Summary
BK kanalları İyonik akım yama klemp teknikleri kullanılarak kaydedildi. BK kanalları ifade edilmiştir.
Abstract
Burada sunulan protokol büyük iletkenlik, voltaj ve Ca 2 + ile aktive olan K + (BK) kanalları aktivasyon çalışma için tasarlanmıştır. Protokol, aynı zamanda, diğer iyon kanalları ve nörotransmitter reseptörlerinin 1 için yapı-işlev ilişkisi çalışma için kullanılan olabilir. BK kanalları farklı dokularda yaygın olarak ifade edilir ve düz kas kasılması düzenlenmesi, iç saç hücrelerinin frekans ayarı ve nörotransmitter sürüm 2-6 düzenlenmesi de dahil olmak üzere birçok önemli fizyolojik fonksiyonları, suçlanmıştır . BK kanalları membran depolarizasyon ve hücre içi Ca 2 + ve Mg 2 + 6-9 tarafından aktive edilir. Bu nedenle, protokol, membran voltaj ve hücre içi bir çözüm kontrol etmek üzere tasarlanmıştır. Bu protokol, BK kanalları mesajcı RNA 2-5 gün inkübasyon 18 ° C 10-13 takip Xenopus laevis oosit (Evre V-VI) enjekte edilir. Tek veya birden fazla BK kanalları içeren Membran yamalar yama klemp teknikleri 10-13, iç-dış yapılandırma ile eksize. Yama intraselüler tarafı, farklı koşullar altında kanal aktivasyon incelenir, böylece kayıt sırasında istenen çözümleri ile perfüze. Özetlemek gerekirse, BK kanalları mRNA oosit zarı kanal proteinleri ifade Xenopus laevis oosit içine enjekte edilir; yama klemp teknikleri, kontrollü gerilim ve hücre içi çözümleri altında kanallar aracılığıyla akıntılar kaydetmek için kullanılır .
Protocol
1. Oosit içine mRNA enjeksiyon
- Enjekte 0.05 - 50 ng mesajcı RNA Nanoject II Auto-Nanoliter Enjektör (Drummond Bilimsel Şirket, modeli 3-000-204) kullanarak Xenopus laevis oosit (Evre V-VI), in vitro transkripsiyonu da yapılmıştır . Her mRNA için bir düzine oosit enjeksiyon tekrarlayın.
- Iki kez kullanarak enjekte oosit durulayın ND-96 solüsyonu (96 mM sodyum klorür (NaCl, Bay 58,44 g / mol), 2 mM potasyum klorür (KCl, Bay 74,56 g / mol), 1.8 mM kalsiyum klorür (CaCl 2 • 2H 2 O , Bay 147,02), 1 mM magnezyum klorür (MgCl 2 • 6H 2 O, Bay 203,31 g / mol), 5 mM 4 - (2-hidroksietil)-1-piperazineethanesulfonic asit (HEPES, Bay 238,31 g / mol), 2.5 mM sodyum piruvat (Bay 110,04 g / mol), 1x Penisilin-Streptomisin pH 7.6), daha sonra 18 yaşında bir kültür plaka ve inkübe koyun ° C 2 + gün.
2. Perfüzyon Sistemi hazırlanması
İllüstrasyon otomatikleştirin ValveLink 16 perfüzyon sistemi. Perfüzyon sistemi perfüzyon borulama ile perfüzyon çözümler, çözüm rezervuarların dışarı itmek için basınçlı azot kullanır ve perfüzyon kalem ve ucu. Perfüzyon çözüm her akarsuyun akış biri rezervuar valfi ve bir elektronik vana ile kontrol edilir. Bu protokol, rezervuarların bir atık toplayıcı yanı sıra bir basınç serbest bırakma mekanizması gibi basınçlı ve işlevleri değildir. (Resim üreticisinin web sitesine http://www.autom8.com adapte)
- Borulama perfüzyon kalem bağlayın. Elektronik supap kontrol açın ve elektronik vanalarının açık.
- Deiyonize su ile dolu bir şırınga kullanarak her bir tüp yoluyla deiyonize (DI) su itme, borulama ve perfüzyon kalem yapışmasına neden olabilir ve hava kabarcıkları serbest olduğu sağlamak için.
- Çözüm rezervuarları borulama bağlayın ve basınçlı azot uygulamak için silindir gaz valfi açık.
- Rezervuar çözüm tüp doldurmak için rezervuar vanasını açın. Gerekirse çözüm kabarcıkları rezervuar valf Flick. Hortumun çözümü ile doldurulduktan sonra vanasını kapatın.
