Summary
Corrente ionica dei canali BK è registrato utilizzando tecniche di patch clamp. Canali BK sono espressi in
Abstract
Il protocollo presentato qui è stato progettato per studiare l'attivazione della conduttanza di grandi dimensioni, tensione e Ca 2 +-attivati K + (BK) canali. Il protocollo può essere utilizzato anche per studiare il rapporto struttura-funzione di canali ionici e di altri recettori dei neurotrasmettitori 1. Canali BK sono ampiamente espresse in diversi tessuti e sono stati implicati in molte funzioni fisiologiche, tra cui regolazione della contrazione della muscolatura liscia, regolazione frequenza di cellule ciliate interne e la regolamentazione del rilascio dei neurotrasmettitori 2-6. BK canali sono attivati da depolarizzazione della membrana e dal intracellulare di Ca 2 + e Mg 2 + 6-9. Pertanto, il protocollo è stato progettato per controllare sia il potenziale di membrana e la soluzione intracellulare. In questo protocollo, l'RNA messaggero di canali BK viene iniettato in ovociti di Xenopus laevis (stadio V-VI), seguita da 2-5 giorni di incubazione a 18 ° C 10-13. Patch di membrana che contengono uno o più canali BK sono escisse con l'inside-out configurazione utilizzando tecniche di patch clamp 10-13. Il lato intracellulare della patch è perfuso con soluzioni desiderato durante la registrazione in modo che l'attivazione del canale in condizioni diverse può essere esaminato. Per riassumere, l'mRNA dei canali BK viene iniettato in oociti di Xenopus laevis per esprimere le proteine canale sulla membrana dell'ovocita, tecniche di patch clamp vengono utilizzati per registrare la corrente che fluisce attraverso i canali controllati in tensione e soluzioni intracellulari.
Protocol
1. L'iniezione di mRNA in oociti
- Iniettare ,05-50 ng di RNA messaggero che è stato trascritto in vitro in ovociti di Xenopus laevis (stadio V-VI) con Nanoject II Auto-nanoliter Injector (Drummond società Scientific, modello 3-000-204). Ripetere l'iniezione su una decina di ovociti per ogni mRNA.
- Risciacquare gli ovociti iniettati due volte usando ND-96 soluzione (96 mM di cloruro di sodio (NaCl, il signor 58,44 g / mol), 2 mM di potassio cloruro (KCl, il signor 74,56 g / mol), 1,8 mM di cloruro di calcio (CaCl 2 • 2H 2 O , il signor 147,02), 1 mM di cloruro di magnesio (MgCl 2 • 6H 2 O, il signor 203,31 g / mol), 5 mm 4 - (2-idrossietil)-1-piperazineethanesulfonic acido (HEPES, il signor 238,31 g / mol), 2,5 mM piruvato di sodio (il signor 110,04 g / mol) e 1x penicillina-streptomicina. pH 7,6), poi mettetele in una piastra di coltura e incubare a 18 ° C per 2 giorni +.
2. Preparazione del sistema di perfusione
Illustrazione del ValveLink Automatizzare 16 Sistema di perfusione. Il sistema di perfusione utilizza l'azoto pressurizzato per spingere soluzioni di perfusione fuori dei serbatoi soluzione, attraverso i tubi di perfusione, e la matita perfusione e mancia escluse. Il flusso di ogni flusso della soluzione di perfusione è controllato da una valvola serbatoio e una valvola elettronica. In questo protocollo, uno dei serbatoi non è pressurizzato e funziona come un raccoglitore così come un meccanismo di rilascio della pressione. (Foto adattato da http://www.autom8.com sito venditore)
- Collegare i tubi alla matita perfusione. Accendere il controller valvola elettronica e aprire le valvole elettroniche.
- Per garantire che i tubi e la matita perfusione sono liberi di bolle d'aria e di intasare, spingere deionizzata (DI) attraverso ogni tubo usando una siringa riempita con acqua deionizzata.
- Collegare i tubi ai serbatoi soluzione e aprire la valvola della bombola di gas da applicare azoto pressurizzato.
- Aprire il rubinetto serbatoio per riempire il tubo con la soluzione di riserva. Flick la valvola serbatoio per rimuovere le bolle nella soluzione, se necessario. Chiudere la valvola dopo che il tubo è riempito di soluzione.
- Riempire la punta perfusione con acqua e avvitarlo sulla matita perfusione. Fare attenzione a non intrappolare le bolle quando si collega la punta.
