Summary
BK通道的离子电流是利用膜片钳技术记录。 BK通道均以
Abstract
这里介绍的协议，旨在研究激活大电导，电压和通道的Ca 2 +激活的K +（BK）。该协议也可以用于研究等离子通道和神经递质受体1的结构与功能的关系。 BK通道广泛表达在不同组织中，并已在许多生理功能，包括调节平滑肌收缩，内毛细胞的频率调整和调节神经递质的释放 2-6牵连。 BK通道被激活细胞膜去极化和细胞内Ca 2 +，Mg 2 +的6-9。因此，该协议的目的是控制膜电压和细胞内的解决方案。在这个协议中，BK通道的信使RNA是注入爪蟾卵母细胞由2-5天的潜伏期，在18 ° C 10-13（第五和第六阶段）。膜补丁包含单个或多个BK渠道切除与内配置使用膜片钳技术10-13。灌注所需的解决方案，以便在录制过程中，可以研究不同条件下的通道激活细胞内的补丁。总结，BK通道的mRNA 注入非洲爪蟾卵母细胞表达的卵母细胞质膜上的通道蛋白;膜片钳技术是用来记录电流流经控制电压和细胞内的解决方案下的渠道。
Protocol
1。注射到卵母细胞的mRNA
- 注入0.05 - 50吴爪蟾卵母细胞，使用Nanoject II自动纳升进样器（德拉蒙德科学公司，模型3-000-204）（第五和第六阶段 ），在体外转录成信使RNA。重复上的每一个基因12个卵母细胞的注射。
- 冲洗两次使用注入卵母细胞ND - 96解决方案（96毫米氯化钠（NaCl，议员58.44克/摩尔），2毫米氯化钾（KCl，议员，74.56克/摩尔），1.8毫米氯化钙（ 氯化钙 2•2H 2 O议员147.02），1毫米氯化镁（氯化镁2•6H 2 O先生203.31克/摩尔），5毫米4 - （2 -羟乙基）- 1 - piperazineethanesulfonic磺酸（HEPES，议员238.31克/摩尔），2.5毫米丙酮酸钠（主席110.04克/摩尔）和1x青霉素，链霉素，pH值7.6），然后放置在18 °在培养板中，孵育2天的彗星。
2。准备灌注系统
自动化ValveLink 16灌注系统的插图。灌注系统采用加压氮气推动解决方案的水库灌注的解决方案，通过灌注导管灌注铅笔和小费。每灌注液的流的流动是一个水库阀和电子膨胀阀控制。在这个协议中，水库之一，是不加压和作为废物收集，以及一个压力释放机制的职能。 （从供应商的网站http://www.autom8.com适应的图片）
- 连接导管灌注铅笔。打开电子膨胀阀控制器，电子阀打开。
- 为了保证管路及灌注铅笔无堵塞和空气气泡，通过每个使用去离子水填补了注射器管推去离子（DI）水。
- 的油管连接的解决方案，水库并打开煤气阀，气缸申请加压氮。
- 打开水库阀门，水库的解决方案，以填补油管。弗里克水库阀在解决方案中删除，如果需要的气泡。关闭阀后的管充满与解决方案。
- 填写灌注水提示，并拧到灌注铅笔。的提示连接时要小心，不要捕获任何气泡。
- 修正灌注铅笔使用橡皮泥浴阶段。确保灌注尖端的卫浴空间。现在成立灌注系统。
- 在洗澡添加去离子水。确保淹没在水中灌注提示。
- 测试每个灌注液灌注提示正确。一次灌注液（140毫米的氢氧化钾（KOH，关闭电子废物收集管相连的阀门，并打开阀门 ř 56.1克/摩尔，中号20毫米4） - （2 -羟乙基）-1 - piperazineethanesulfonic磺酸（HEPES，男ř 238.31克/摩尔），2毫米氯化钾（KCL米ř 74.56克/摩尔），1毫米乙二醇双（2 - aminoethylether）- N，N，N'，N' -四乙酸（EGTA米ř 380.35克/摩尔），pH值调整甲磺酸（中间3米ř 96.1克/摩尔）， 钙 7.1-7.2 +和Mg2 +添加到所需浓度，在需要时） 。在显微镜下，观察灌注液灌注尖端的喷气机。关闭灌注液阀，并打开阀门废物收集。灌注飞机几乎消失。重复相同的测试的所有灌注解决方案。
- 当您已经验证所有灌注流量的解决方案正确，更换槽液浴（140毫米的氢氧化钾（KOH，DI水ř 56.1克/摩尔，中号20毫米4） - （2 -羟乙基）- 1 - piperazineethanesulfonic磺酸（HEPES，男ř 238.31克/摩尔），2毫米氯化钾（KCL米ř 74.56克/摩尔），pH值调整到7.1-7.2甲磺酸（MESO 3，M ř 96.1克/摩尔））。
3。膜片钳
- 重涂与氯化银银记录电极膜片钳在每个会议。首先，从吸管持有人，淹没在一个小瓶新鲜的漂白剂含有至少15分钟的电极丝的尖端一半的电极丝。这存款一层AgCl的电线上。
- 用去离子水冲洗电极丝和吸干。 Ag / AgCl电极，然后安装在吸管持有人。
- 洗澡（参考）电极连接的探头，它在洗澡的地方。这准备记录电极。
- 现在准备进行数据采集。打开您的计算机上，插入您的计算机的打印机端口的硬件密钥。必须插入硬件密钥，供您使用的数据采集软件，这是HEKA脉冲。
- 开关放大器（Axon仪器，AXO补丁200B）并开始HEKA脉冲。负载的协议文件，并调整配置设置，如经济刺激规模。调整配置设置的目标，以保证测试的潜力是完全平等的命令的潜在。这准备的数据采集设备。