- Perfüzyon ucunu su ile doldurun ve perfüzyon kalem üzerine vida. Ucu bağlarken herhangi bir kabarcıklar yakalamak için dikkatli olun.
- Modelleme kil ile banyo aşamasına perfüzyon kalem sabitleyin. Perfüzyon ucu banyo alanı içinde olduğundan emin olun. Perfüzyon sistemi artık ayarlandı.
- Banyo DI su ekleyin. Perfüzyon ucu suya batmış olduğundan emin olun.
- Her perfüzyon çözüm perfüzyon ucu doğru geldiğini sınayın. Atık kolektör boru bağlı elektronik vanasını kapatın ve bir seferde bir perfüzyon çözeltisi (140 mM potasyum hidroksit (KOH, valfi açık M r 56.1 g / mol), 20 mM 4 - (2-hidroksi) -1 - piperazineethanesulfonic asit (Hepes, M r 238,31 g / mol), 2 mM potasyum klorür (KCl, M r 74,56 g / mol), 1 mM Etilen glikol-bis (2-aminoethylether)-N, N, N ', N'- tetraasetik asit (EGTA, M r 380,35 g / mol), pH metansülfonik asit (MESO 3, M r 96.1 g / mol), Ca 2 7,1-7,2 'e ayarlanır + veya Mg2 + gerektiğinde) istenilen konsantrasyona eklenir . Mikroskop altında, perfüzyon ucu çıkan perfüzyon sıvısına jet gözlemliyoruz. Perfüzyon çözümü için vanayı kapatın ve atık toplayıcı valfi açık. Perfüzyon jet hemen hemen kaybolur. Perfüzyon tüm çözümler için aynı test tekrarlayın.
- Doğru tüm perfüzyon çözümler akış kontrol ettikten sonra, banyo solüsyonu ile banyo (140 mM potasyum hidroksit (KOH, DI su yerine M r 56.1 g / mol), 20 mM 4 - (2-hidroksietil)-1-piperazineethanesulfonic asit (Hepes, M r 238,31 g / mol), 2 mM potasyum klorür (KCl, M r 74,56 g / mol), pH 7,1-7,2 metansülfonik asit (MESO 3, M r 96.1 g / mol)) tarafından ayarlanır.
3. Patch Sıkma
- İkinci kat uygulama, AgCl Ag kayıt elektrot her yama oturumda sıkma önce. Birincisi, pipet tutucu ve batığın en az 15 dakika süreyle taze çamaşır suyu içeren bir şişe elektrot teli ucu yarım elektrot teli çıkarın. Bu mevduat tel AgCl bir katman.
- Elektrot teli deiyonize su ile çalkalayın ve kuru kurulayın. Sonra pipet tutucu Ag / AgCl elektrot geri yükleyin.
- Headstage, banyo (referans) elektrodu bağlayın ve banyo yerleştirin. Bu kayıt için elektrotlar hazırlar.
- Şimdi veri toplama için hazırlar. Bilgisayarınızı açın ve donanım anahtarı bilgisayarınızın yazıcı bağlantı noktasına takın. Heka darbe veri toplama yazılımı kullanmak için donanım anahtarı takılı olmalıdır.
- Amplifikatör açın (Axon Instruments, AXOYAMA 200B) ve başlangıç Heka Darbe. Stimulus Ölçek olarak, protokol dosya yükleyin ve yapılandırma ayarları. Yapılandırma ayarlarını ayarlamak için hedef test potansiyeli komut potansiyeli tam olarak eşit olduğunu güvence altına almak. Bu veri toplama ekipmanları hazırlar.
- Oosit hazırlayın. Batmak sıyırma çözüm oosit (200 mM N-metil D-glucamine (NMG, M r 195,22 g / mol), 200 mM Aspartat (ve K +) (M r 133,1 g / mol), 2 mM potasyum klorür (KCl , M r 74,56 g / mol), 10 mM Etilen glikol-bis (2-aminoethylether)-N, N, N ', N'-tetraasetik asit (EGTA M r 380,35 g / mol), 1 mM magnezyum klorür (MgCl 2 • 6H 2 O, M r 203,31 g / mol), 10 mM 4 - (2-hidroksi)-1-piperazineethanesulfonic asit (Hepes, M r 238,31 g / mol), pH, sodyum hidroksit (NaOH, 7.4 'e ayarlanır . 5 M r 40.0 g / mol) - 10 dakika vitellin membran şerit mümkün kılan plazma membran sıyırma çözüm vitellin zar ayırır.