- Fissare la matita perfusione allo stadio bagno con plastilina. Assicurarsi che la punta perfusione è in bagno. Il sistema di perfusione è ora impostato.
- Aggiungere acqua deionizzata nella vasca da bagno. Assicurarsi che la punta perfusione è sommerso in acqua.
- Prova che ogni soluzione perfusione esce dalla punta perfusione correttamente. Chiudere la valvola elettronica collegata al tubo di raccolta dei rifiuti e aprire la valvola per una soluzione di perfusione alla volta (140 mM idrossido di potassio (KOH, M r 56,1 g / mol), 20 mm 4 - (2-idrossietil) -1 - piperazineethanesulfonic acido (HEPES, M r 238,31 g / mol), 2 mM di potassio cloruro (KCl, M r 74,56 g / mol), 1 mM glicol etilenico-bis (2-aminoethylether)-N, N, N ', N'- tetracetico acido (EGTA, M r 380,35 g / mol), il pH è regolato da 7,1-7,2 metansolfonico acido (MESO 3, M r 96,1 g / mol), Ca 2 + e Mg2 + viene aggiunto alla concentrazione desiderata quando necessario). Sotto il microscopio, osservare il getto di liquido di perfusione che esce dalla punta di perfusione. Chiudere la valvola per la soluzione di perfusione e aprire la valvola per la raccolta dei rifiuti. Il getto perfusione dovrebbe quasi scomparire. Ripetere la stessa prova per tutte le soluzioni di perfusione.
- Quando hai verificato che tutte le soluzioni di flusso di perfusione correttamente, sostituire acqua distillata nella vasca da bagno con la soluzione (140 mM idrossido di potassio (KOH, M r 56,1 g / mol), 20 mm 4 - (2-idrossietil)-1-piperazineethanesulfonic acido (HEPES, M r 238,31 g / mol), 2 mM cloruro di potassio (KCl, M r 74,56 g / mol), il pH è regolato da 7,1-7,2 metansolfonico acido (MESO 3, M r 96,1 g / mol)).
3. Patch di serraggio
- Ricopertura l'elettrodo di registrazione Ag con AgCl prima di ogni patch di serraggio sessione. In primo luogo, rimuovere il filo elettrodo dal titolare pipetta e immergere la metà punta del filo elettrodo in un flacone di candeggina fresca per almeno 15 minuti. Questo depositi uno strato di AgCl sul filo.
- Sciacquare il filo elettrodo con acqua deionizzata e asciugare. Quindi installare l'Ag / AgCl indietro nel supporto pipetta.
- Collegare il (di riferimento) elettrodo bagno al headstage e posizionarlo nella vasca da bagno. Questo prepara gli elettrodi per la registrazione.
- Ora preparate per l'acquisizione dei dati. Accendere il computer e inserire la chiave hardware alla porta stampante del computer. La chiave hardware deve essere collegato per poter utilizzare il software di acquisizione dati, che è HEKA impulsi.
- Accendere l'amplificatore (Axon Instruments, AXOPATCH 200B) e iniziare a HEKA Pulse. Caricare il file di protocollo e regolare le impostazioni di configurazione, come la Scala di stimolo. L'obiettivo per regolare le impostazioni di configurazione è di assicurare che il potenziale di test è esattamente uguale al potenziale di comando. Questo prepara le apparecchiature di acquisizione dati.
- Preparare ovociti. Immergere l'ovocita in soluzione stripping (200 mm N-Metil-D-glucamine (NMG, M r 195,22 g / mol), 200 mM aspartato (senza K +) (M r 133,1 g / mol), 2 mM di cloruro di potassio (KCl , M r 74,56 g / mol), 10 mM glicol etilenico-bis (2-aminoethylether)-N, N, N ', N'-tetracetico acido (EGTA, M r 380,35 g / mol), 1 mM di cloruro di magnesio (MgCl 2 • 6H 2 O, M r 203,31 g / mol), 10 mm 4 - (2-idrossietil)-1-piperazineethanesulfonic acido (HEPES, M r 238,31 g / mol), pH viene regolato a 7,4 con idrossido di sodio (NaOH, M r 40,0 g / mol) per 5 - 10 min. La soluzione stripping stacca la membrana vitellina dalla membrana plasmatica, che rende possibile mettere a nudo la membrana vitellina.
