Summary
ويسجل من القنوات الأيونية الحالية باستخدام تقنيات المشبك BK التصحيح. وأعرب في قنوات BK
Abstract
ويهدف البروتوكول المقدمة هنا لدراسة تفعيل تصرف كبير ، والجهد وكا 2 + تنشيط K + (BK) القنوات. ويمكن أيضا أن تستخدم بروتوكول لدراسة العلاقة بين الهيكل وظيفة أخرى لقنوات ايون ومستقبلات الناقل العصبي 1. وأعرب على نطاق واسع في أنسجة BK قنوات مختلفة ، وتورطت في العديد من الوظائف الفسيولوجية ، بما في ذلك تنظيم تقلص العضلات الملساء ، وضبط التردد لخلايا الشعر والتنظيم الداخلي للإفراج العصبي 2-6. يتم تنشيط قنوات BK بواسطة الاستقطاب غشاء الخلايا ، والكالسيوم والمغنيسيوم 2 + 2 + 6-9. ولذلك ، تم تصميم بروتوكول للسيطرة على كل من الجهد والحل غشاء الخلايا. في هذا البروتوكول ، ويتم حقن الحمض النووي الريبي رسول قنوات BK في البويضات المورق القيطم (V - المرحلة السادسة) ، يليه 2-5 أيام من الحضانة عند 18 درجة مئوية 10-13. يتم رفعه بقع الغشاء الذي يحتوي على واحد أو عدة قنوات BK مع التكوين من الداخل إلى الخارج باستخدام تقنيات المشبك التصحيح 10-13. هو perfused الجانب الخلايا من التصحيح المطلوب مع حلول أثناء التسجيل بحيث يمكن فحص تفعيل قناة تحت ظروف مختلفة. لتلخيص ، يتم حقن مرنا من القنوات BK في البويضات المورق القيطم قناة للتعبير عن البروتينات على غشاء البويضة ، وتستخدم تقنيات المشبك التصحيح لتسجيل التيارات المتدفقة عبر قنوات تحت الجهد للرقابة والحلول داخل الخلايا.
Protocol
1. حقن مرنا في البويضات
- حقن 0،05-50 نانوغرام رسول الحمض النووي الريبي التي تم نسخها في البويضات في المختبر المورق القيطم (V - المرحلة السادسة) باستخدام Nanoject الثاني التلقائي نانولتر الحاقن (دروموند الشركة العلمية ، ونموذج 3-000-204). تكرار الحقن على البويضات عشرة لكل مرنا.
- شطف البويضات باستخدام حقن مرتين ND - 96 حل (96 ملي مول كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم ، والسيد 58.44 غرام / مول) ، 2 كلوريد البوتاسيوم ملم (بوكل ، السيد 74.56 غرام / مول) ، و 1.8 ملي مول كلوريد الكالسيوم (CaCl 2 • 2H 2 O السيد 147.02) (1) ، كلوريد المغنيسيوم ملم (MgCl 2 • 6H 2 O ، والسيد 203.31 غ / مول) ، 5 مم 4 -- (2 - هيدروكسي إيثيل) - 1 - piperazineethanesulfonic حمض (HEPES السيد 238.31 غ / مول) ، و 2.5 ملي البيروفات الصوديوم (السيد 110.04 غ / مول) ، والبنسلين 1X - الستبرتوميسين. الهيدروجيني 7.6) ، ثم ضع عليها في لوحة الثقافة واحتضان عند 18 درجة مئوية لمدة أيام + 2.
2. إعداد نظام الإرواء
التوضيح للنظام أتمتة ValveLink الارواء 16. نظام الارواء يستخدم النيتروجين الضغط لدفع الحلول نضح من الخزانات الحل ، من خلال شبكة أنابيب التروية ، وقلم رصاص ونضح طرف. يتم التحكم في تدفق تيار من كل حل الارواء بواسطة صمام خزان واحد وصمام الالكترونية. في هذا البروتوكول ، واحدة من الخزانات ليست مضغوطة ووظائفها ، وهواة جمع النفايات ، فضلا عن آلية الضغط الافراج عنهم. (صورة مقتبسة من موقع http://www.autom8.com البائع)
- توصيل الأنابيب إلى قلم الارواء. بدوره على وحدة تحكم إلكترونية وصمام فتح الصمامات الالكترونية.
