Summary
יונית הנוכחי של BK ערוצי נרשם באמצעות מהדק טכניקות תיקון. ערוצי BK באים לידי ביטוי
Abstract
הפרוטוקול המובא כאן נועד לבחון את הפעלת מוליכות גדול, מתח ו-Ca 2 + המופעל K + (BK) ערוצים. הפרוטוקול עשוי לשמש גם כדי ללמוד את מערכת היחסים מבנה פונקציה תעלות יונים אחרים קולטני הנוירוטרנסמיטר 1. ערוצי BK באים לידי ביטוי נרחב ברקמות שונות היו מעורבים פונקציות פיזיולוגיים רבים, כולל ויסות התכווצות שרירים חלקים, כוונון תדר של תאים שיער הפנימי הסדרת שחרור הנוירוטרנסמיטר 2-6. ערוצי BK מופעלים על ידי שלילת קוטביות הממברנה ועל ידי תאיים Ca 2 + ו - Mg 2 + 6-9. לפיכך, הפרוטוקול נועד כדי לשלוט הן את מתח הממברנה והפתרון תאיים. בפרוטוקול זה, RNA שליח של BK ערוצי מוזרק לתוך ביציות Xenopus laevis (שלב ה-V-VI) ואחריו 2-5 ימי דגירה על 18 ° C 10-13. תיקוני ממברנה המכילות אחד או מספר ערוצים BK הם נכרת עם תצורה בתוך-out באמצעות מהדק תיקון טכניקות 10-13. הצד תאיים התיקון הוא perfused עם פתרונות הרצוי במהלך ההקלטה, כך הפעלת הערוץ בתנאים שונים ניתן לבדוק. לסיכום, ה-mRNA של BK ערוצי מוזרק לתוך ביציות Xenopus laevis להביע ערוץ חלבונים על קרום הביצית, מהדק טכניקות תיקון משמשים שיא זרמים הזורמים בצינורות תחת מתח מבוקר פתרונות תאיים.
Protocol
1. הזרקה לתוך ביציות של mRNA
- הזרק .05-50 ng RNA שליח שהיה עיבד במבחנה לתוך ביציות Xenopus laevis (שלב ה-V-VI) באמצעות Nanoject II Auto-Nanoliter Injector (דראמונד מדעי החברה, מודל 3-000-204). חזור על זריקה על עשרות ביציות עבור כל ה-mRNA.
- שוטפים את ביציות מוזרק פעמיים באמצעות ND-96 הפתרון (96 mM נתרן כלורי (NaCl, מר 58.44 g / mol), 2 mM אשלגן כלורי (KCl, מר 74.56 g / mol), 1.8 mM סידן כלורי (CaCl 2 • 2H 2 O מר 147.02), 1 mM מגנזיום כלורי (MgCl 2 • 6 שעות 2 O, מר 203.31 g / mol), 5 מ"מ 4 - (2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic חומצה (HEPES, מר 238.31 g / mol), 2.5 מ"מ pyruvate נתרן (מר 110.04 g / mol), ו-1x פניצילין סטרפטומיצין. pH 7.6), ואז למקם אותם בצלחת תרבות לדגור על 18 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים +.
2. הכנת מערכת זלוף
איור של מערכת ValveLink 16 זלוף לאוטומטי. המערכת משתמשת זלוף חנקן דחוס כדי לדחוף פתרונות זלוף מתוך המאגרים פתרון, דרך tubings זלוף, וכדי העיפרון זלוף ועל קצה. הזרימה של כל זרם של פתרון זלוף נשלט על ידי שסתום חד המאגר ואחד שסתום אלקטרוני. בפרוטוקול זה, אחד המאגרים לא בלחץ פונקציות כאספן פסולת, כמו גם מנגנון שחרור הלחץ. (תמונה מותאמת http://www.autom8.com באתר האינטרנט של הספק)
- חבר את tubings על העיפרון זלוף. הפעל את הבקר שסתום אלקטרוני לפתוח את שסתומי אלקטרוניים.
- כדי להבטיח כי tubings ואת עפרון זלוף חופשיים של בועות לסתום ואוויר, לדחוף מים deionized (di) דרך כל צינורות באמצעות מזרק מלא מים deionized.
- חבר את tubings אל המאגרים פתרון ולפתוח את שסתום הגז גליל ליישם חנקן דחוס.
- פתח את שסתום מאגר למלא את צינורות עם פתרון המאגר. פליק שסתום מאגר להסיר בועות פתרון במידת הצורך. סגור את שסתום לאחר בצינור מלא פתרון.
- מלאו את קצה זלוף עם מים לדפוק אותו על העיפרון זלוף. היזהרו שלא להשמין כל הבועות בעת חיבור קצה.