- 准备卵母细胞。淹没卵母细胞中剥离液（N -甲基- D -葡萄糖胺（NMG，男ř 195.22克/摩尔），200毫米的天门冬氨酸（没有K +）（M ř 133.1克/摩尔），2毫米氯化钾（氯化钾200毫米中号ř 74.56克/摩尔），10毫米乙二醇-双（2 - aminoethylether）- N，N，N'，N' -四乙酸（EGTA，M ř 380.35克/摩尔），1毫米氯化镁（氯化镁2•6H 2 O，中号，10毫米4 ř 203.31克/摩尔） - （2 -羟乙基）- 1 - piperazineethanesulfonic磺酸（HEPES，男ř 238.31克/摩尔），pH值是由氢氧化钠调整至7.4（氢氧化钠，中号ř 40.0克/摩尔）5 - 10分钟剥离的解决方案从质膜，这使得它可以地带卵黄膜分离卵黄膜。
- 轻轻地带使用两个双钳卵母细胞的卵黄膜。一个devitellinized卵母细胞，是极其脆弱和必要的少，因此应移到。
- 同时注意防止devitellinized卵母细胞暴露到空气或气泡，充满了足够的解决方案的卵母细胞转移到洗澡使用的玻璃吸管。这准备录制的卵母细胞。
- 准备补丁移液器。拉后插入一个萨特的P - 97火焰山/布朗微管牵引器的玻璃毛细管（VWR International的猫＃53432-921）玻璃吸液管。在显微镜下观察移液器，以确定针尖的形状和开口直径。开口直径为2-4微米。
- 在录制过程中为了减少电容电流，以确保一个平稳的提示，大衣用蜡的一角，然后火抛光。
- 填充液（140毫米的氢氧化钾（KOH米ř 56.1克/摩尔），20毫米4放置吸管尖枪头- （2 -羟乙基）- 1 - piperazineethanesulfonic磺酸（HEPES，中号ř 238.31克/摩尔），2毫米氯化钾（KCL米ř 74.56克/摩尔），2毫米氯化镁（氯化镁2•6H，男ř 203.31克/摩尔），pH值调整到7.1-7.2甲基酸（MESO 3，M ř 96.1克/摩尔））和绘图柱塞。这弄湿技巧。
- 填充吸管的解决方案中使用的注射器吸液管的1 / 3满，并将其放置在吸管吸管持有人的Ag / AgCl电极内部和与电极内液接触。这准备修补吸管。
- 要准备的卵母细胞的消费税从内而外的补丁，在显微镜下找到明确的卵母细胞的边缘。移动吸管接近使用机械臂的卵母细胞的修补程序。记录的吸液管的串联电阻。补丁吸管理想的串联电阻时充满电极内液和沐浴液淹没的1-1.5MΩ。
- 慢慢推对卵母细胞的吸管，直到阻力大约增加一倍。
- 申请经口轻柔吸膜通过吸痰管，它是连接到吸管持有人，直到获得一个千兆欧姆密封。稳定在-30 mV的电压为几分钟的修补程序。
- 要获得一个由内向外的补丁，消费迅速推进吸管进一步进入卵母细胞，然后轻轻拉出补丁。
- 内而外的补丁现在是准备用于夹紧。移动吸管内而外的补丁约100微米，从开放灌注提示。
- 关闭电子废物收集阀，并打开所需的灌注液水库阀
- 开始记录电流穿过补丁。更改的解决方案所需的电压和灌注。
- 当您完成录制，推动通过去离子水，以避免堵塞清洁灌注导管，铅笔和小费。
4。代表性的成果
在膜片钳的卵母细胞的准备，剥离液5-10分钟治疗，脱离质膜，这使得有可能剥离卵黄膜卵黄膜。
补丁吸管理想的串联电阻时充满电极内液和沐浴液淹没的1-1.5MΩ。
以下是BK一个卵母细胞质膜补丁上的野生型渠道的代表性录音。在左上角，方波表示适用于修补程序的电压 - 从50 mV到200 mV的增量为50 mV的电压升高的第二个步骤。下面是相应的电流的痕迹时，灌注液公称0的Ca 2 +（免费的[Ca 2 +]约为0.5纳米）。在电流幅值的折痕表明，BK通道的开放概率增加电压。在右侧，相同的修补程序灌注1.0μM的Ca 2 +具有相同的电压协议。相同的电压下电流的幅度增加，表明开放概率增加的Ca 2 +]。 
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
卵母细胞表达系统是由于相对较低的内源性途径背景电压依赖性离子通道的电生理特性的理想选择。此外，因为它是一个瞬时表达系统，它提供了一个有效的方法执行这些渠道的诱变研究。然而，应该指出的是，卵母细胞表达系统在哺乳动物细胞中是不同的，从而有可能在翻译后修饰和与不同的亚基协会的差异。此外，血脂浓度可能会有所不同，两者之间的细胞这可能会影响通道的功能特性。
灌注导管，铅笔和小费应与DI水清洗，每一次实验，以避免堵塞后。请务必使用新鲜的漂白剂来治疗，以确保涂有氯化银，否则记录将是不准确的的银电极丝。调整配置设置，数据采集，使测试的潜力是完全相等的命令潜力。这将是有益的，以保持清洁的补丁移液器使用盖子来保护他们污垢和消防波兰只有在使用之前，他们。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由国家卫生赠款R01 - HL70393和R01 - NS060706到JCJC研究院支持，斯宾塞吨奥林基金会是一个生物医学工程教授。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Perfusion System and Electronic Controller | AutoMate Scientific, Inc. | ValveLink 16 | Inner diameter of perfusion tip: 100 microns |