- للتأكد من أن الأنابيب وقلم نضح خالية من فقاعات الهواء وتسد ، ودفع منزوع الأيونات (DI) أنابيب المياه من خلال استخدام كل حقنة مملوءة بالماء منزوع الأيونات.
- توصيل الأنابيب إلى الخزانات الحل وفتح صمام اسطوانة غاز النتروجين لتطبيق الضغط.
- فتح صمام لملء خزان الأنبوب مع الحل الخزان. نفض الغبار صمام خزان لإزالة الفقاعات في الحل إذا لزم الأمر. إغلاق صمام بعد ملء الأنبوب مع الحل.
- ملء غيض نضح بالماء والمسمار وضعها على اللوحة ، قلم من نضح. يجب الحرص على عدم اعتراض أي فقاعات عند توصيل معلومات سرية.
- إصلاح قلم نضح إلى مرحلة استخدام حمام الطين النمذجة. تأكد من غيض نضح في مساحة الحمام. يتم الآن تعيين نظام نضح أعلى.
- إضافة DI المياه في حوض الاستحمام. تأكد من الحافة المغمورة نضح في الماء.
- اختبار كل حل نضح يخرج من غيض نضح بشكل صحيح. إغلاق صمام الالكترونية متصلة أنابيب من هواة جمع النفايات وفتح صمام للحل نضح في وقت واحد (140 ملي هيدروكسيد البوتاسيوم (KOH ، M ص 56.1 غرام / مول) ، و 20 ملم 4 -- (2 - هيدروكسي إيثيل) -1 -- piperazineethanesulfonic حمض (HEPES ، M ص 238.31 غ / مول) ، 2 كلوريد البوتاسيوم ملم (بوكل ، م ص 74،56 غ / مول) ، 1 الايثيلين جلايكول ملي مكرر (2 - aminoethylether) - N ، N ، N '، N' - tetraacetic حمض (EGTA ، M ص 380.35 غ / مول) ، ويتم تعديل درجة الحموضة إلى 7،1-7،2 بواسطة حامض methanesulfonic (MESO 3 ، ص 96،1 م غ / مول) ، كا 2 + او + Mg2 إضافة الى التركيز المطلوب عند الحاجة). تحت المجهر ، ومراقبة الطائرة نضح السوائل التي تخرج من الطرف الارواء. إغلاق صمام حل نضح وفتح صمام لجمع النفايات. ينبغي أن تختفي طائرة نضح تقريبا. تكرار نفس الاختبار لجميع الحلول والارواء.
- عندما يكون لديك التحقق من أن جميع الحلول نضح تدفق بشكل صحيح ، استبدال DI المياه في الحمام مع الحل حمام (140 ملي هيدروكسيد البوتاسيوم (KOH ، M ص 56.1 غرام / مول) ، و 20 ملم 4 -- (2 - هيدروكسي إيثيل) - 1 - piperazineethanesulfonic حمض (HEPES ، M ص 238.31 غ / مول) ، 2 كلوريد البوتاسيوم ملم (بوكل ، م ص 74،56 غ / مول) ، ويتم تعديل درجة الحموضة إلى 7،1-7،2 بواسطة حامض methanesulfonic (MESO 3 ، ص 96،1 م ز / مول)).
3. التصحيح المشبك
- Recoat القطب تسجيل حج مع AgCl قبل كل التصحيح لقط الدورة. أولا ، ازالة الاسلاك الكهربائي من حامل ماصة ويغرق النصف غيض من السلك الكهربائي في قارورة تحتوي على مواد التبييض جديدة لما لا يقل عن 15 دقيقة. هذه الودائع طبقة من AgCl على السلك.