- Delicatamente la striscia di membrana vitellina da ovocita usando due paia di pinzette. Un ovocita devitellinized è estremamente fragile e quindi deve essere spostato il meno necessario.
- Avendo cura di evitare di esporre l'ovocita devitellinized a bolle d'aria o, usare una pipetta di vetro riempita con una soluzione sufficiente per trasferire l'ovocita al bagno. Questo prepara l'ovocita per la registrazione.
- Preparare pipette patch. Tirare le pipette di vetro dopo aver inserito un tubo capillare di vetro (VWR International, Cat # 53432-921) in una Sutter P-97 Flaming / Brown Micropipetta Puller. Osservare le pipette al microscopio per determinare la forma della punta e diametro di apertura. Il diametro di apertura dovrebbe essere di 2-4 micrometri.
- Per ridurre la corrente capacitiva durante la registrazione e per garantire una punta liscia, cappotto la punta con la cera e poi il fuoco-polacco.
- Riempire la punta della pipetta posizionando la punta della pipetta all'interno della soluzione di pipetta (140 mM idrossido di potassio (KOH, M r 56,1 g / mol), 20 mm 4 - (2-idrossietil)-1-piperazineethanesulfonic acido (HEPES, M r 238,31 g / mol), 2 mM di cloruro di potassio (KCl, M r 74,56 g / mol), 2 mM cloruro di magnesio (MgCl 2 • 6H 2 O, M r 203,31 g / mol), il pH è regolato da 7,1-7,2 metansolfonico acido (MESO 3, M r 96,1 g / mol)) e il disegno lo stantuffo. Questo bagna la punta.
- Riempire la pipetta 1 / 3 pieno con una soluzione pipetta usando una siringa e inserire la pipetta nel supporto pipetta con l'Ag / AgCl all'interno elettrodo e contatto con la soluzione di pipetta. Questo prepara la pipetta di patch.
- Per accise uno inside-out patch dal ovocita preparato, trovare il chiaro vantaggio di ovociti al microscopio. Spostare la pipetta di patch vicino al ovociti mediante manipolatore. Registrare la resistenza di serie pipetta. La resistenza serie ideale della pipetta patch è tra 1-1,5 MΩ quando è riempita con una soluzione di pipetta e immersi in una soluzione da bagno.
- Spingere lentamente la pipetta contro l'ovocita fino a quando la resistenza raddoppia.
- Applicare aspirazione delicato per la membrana per via orale attraverso un tubo di aspirazione che è collegato al titolare pipetta fino a quando un giga ohm sigillo è ottenuto. Stabilizzare la patch tenendolo in tensione -30 mV per un paio di minuti.
- Per ottenere un inside-out patch, la patch da accise rapidamente spingendo la pipetta ulteriormente nel citoplasma dell'ovocita e poi delicatamente tirando fuori.
- L'inside-out patch è ora pronto per il bloccaggio. Spostare la pipetta tenendo la inside-out patch per circa 100 micron di distanza dall'apertura della punta perfusione.
- Chiudere la valvola elettronica per la raccolta dei rifiuti e aprire la valvola serbatoio per la soluzione di perfusione desiderato
- Iniziare a registrare le correnti attraverso la patch. Modificare le soluzioni di tensione e perfusione come desiderato.
- Quando si è finito di registrare, pulire la perfusione tubi, matita e punta spingendo attraverso l'acqua deionizzata per evitare intasamenti.
4. Rappresentante Risultati
Durante la preparazione di ovociti per la patch clamp, il trattamento 5-10 min di soluzione stripping sarebbe staccare la membrana vitellina dalla membrana plasmatica, che rende possibile togliere la membrana vitellina.
La resistenza serie ideale della pipetta patch è tra 1-1,5 MΩ quando è riempita con una soluzione di pipetta e immersi in una soluzione da bagno.
Che segue è una registrazione rappresentante della wild-type canali BK su una patch di membrana dell'ovocita. In alto a sinistra, le onde quadre indicano la tensione applicata la patch - il secondo passo di aumenti di tensione da 50 mV a 200 mV con incrementi di 50 mV. Di seguito le tracce corrispondente corrente quando la soluzione di perfusione è nominale 0 Ca 2 + (libero [Ca 2 +] è di circa 0,5 nM). L'apiega di ampiezza della corrente indica che la probabilità di apertura dei canali BK aumenta con la tensione. Sul lato destro, la stessa patch è perfuso con 1.0 mM Ca 2 + quando è applicato con il protocollo stessa tensione. L'ampiezza della corrente aumenta di più sotto la stessa tensione, indicando che la probabilità aumenta con l'aperta [Ca 2 +]. 