| Inverted Microscope | Olympus Corporation | CKX31 | |
| Glass Pipettes | VWR international | 53432-921 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Amplifier | Axon Instruments | AXOPATCH 200B | |
| Computer Interface | INSTRUTECH Corporation | ITC-18 | |
| Headstage | Axon Instruments | CV 203BU |
References
- Methfessel, C. Patch clamp measurements on Xenopus laevis oocytes: currents through endogenous channels and implanted acetylcholine receptor and sodium channels. Pflügers Arch. 407, 577-588 (1986).
- Toro, L., Wallner, M., Meera, P., Tanaka, Y. Maxi-K (Ca), Unique Member of the Voltage-Gated K Channel Superfamily. News Physiol. Sci. 13, 112-117 (1998).
- Fettiplace, R., Fuchs, P. A. Mechanisms of hair cell tuning. Annu. Rev. Physiol. 61, 809-834 (1999).
- Du, W. Calcium-sensitive potassium channelopathy in human epilepsy and paroxysmal movement disorder. Nat. Genet. 37, 733-738 (2005).
- Ledoux, J., Werner, M. E., Brayden, J. E., Nelson, M. T., T, M. Calcium-activated potassium channels and the regulation of vascular tone. Physiology (Bethesda). 21, 69-78 (2006).
- Salkoff, L. High-conductance potassium channels of the SLO family. Nat. Rev. Neurosci. 7, 921-931 (2006).
- Shi, J., Cui, J. Intracellular Mg2+ enhances the function of BK-type Ca2+-activated K+ channels. J. Gen. Physiol. 118, 589-606 (2001).
- Magleby, K. L. Gating mechanism of BK (Slo1) channels: so near, yet so far. J. Gen. Physiol. 121, 81-96 (2003).
- Latorre, R., Brauchi, S. Large conductance Ca2+-activated K+ (BK) channel: activation by Ca2+ and voltage. Biol. Res. 39, 385-401 (2006).
- Cox, D. H., Cui, J., Aldrich, R. W., W, R. Allosteric gating of a large conductance Ca-activated K+ channel. J. Gen. Physiol. 110, 257-281 (1997).
- Cui, J., Aldrich, R. W. Allosteric linkage between voltage and Ca2+-dependent activation of BK-type mslo1. K+ channels. Biochemistry. 39, 15612-15619 (2000).
- Yang, H. Activation of Slo1 BK channels by Mg2+ coordinated between the voltage sensor and RCK1. 15, 1152-1159 (2008).
- Lee, U. S., Cui, J. {beta} subunit-specific modulations of BK channel function by a mutation associated with epilepsy and dyskinesia. J. Physiol. , 587-1481 (2009).