- شطف السلك الكهربائي مع الماء منزوع الأيونات وصمة عار الجافة. ثم تثبيت القطب حج / AgCl الظهر في حامل ماصة.
- توصيل حمام (المرجع) إلى القطب headstage وضعه في حوض الاستحمام. تستعد هذه الأقطاب للتسجيل.
- تستعد الآن للحصول على البيانات. بدوره على الكمبيوتر والمكونات الرئيسية للجهاز في منفذ الطابعة من جهاز الكمبيوتر الخاص بك. يجب أن يكون مفتاح الجهاز موصول لك استخدام البرنامج للحصول على البيانات ، وهو HEKA النبض.
- التبديل على مكبر للصوت (أكسون الصكوك الذخائر المتروكةPATCH 200B) وبدء نبض HEKA. تحميل ملف البروتوكول وضبط إعدادات التكوين ، مثل مقياس التحفيز. هدف لتعديل إعدادات التكوين هو أن أؤكد أن إمكانية اختبار تساوي بالضبط إمكانات القيادة. تستعد هذه المعدات الحصول على البيانات.
- تحضير البويضات. يغرق البويضة في حل تجريد (200 ملي N - ميثيل - D - glucamine (NMG ، M ص 195.22 غ / مول) ، 200 ملي الأسبارتات (لا K +) (M ص 133.1 غ / مول) ، وكلوريد البوتاسيوم 2 ملم (بوكل ، م ص 74،56 غ / مول) ، و 10 ملي جلايكول الإثيلين مكرر (2 - aminoethylether) - N ، N ، N '، N' - tetraacetic حمض (EGTA ، M ص 380.35 غ / مول) ، 1 كلوريد المغنيسيوم ملم (MgCl 2 • 6H 2 O ، M ص 203.31 غ / مول) ، و 10 ملم 4 -- (2 - هيدروكسي إيثيل) - 1 - piperazineethanesulfonic حمض (HEPES ، M ص 238.31 غ / مول) ، ويتم تعديل درجة الحموضة إلى 7.4 بواسطة هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم ، M ص 40.0 غرام / مول) لمدة 5 -- 10 دقائق الحل تجريد يفصل الغشاء المحي من غشاء البلازما مما يجعل من الممكن لتجريد الغشاء المحي.
- الشريط برفق الغشاء المحي من البويضة باستخدام اثنين من أزواج من الملقط. والبويضة devitellinized هش للغاية ، ولذا ينبغي أن يكون كما تحركت قليلا عند الضرورة.
- مع الحرص على منع تعريض البويضة devitellinized فقاعات في الهواء ، أو استخدم ماصة زجاجية مملوءة بمحلول بما فيه الكفاية لنقل البويضة إلى الحمام. تستعد هذه البويضة للتسجيل.
- إعداد ماصات التصحيح. سحب الماصات الزجاج بعد إدخال أنبوب زجاجي الشعرية (VWR الدولية ، القط # 53432-921) في سوتر P - 97 يلهب / براون Micropipette بولير. مراقبة ماصات تحت المجهر لتحديد شكل نصيحة وقطر الافتتاح. ينبغي أن يكون قطرها افتتاح 2-4 ميكرومتر.
- بالسعة الحالية للحد من خلال تسجيل ولضمان سلاسة الحافة ، ومعطف غيض بالشمع ثم البولندية النار عليه.
- ملء غيض من خلال وضع ماصة غيض من ماصة داخل حل ماصة (140 ملي هيدروكسيد البوتاسيوم (KOH ، M ص 56.1 غرام / مول) ، و 20 ملم 4 -- (2 - هيدروكسي إيثيل) - 1 - piperazineethanesulfonic حمض (HEPES ، M ص 238.31 غ / مول) ، 2 كلوريد البوتاسيوم ملم (بوكل ، م ص 74،56 غ / مول) ، 2 كلوريد المغنيسيوم ملم (MgCl 2 • 6H 2 O ، M ص 203.31 غ / مول) ، ويتم تعديل درجة الحموضة إلى 7،1-7،2 بواسطة methanesulfonic حمض (MESO 3 ، ص 96،1 م ز / مول)) والرسم الغطاس. هذا غيض يبلل.
