraverso il lato del nervo come questo crea una regione di bassa resistenza, consentendo al liquido di uscire dal sito di iniezione diminuendo così l'efficacia dell'iniezione.

Quando si lavora con materiali potenzialmente infetti come particelle virali o di cellule trasformate, è importante seguire le linee guida istituzionali e procedure di sicurezza.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereotaxic Frame	Stoelting Co.
Rat Gas Mask	Stoelting Co.
Anesthesia System	VetEquip	901806
Isoflurane (PrAErrane)	Baxter Internationl Inc.	DIN 02225875
Surgical Microscope	WPI, Zeiss, Leica
Alcaine Eye Drops	Alcon
Tears Naturale P.M.	Alcon
Fine tip Dumont forceps	Fine Science Tools	11252-00
10 μl Hamilton Syringe (1701RN; 26s/2”/2)	Hamilton Co	80030
1/16 inch Compression Fittings	Hamilton Co	55751-01
1/16 inch OD, 0.010 inch ID, PEEK Tubing	Supelco, Sigma-Aldrich	Z226661
Dual RN Glass Coupler	Hamilton Co	55752-01
Mineral Oil Priming Kit: includes syringe, needles, rubber septa	Hamilton Co	PRMKIT