- תקן את העיפרון זלוף לשלב אמבט באמצעות פלסטלינה. ודא את קצה זלוף הוא בחלל אמבטיה. המערכת זלוף מוגדר כעת למעלה.
- מוסיפים מים DI באמבטיה. ודא את קצה זלוף הוא שקוע בתוך המים.
- בדיקה כי כל פתרון זלוף יוצא קצה זלוף כראוי. סגור את שסתום אלקטרוני המחובר בצינור של אספן פסולת לפתוח את שסתום עבור פתרון אחד זלוף בכל פעם (140 mM אשלגן הידרוקסיד (KOH, M r 56.1 g / mol), 20 מ"מ 4 - (2-hydroxyethyl) -1 - piperazineethanesulfonic חומצה (HEPES, M r 238.31 g / mol), 2 mM אשלגן כלורי (KCl, M r 74.56 g / mol), 1 אתילן גליקול mM-bis (2-aminoethylether)-N, N, N ', N'- tetraacetic חומצה (EGTA, M r 380.35 g / mol), pH מותאם 7.1-7.2 methanesulfonic על ידי חומצה (Meso 3, M r 96.1 g / mol), Ca 2 + או Mg2 + מתווסף הריכוז הרצויה בעת הצורך). תחת מיקרוסקופ, לבחון את סילון של נוזל זלוף יוצא קצה זלוף. סגור את שסתום לפתרון זלוף ולפתוח את שסתום עבור אספן הפסולת. סילון זלוף צריך כמעט נעלמים. חזור על בדיקה דומה עבור כל הפתרונות זלוף.
- לאחר שווידאת כי כל הפתרונות זלוף זרימה נכונה, להחליף מים DI באמבטיה עם פתרון אמבטיה (140 mM אשלגן הידרוקסיד (KOH, M r 56.1 g / mol), 20 מ"מ 4 - (2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic חומצה (HEPES, M r 238.31 g / mol), 2 mM אשלגן כלורי (KCl, M r 74.56 g / mol), pH מותאם 7.1-7.2 methanesulfonic על ידי חומצה (Meso 3, M r 96.1 g / mol)).
3. תיקון Clamping
- לצפות מחדש את האלקטרודה הקלטה Ag עם AgCl לפני תיקון כל clamping הפגישה. ראשית, להסיר את חוט האלקטרודה מבעל פיפטה ו לצלול חצי קצה חוט האלקטרודה בבקבוקון המכיל אקונומיקה טרי במשך לפחות 15 דקות. פיקדונות זו שכבה של AgCl על חוט.
- שוטפים את חוט האלקטרודה במים deionized ואת כתם יבש. ואז להתקין את אלקטרודת Ag / AgCl חזרה לבעל פיפטה.
- חבר את האלקטרודה (הפניה) אמבטיה על headstage ולמקם אותו באמבטיה. זה מכין את האלקטרודות הקלטה.
- עכשיו להתכונן רכישת נתונים. הפעל את המחשב וחבר את מפתח חומרה ליציאת המדפסת של המחשב. המפתח החומרה חייב להיות מחובר כדי שתוכל להשתמש בתוכנה נתונים הרכישה, אשר HEKA הדופק.
- הפעל את המגבר (אקסון מכשירים, AXOתיקון 200B) ולהתחיל HEKA דופק. טען את קובץ פרוטוקול ולהתאים את הגדרות התצורה, כגון סולם הגירוי. המטרה של התאמת הגדרות התצורה היא להבטיח כי פוטנציאל הבדיקה הוא שווה בדיוק פוטנציאל הפקודה. זה מכין את הציוד רכישת נתונים.
- הכן ביציות. הביצית לצלול בפתרון הפשטת (200 mM N-methyl-D-glucamine (NMG, M r 195.22 g / mol), Aspartate 200 מ"מ (לא K +) (M r 133.1 g / mol), אשלגן כלורי 2 מ"מ (KCl , מ r 74.56 g / mol), 10 אתילן גליקול mM-bis (2-aminoethylether)-N, N, N ', N'-tetraacetic חומצה (EGTA, M r 380.35 g / mol), 1 mM מגנזיום כלורי (MgCl 2 • 6 שעות 2 O, M r 203.31 g / mol), 10 מ"מ 4 - (2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic חומצה (HEPES, M r 238.31 g / mol), pH מותאם על ידי 7.4 סודיום הידרוקסיד (NaOH, M r 40.0 g / mol) במשך 5 - 10. min הפתרון הפשטת מנתק את קרום vitelline מן הקרום פלזמה המאפשר להפשיט את קרום vitelline.