- ملء ماصة 03/01 الحل الكامل مع ماصة باستخدام محقنة ووضع ماصة في حامل ماصة مع قطب كهربائي داخل حج / AgCl والاتصال مع الحل ماصة. يعد هذا ماصة التصحيح.
- لاستئصال رقعة من الداخل إلى الخارج من بويضة أعدت ، العثور على حافة واضحة من البويضة تحت المجهر. نقل ماصة التصحيح قريب من البويضة باستخدام مناور. سجل المقاومة التسلسلي للماصة. المقاومة سلسلة المثالي للماصة التصحيح بين 1-1،5 MΩ عندما تمتلئ حل ماصة والغارقة في حل الحمام.
- دفع ببطء ماصة ضد المقاومة البويضة حتى يتضاعف تقريبا.
- تطبيق طيف الامتصاص للغشاء عن طريق الفم من خلال أنبوب الشفط الذي يرتبط حامل ماصة حتى يتم الحصول على ختم GIGA أوم. استقرار التصحيح بوضعها في بالسيارات -30 الجهد لبضع دقائق.
- للحصول على التصحيح من الداخل إلى الخارج ، المكوس التصحيح عن طريق دفع بسرعة ماصة الى مزيد من البويضة ثم يسحب للخارج برفق.
- التصحيح من الداخل إلى الخارج هو الآن على استعداد للقط. نقل ماصة عقد التصحيح من الداخل إلى الخارج لحوالي 100 ميكرون بعيدا عن افتتاح قمة الارواء.
- إغلاق صمام الالكترونية لجمع النفايات وفتح صمام خزان من أجل حل نضح المطلوب
- بدء التسجيل عبر التيارات التصحيح. تغيير الحلول الجهد ونضح على النحو المرغوب فيه.
- عند الانتهاء من التسجيل ، تنظيف الأنابيب التروية ، وغيض من رصاص عن طريق دفع المياه من خلال منزوع الأيونات لتجنب السدادات.
4. ممثل النتائج
أثناء إعداد البويضات لالمشبك التصحيح ، فإن العلاج 5-10 دقيقة من حل تجريد فصل الغشاء المحي من غشاء البلازما ، مما يجعل من الممكن تجريد الغشاء المحي.
المقاومة سلسلة المثالي للماصة التصحيح بين 1-1،5 MΩ عندما تمتلئ حل ماصة والغارقة في حل الحمام.
فيما يلي تسجيل ممثل قنوات BK من النوع البري على البويضة التصحيح الغشاء. في أعلى اليسار ، وموجات مربعة تدل على الجهد المطبق على التصحيح -- الخطوة الثانية من الزيادات الجهد من 50 فولت الى 200 فولت مع زيادة قدرها 50 بالسيارات. أقل من آثار المقابلة الحالي عندما حل ونضح الاسمية 0 كا 2 + (مجانا [كا 2 +] هو حوالي 0.5 نانومتر). في عامتجعد من السعة الحالية تشير إلى أن احتمال فتح قنوات BK يزداد مع الجهد. على الجانب الأيمن ، وperfused التصحيح نفسه مع 1.0 ميكرومتر كا 2 + عندما يطبق مع بروتوكول الجهد نفسه. السعة الحالية تزيد أكثر في إطار الجهد نفسه ، مشيرا الى ان احتمال فتح يزداد مع [كا 2 +]. 
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نظام التعبير البويضة مثالية لتوصيف الكهربية من القنوات ايون الجهد التي تعتمد على نتيجة لخلفية منخفضة نسبيا من القنوات المحلية. وعلاوة على ذلك ، لأنه هو نظام التعبير عابرة ، فإنه يوفر وسيلة فعالة لإجراء دراسة الطفرات لهذه القنوات. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن النظام التعبير البويضة وهو يختلف عن ذلك في الخلايا الثديية ، وبالتالي قد يكون هناك اختلافات في مرحلة ما بعد متعدية تعديل وبالتعاون مع مفارز مختلفة. وعلاوة على ذلك ، يجوز للتركيز الدهون تختلف بين خليتين التي قد تؤثر على خصائص القناة وظيفية.