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Il sistema di espressione degli ovociti è ideale per la caratterizzazione elettrofisiologica di canali voltaggio-dipendenti di ioni a causa di fondo relativamente basso di canali endogeni. Inoltre, poiché si tratta di un sistema di espressione transiente, fornisce un metodo efficiente di eseguire studi di mutagenesi di questi canali. Tuttavia, va notato che il sistema di espressione ovocita è diverso da quello in cellule di mammifero, quindi ci possono essere differenze di modificazioni post-traduzionali ed associazioni con diverse subunità. Inoltre, la concentrazione dei lipidi possono differire tra le due cellule che possono incidere sulle proprietà funzionali del canale.
I tubi perfusione, matita e la punta deve essere pulito con acqua deionizzata ogni volta dopo l'esperimento per evitare di intasare. Usare sempre candeggina fresca per curare il filo elettrodo Ag per assicurarsi che sia ricoperto di AgCl, altrimenti registrazione sarà impreciso. Regolare le impostazioni di configurazione per l'acquisizione dei dati in modo che il potenziale di test è esattamente uguale al potenziale di comando. Sarebbe utile per mantenere il pipette cerotto pulito in modo da utilizzare un coperchio per proteggerli dallo sporco e li fuoco lucidare solo prima dell'uso.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of concede Salute R01-R01-HL70393 e NS060706 a JCJC è Professore di Ingegneria Biomedica sul Spencer T. Olin Endowment.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Perfusion System and Electronic Controller | AutoMate Scientific, Inc. | ValveLink 16 | Inner diameter of perfusion tip: 100 microns |
| Inverted Microscope | Olympus Corporation | CKX31 | |
| Glass Pipettes | VWR international | 53432-921 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Amplifier | Axon Instruments | AXOPATCH 200B | |
| Computer Interface | INSTRUTECH Corporation | ITC-18 | |
| Headstage | Axon Instruments | CV 203BU |
References
- Methfessel, C. Patch clamp measurements on Xenopus laevis oocytes: currents through endogenous channels and implanted acetylcholine receptor and sodium channels. Pflügers Arch. 407, 577-588 (1986).
- Toro, L., Wallner, M., Meera, P., Tanaka, Y. Maxi-K (Ca), Unique Member of the Voltage-Gated K Channel Superfamily. News Physiol. Sci. 13, 112-117 (1998).
- Fettiplace, R., Fuchs, P. A. Mechanisms of hair cell tuning. Annu. Rev. Physiol. 61, 809-834 (1999).
- Du, W. Calcium-sensitive potassium channelopathy in human epilepsy and paroxysmal movement disorder. Nat. Genet. 37, 733-738 (2005).
- Ledoux, J., Werner, M. E., Brayden, J. E., Nelson, M. T., T, M. Calcium-activated potassium channels and the regulation of vascular tone. Physiology (Bethesda). 21, 69-78 (2006).
- Salkoff, L. High-conductance potassium channels of the SLO family. Nat. Rev. Neurosci. 7, 921-931 (2006).
- Shi, J., Cui, J. Intracellular Mg2+ enhances the function of BK-type Ca2+-activated K+ channels. J. Gen. Physiol. 118, 589-606 (2001).
- Magleby, K. L. Gating mechanism of BK (Slo1) channels: so near, yet so far. J. Gen. Physiol. 121, 81-96 (2003).
- Latorre, R., Brauchi, S. Large conductance Ca2+-activated K+ (BK) channel: activation by Ca2+ and voltage. Biol. Res. 39, 385-401 (2006).
- Cox, D. H., Cui, J., Aldrich, R. W., W, R. Allosteric gating of a large conductance Ca-activated K+ channel. J. Gen. Physiol. 110, 257-281 (1997).
- Cui, J., Aldrich, R. W. Allosteric linkage between voltage and Ca2+-dependent activation of BK-type mslo1. K+ channels. Biochemistry. 39, 15612-15619 (2000).
- Yang, H. Activation of Slo1 BK channels by Mg2+ coordinated between the voltage sensor and RCK1. 15, 1152-1159 (2008).
- Lee, U. S., Cui, J. {beta} subunit-specific modulations of BK channel function by a mutation associated with epilepsy and dyskinesia. J. Physiol. , 587-1481 (2009).