- בעדינות רצועת קרום vitelline מן הביצית באמצעות שני זוגות מלקחיים. הביצית devitellinized היא שברירית מאוד, ולכן יש להעביר מעט ככל הצורך.
- טיפול למניעת חשיפת הביצית devitellinized אוויר או בועות, השתמש פיפטה זכוכית מלאים פתרון מספיק כדי להעביר את הביצית לאמבטיה. זה מכין את הביצית הקלטה.
- הכן pipettes התיקון. משוך את pipettes זכוכית לאחר החדרת צינור זכוכית נימי (VWR הבינלאומי, חתול # 53432-921) לתוך סאטר P-97 Flaming / בראון micropipette פולר. שים לב pipettes תחת מיקרוסקופ כדי לקבוע את צורת קצה וקוטרו הפתיחה. קוטר הפתח צריך להיות 2-4 מיקרומטר.
- כדי להפחית את זרם קיבולי במהלך ההקלטה ולהבטיח טיפ מעיל חלקה, קצה בשעווה ואחר האש ללטש אותו.
- מלאו את קצה פיפטה ידי הצבת קצה פיפטה בתוך הפתרון פיפטה (140 mM אשלגן הידרוקסיד (KOH, M r 56.1 g / mol), 20 מ"מ 4 - (2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic חומצה (HEPES, M r 238.31 g / mol), 2 mM אשלגן כלורי (KCl, M r 74.56 g / mol), 2 mM מגנזיום כלורי (MgCl 2 • 6 שעות 2 O, M r 203.31 g / mol), pH מותאם 7.1-7.2 ידי methanesulfonic חומצה (Meso 3, M r 96.1 g / mol)) וציור על הבוכנה. זה מרטיב את קצה.
- מלאו פיפטה 1 / 3 מלא עם פתרון פיפטה בעזרת מזרק המקום פיפטה של בעל פיפטה עם בתוך Ag / AgCl את האלקטרודה ויצירת קשר עם פתרון פיפטה. זה מכין את פיפטה התיקון.
- כדי הבלו תיקון מבפנים החוצה מן הביצית מוכנה, למצוא את קצה ברורה של הביצית תחת מיקרוסקופ. הזז את פיפטה תיקון קרוב הביצית באמצעות מניפולטור. שיא ההתנגדות הטורית של טפטפת. ההתנגדות סדרת האידיאלי של פיפטה את התיקון הוא בין 1-1.5 MΩ כאשר התמלאו פתרון פיפטה ו שקוע בפתרון אמבטיה.
- לאט לאט לדחוף את פיפטה נגד הביצית עד ההתנגדות כ מכפיל.
- החל יניקה עדין הממברנה דרך הפה דרך צינור אשר מחובר למחזיק פיפטה עד חותם גיגה אוהם מתקבל. לייצב את התיקון על ידי מחזיק אותו במתח -30 mV במשך כמה דקות.
- כדי להשיג מבפנים החוצה, בלו התיקון על ידי תיקון במהירות דוחפים את פיפטה נוספת לתוך הביצית, ואז משיכתו בעדינות החוצה.
- התיקון מבפנים החוצה מוכן כעת clamping. הזז את פיפטה מחזיקה את התיקון מבפנים החוצה כ 100 מיקרון הרחק פתיחת קצה זלוף.
- סגור את שסתום אלקטרוני לאיסוף פסולת לפתוח את שסתום מאגר לפתרון הרצוי זלוף
- בגין הקלטה זרמים על פני תיקון. שנה את מתח זלוף פתרונות כרצונכם.
- כאשר תסיים להקליט, לנקות את tubings זלוף, עיפרון על ידי דחיפת קצה דרך המים deionized להימנע כפכפים.
4. נציג תוצאות
במהלך הכנת ביציות עבור מהדק תיקון, הטיפול 50-10 דקות של פתרון הפשטת היה לנתק את קרום vitelline מן הקרום פלזמה, אשר מאפשר הפשטת הממברנה vitelline.
ההתנגדות סדרת האידיאלי של פיפטה את התיקון הוא בין 1-1.5 MΩ כאשר התמלאו פתרון פיפטה ו שקוע בפתרון אמבטיה.
להלן נציג הקלטה של wild-type ערוצי BK על תיקון קרום הביצית. בפינה השמאלית העליונה, גלי רבוע מצביעים על מתח להחיל את התיקון - השלב השני של עליות מתח מ mV 50 עד mV 200 עם תוספת של 50 mV. להלן עקבות הנוכחית המקביל כאשר הפתרון זלוף יש הנומינלי 0 Ca 2 + (חינם [Ca 2 +] הוא כ 0.5 ננומטר). בקמט של משרעת הנוכחי עולה כי ההסתברות לפתוח ערוצי BK עולה עם מתח. בצד ימין, התיקון אותו הוא perfused עם 1.0 מיקרומטר Ca 2 + כאשר מיישמים מתח עם פרוטוקול זהה. משרעת הנוכחי מגדיל יותר תחת מתח אותו, המציין את ההסתברות פתוח עולה עם [Ca 2 +]. 