يجب تنظيف الأنابيب التروية ، قلم رصاص وغيض الماء في كل مرة DI بعد التجربة لتجنب تسد. دائما استخدام مواد التبييض جديدة لعلاج السلك الكهربائي حج للتأكد من انها مغلفة مع AgCl ، وإلا سيتم تسجيل غير دقيقة. ضبط ضبط التهيئة للحصول على البيانات بحيث يمكن اختبار تساوي بالضبط إمكانات القيادة. وسيكون من المفيد للحفاظ على ماصات التصحيح نظيفة وذلك باستخدام غطاء لحمايتها من الأوساخ وإطلاق النار عليهم فقط تلميع قبل الاستخدام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01 - R01 - HL70393 وNS060706 لJCJC هو أستاذ الهندسة الطبية الحيوية بشأن الوقف سبنسر أولين T..
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Perfusion System and Electronic Controller | AutoMate Scientific, Inc. | ValveLink 16 | Inner diameter of perfusion tip: 100 microns |
| Inverted Microscope | Olympus Corporation | CKX31 | |
| Glass Pipettes | VWR international | 53432-921 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Amplifier | Axon Instruments | AXOPATCH 200B | |
| Computer Interface | INSTRUTECH Corporation | ITC-18 | |
| Headstage | Axon Instruments | CV 203BU |
References
- Methfessel, C. Patch clamp measurements on Xenopus laevis oocytes: currents through endogenous channels and implanted acetylcholine receptor and sodium channels. Pflügers Arch. 407, 577-588 (1986).
- Toro, L., Wallner, M., Meera, P., Tanaka, Y. Maxi-K (Ca), Unique Member of the Voltage-Gated K Channel Superfamily. News Physiol. Sci. 13, 112-117 (1998).
- Fettiplace, R., Fuchs, P. A. Mechanisms of hair cell tuning. Annu. Rev. Physiol. 61, 809-834 (1999).
- Du, W. Calcium-sensitive potassium channelopathy in human epilepsy and paroxysmal movement disorder. Nat. Genet. 37, 733-738 (2005).
- Ledoux, J., Werner, M. E., Brayden, J. E., Nelson, M. T., T, M. Calcium-activated potassium channels and the regulation of vascular tone. Physiology (Bethesda). 21, 69-78 (2006).
- Salkoff, L. High-conductance potassium channels of the SLO family. Nat. Rev. Neurosci. 7, 921-931 (2006).
- Shi, J., Cui, J. Intracellular Mg2+ enhances the function of BK-type Ca2+-activated K+ channels. J. Gen. Physiol. 118, 589-606 (2001).
- Magleby, K. L. Gating mechanism of BK (Slo1) channels: so near, yet so far. J. Gen. Physiol. 121, 81-96 (2003).
- Latorre, R., Brauchi, S. Large conductance Ca2+-activated K+ (BK) channel: activation by Ca2+ and voltage. Biol. Res. 39, 385-401 (2006).
- Cox, D. H., Cui, J., Aldrich, R. W., W, R. Allosteric gating of a large conductance Ca-activated K+ channel. J. Gen. Physiol. 110, 257-281 (1997).
- Cui, J., Aldrich, R. W. Allosteric linkage between voltage and Ca2+-dependent activation of BK-type mslo1. K+ channels. Biochemistry. 39, 15612-15619 (2000).
- Yang, H. Activation of Slo1 BK channels by Mg2+ coordinated between the voltage sensor and RCK1. 15, 1152-1159 (2008).
- Lee, U. S., Cui, J. {beta} subunit-specific modulations of BK channel function by a mutation associated with epilepsy and dyskinesia. J. Physiol. , 587-1481 (2009).