- Yavaşça, forseps, iki çift kullanarak oosit vitellin membran şerit. Devitellinized oosit az gerektiğinde son derece hassastır ve bu nedenle hareket ettirilmelidir.
- Hava veya kabarcıklar devitellinized oosit dökülmesini önlemek için bakımı, banyo oosit transfer için yeterli bir çözüm ile dolu bir cam pipet kullanın. Bu kayıt için oosit hazırlar.
- Yama pipetler hazırlayın. Sutter P-97 Flaming / Brown Mikropipet Çektirme içine bir cam kapiller tüp (VWR International, Kedi # 53.432-921) taktıktan sonra cam pipetler çekin. Ucu şeklini ve açılış çapı belirlemek için mikroskop altında pipetler dikkat edin. Açılış çapı 2-4 mikrometre olmalıdır.
- Kapasitif akım kayıt sırasında azaltmak için düzgün bir ucu, mont, balmumu ile ucu sağlamak ve daha sonra yangın lehçe.
- Pipet pipet ucu (2-hidroksi)-1-piperazineethanesulfonic asit (Hepes M r - pipet çözüm (140 mM potasyum hidroksit (KOH, M r 56.1 g / mol), 20 mM 4 içine koyarak doldurun 238,31 g / mol), 2 mM potasyum klorür (KCl, M r 74,56 g / mol), 2 mM magnezyum klorür (MgCl 2 • 6H 2 O, K r 203,31 g / mol), pH 7,1-7,2 için metansülfonik tarafından ayarlanır. asit (MESO 3, M r 96.1 g / mol)) ve piston çizimi. Bu ucu ıslatır.
- Bir şırınga kullanarak pipet çözüm ile pipet tam 1 / 3 doldurun ve Ag / AgCl elektrot iç ve pipet çözüm ile temas pipetle tutucu pipet yerleştirmek. Bu yama pipet hazırlamaktadır.
- Iç-dış yama hazırlanan oosit tüketim için, mikroskop altında yumurtanın açık kenarında bulabilirsiniz. Manipülatör kullanarak oosit yakın yama pipet hareket ettirin. Pipet seri direnç kaydedin. Ideal bir seri direnç yama pipet, pipet çözüm ile dolu ve banyo çözüm batmış M 1-1.5 arasında.
- Direnci yaklaşık iki katına kadar oosit karşı pipet yavaşça itin.
- Giga-ohm mühür elde edilinceye kadar pipet sahibine bağlı olan bir emme borusu yoluyla, ağız yoluyla membran nazik vakum uygulayın. Birkaç dakika için gerilim -30 mV tutarak yama sabitleyin.
- Tersyüz olmuş bir yama, tüketim hızla oosit pipet içine daha fazla bastırıyor ve sonra yavaşça çekip yama elde etmek için.
- Iç-dış yama şimdi sıkma için hazırdır. Iç-dış yama tutarak perfüzyon ucunun açılması uzaklıkta yaklaşık 100 mikron pipet hareket ettirin.
- Elektronik atık toplamak için vanasını kapatın ve istenen perfüzyon çözümü için rezervuar valfi açık
- Akımları karşısında yama kaydetmeye başlarsınız. Gerilim ve perfüzyon çözümleri istediğiniz gibi değiştirin.
- Kayıt bittiğinde, takunya önlemek için deiyonize su ile iterek perfüzyon borulama, kalem ve bahşiş temizleyin.
4. Temsilcisi Sonuçlar
Yama kelepçe için oosit hazırlanması sırasında, sıyırma çözüm 5-10 dakikalık tedavi vitellin vitellin membran sıyırma mümkün kılan plazma membranı, membran ayırma.
Ideal bir seri direnç yama pipet, pipet çözüm ile dolu ve banyo çözüm batmış M 1-1.5 arasında.
Aşağıda bir oosit membran yama yabani tip BK kanalları bir temsilci kayıt. 50 mV 50 mV artış ile 200 mV gerilim artar, ikinci adımda sol üst kare dalgalar, yama uygulanan gerilim gösterir. Aşağıda perfüzyon çözüm, nominal 0 Ca 2 + (ücretsiz [Ca 2 +] yaklaşık 0.5 nM) ilgili güncel izleri. IçindeBK kanalları açık olasılık geçerli genliği kırışıklık gerilimi ile arttığını gösterir. Sağ tarafta, aynı yama 1.0 mcM Ca 2 ile perfüze + aynı gerilim protokolü ile uygulanır. Geçerli genliği açık olasılık [Ca 2 +] ile arttığını belirterek, aynı gerilim altında daha fazla artar. 