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מערכת ביטוי הביצית הוא אידיאלי עבור אפיון אלקטרו של מתח תלויי תעלות יונים בשל הרקע נמוך יחסית של ערוצי אנדוגני. יתר על כן, מכיוון שמדובר במערכת ביטוי חולף, הוא מספק שיטה יעילה של ביצוע מחקר mutagenesis הערוצים הללו. עם זאת, ראוי לציין כי מערכת ביטוי הביצית שונה מזו בתאי יונקים, ולכן ייתכנו הבדלים שינוי שלאחר translational ו בשיתוף עם יחידות משנה שונות. יתר על כן, ריכוז השומנים עשוי להיות שונה בין שני תאים אשר עשויים להשפיע על מאפיינים פונקציונליים של הערוץ.
Tubings זלוף, עיפרון קצה יש לנקות עם מים DI בכל פעם לאחר הניסוי, כדי למנוע לסתום. השתמש תמיד טרי אקונומיקה לטפל חוט אלקטרודת Ag כדי לוודא שהוא מצופה AgCl, הקלטה אחרת יהיה לא מדויק. התאם את הגדרות התצורה עבור רכישת נתונים, כך פוטנציאל הבדיקה הוא שווה בדיוק פוטנציאל הפקודה. זה יעזור לשמור על pipettes תיקון כל כך נקי להשתמש במכסה כדי להגן עליהם מפני לכלוך אש רק ללטש אותם לפני השימוש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענקים R01-R01 HL70393 ו-NS060706 כדי JCJC הוא פרופסור להנדסה ביו רפואית על ט ספנסר אולין הקרן.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Perfusion System and Electronic Controller | AutoMate Scientific, Inc. | ValveLink 16 | Inner diameter of perfusion tip: 100 microns |
| Inverted Microscope | Olympus Corporation | CKX31 | |
| Glass Pipettes | VWR international | 53432-921 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Amplifier | Axon Instruments | AXOPATCH 200B | |
| Computer Interface | INSTRUTECH Corporation | ITC-18 | |
| Headstage | Axon Instruments | CV 203BU |
References
- Methfessel, C. Patch clamp measurements on Xenopus laevis oocytes: currents through endogenous channels and implanted acetylcholine receptor and sodium channels. Pflügers Arch. 407, 577-588 (1986).
- Toro, L., Wallner, M., Meera, P., Tanaka, Y. Maxi-K (Ca), Unique Member of the Voltage-Gated K Channel Superfamily. News Physiol. Sci. 13, 112-117 (1998).
- Fettiplace, R., Fuchs, P. A. Mechanisms of hair cell tuning. Annu. Rev. Physiol. 61, 809-834 (1999).
- Du, W. Calcium-sensitive potassium channelopathy in human epilepsy and paroxysmal movement disorder. Nat. Genet. 37, 733-738 (2005).
- Ledoux, J., Werner, M. E., Brayden, J. E., Nelson, M. T., T, M. Calcium-activated potassium channels and the regulation of vascular tone. Physiology (Bethesda). 21, 69-78 (2006).
- Salkoff, L. High-conductance potassium channels of the SLO family. Nat. Rev. Neurosci. 7, 921-931 (2006).
- Shi, J., Cui, J. Intracellular Mg2+ enhances the function of BK-type Ca2+-activated K+ channels. J. Gen. Physiol. 118, 589-606 (2001).
- Magleby, K. L. Gating mechanism of BK (Slo1) channels: so near, yet so far. J. Gen. Physiol. 121, 81-96 (2003).
- Latorre, R., Brauchi, S. Large conductance Ca2+-activated K+ (BK) channel: activation by Ca2+ and voltage. Biol. Res. 39, 385-401 (2006).
- Cox, D. H., Cui, J., Aldrich, R. W., W, R. Allosteric gating of a large conductance Ca-activated K+ channel. J. Gen. Physiol. 110, 257-281 (1997).
- Cui, J., Aldrich, R. W. Allosteric linkage between voltage and Ca2+-dependent activation of BK-type mslo1. K+ channels. Biochemistry. 39, 15612-15619 (2000).
- Yang, H. Activation of Slo1 BK channels by Mg2+ coordinated between the voltage sensor and RCK1. 15, 1152-1159 (2008).
- Lee, U. S., Cui, J. {beta} subunit-specific modulations of BK channel function by a mutation associated with epilepsy and dyskinesia. J. Physiol. , 587-1481 (2009).