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Oosit ifade sistemin endojen kanalları nispeten düşük arka nedeniyle voltaj bağımlı iyon kanallarının elektrofizyolojik karakterizasyonu için idealdir. Ayrıca, geçici bir ifade sistem olduğundan, bu kanalların mutagenez çalışma yerine etkili bir yöntem sağlar. Ancak, oosit ifade sistemi memeli hücrelerinde farklı olduğunu belirtmek gerekir, böylece farklı alt birimden post-translasyonel modifikasyonu ve dernek farklılıklar olabilir. Ayrıca, lipid konsantrasyonu kanalın fonksiyonel özelliklerini etkileyebilir iki hücre arasında farklılık gösterebilir.
Perfüzyon borulama, kalem ve bahşiş DI suyla yapışmasına neden önlemek için deneme sonrasında her zaman temizlenmesi gerekir. Sürekli kayıt hatalı olacak, aksi takdirde AgCl ile kaplanmış emin olmak için Ag elektrot teli tedavisi için temiz çamaşır suyu kullanın. Test potansiyeli komut potansiyeli tam olarak eşit şekilde veri toplama için yapılandırma ayarlarını ayarlayın. Bu, temiz yama pipetler, kir ve sadece kullanımdan önce yangın lehçe onları korumak için bir kapak tutmak için yararlı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma, Sağlık hibe, R01-HL70393 ve R01-NS060706 JCJC için Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenen Biyomedikal Mühendisliği profesörü Spencer T. Olin Endowment.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Perfusion System and Electronic Controller | AutoMate Scientific, Inc. | ValveLink 16 | Inner diameter of perfusion tip: 100 microns |
| Inverted Microscope | Olympus Corporation | CKX31 | |
| Glass Pipettes | VWR international | 53432-921 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Amplifier | Axon Instruments | AXOPATCH 200B | |
| Computer Interface | INSTRUTECH Corporation | ITC-18 | |
| Headstage | Axon Instruments | CV 203BU |
References
- Methfessel, C. Patch clamp measurements on Xenopus laevis oocytes: currents through endogenous channels and implanted acetylcholine receptor and sodium channels. Pflügers Arch. 407, 577-588 (1986).
- Toro, L., Wallner, M., Meera, P., Tanaka, Y. Maxi-K (Ca), Unique Member of the Voltage-Gated K Channel Superfamily. News Physiol. Sci. 13, 112-117 (1998).
- Fettiplace, R., Fuchs, P. A. Mechanisms of hair cell tuning. Annu. Rev. Physiol. 61, 809-834 (1999).
- Du, W. Calcium-sensitive potassium channelopathy in human epilepsy and paroxysmal movement disorder. Nat. Genet. 37, 733-738 (2005).
- Ledoux, J., Werner, M. E., Brayden, J. E., Nelson, M. T., T, M. Calcium-activated potassium channels and the regulation of vascular tone. Physiology (Bethesda). 21, 69-78 (2006).
- Salkoff, L. High-conductance potassium channels of the SLO family. Nat. Rev. Neurosci. 7, 921-931 (2006).
- Shi, J., Cui, J. Intracellular Mg2+ enhances the function of BK-type Ca2+-activated K+ channels. J. Gen. Physiol. 118, 589-606 (2001).
- Magleby, K. L. Gating mechanism of BK (Slo1) channels: so near, yet so far. J. Gen. Physiol. 121, 81-96 (2003).
- Latorre, R., Brauchi, S. Large conductance Ca2+-activated K+ (BK) channel: activation by Ca2+ and voltage. Biol. Res. 39, 385-401 (2006).
- Cox, D. H., Cui, J., Aldrich, R. W., W, R. Allosteric gating of a large conductance Ca-activated K+ channel. J. Gen. Physiol. 110, 257-281 (1997).
- Cui, J., Aldrich, R. W. Allosteric linkage between voltage and Ca2+-dependent activation of BK-type mslo1. K+ channels. Biochemistry. 39, 15612-15619 (2000).
- Yang, H. Activation of Slo1 BK channels by Mg2+ coordinated between the voltage sensor and RCK1. 15, 1152-1159 (2008).
- Lee, U. S., Cui, J. {beta} subunit-specific modulations of BK channel function by a mutation associated with epilepsy and dyskinesia. J. Physiol. , 587-1481 (2009).
