Summary
BK 채널 이온 전류는 패치 클램프 기법을 사용하여 기록됩니다. BK 채널로 표현됩니다
Abstract
여기에 제시 프로토콜은 대형 전도, 전압 및 칼슘 2 + - 활성 K + (BK)이 채널의 활성화를 연구하기 위해 설계되었습니다. 프로토콜은 다른 이온 채널과 신경 전달 물질 수용체 1 구조 - 기능 관계를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. BK 채널 널리 여러 조직에서 표현되고 평활근의 수축 규제, 내부 세포의 주파수 튜닝 및 신경 전달 물질 릴리스 2-6 규제 등 많은 생리 기능에 연루되어있다. BK 채널 막에 의해 탈분극 및 세포내 칼슘 2 +와 MG 2 + 6-9로 활성화됩니다. 따라서 프로토콜은 막 전압과 세포내 솔루션을 모두 제어할 수 있도록 설계되었습니다. 이 프로토콜에서는 BK 채널 메신저 RNA는 18 ° C 10-13에서 부화 후 2-5 일 뒤에 Xenopus laevis의 oocytes (무대 V - VI)에 주입합니다. 하나 또는 여러 개의 BK 채널을 포함하는 막 패치는 내부 아웃 구성을 패치 클램프 기법 10-13 사용에 excised됩니다. 패치의 세포 측면은 서로 다른 조건에서 채널 정품 인증 심사 수 있도록 녹음 중 원하는 솔루션을 perfused 있습니다. 요약하면, BK 채널의 mRNA는 oocyte 막에 채널 단백질을 표현하는 Xenopus laevis의 oocytes로 주입되며 패치 클램프 기법 제어 전압과 세포내 솔루션에서 채널을 통해 흐르는 전류를 기록하는 데 사용됩니다.
Protocol
1. Oocytes에 mRNA의 분사
- 0.05을 주사 - Nanoject II 자동 Nanoliter 주입기 (드루먼드 과학 회사, 모델 3-000-204)를 사용하여 Xenopus laevis의 oocytes (무대 V - VI)로 체외에서 베꼈는데했습니다 50 NG 전령 RNA합니다. 각각의 mRNA에 대한 열 oocytes에서 주사를 반복합니다.
- 두 번 사용하여 주입 oocytes 씻어 ND를 - 96 솔루션 (96 MM 나트륨 염화물 (NaCl, 미스터 58.44 g / 몰), 2 MM의 칼륨 염화물 (KCl, 미스터 74.56 g / 몰), 1.8 MM의 염화칼슘 (CaCl 2 • 2 시간 2 O 씨 147.02), 1 MM 마그네슘 염화물 (MgCl 2 • 6H 2 O 씨, 203.31 g / 몰), 5 MM 4 - (2 - 히드록시 에틸) - 1 - piperazineethanesulfonic 산 (HEPES, 미스터 238.31 g / 몰), 2.5 MM 나트륨 pyruvate (씨 110.04 g / 몰) 및 1X 페니실린 - 스트렙토 마이신. 산도 7.6)은 다음 18 문화 판과 부화에 배치 ° 2 +의 일 C.
2. 재관류 시스템 준비
자동화 ValveLink 16 재관류 시스템의 일러스트. 재관류 시스템은 재관류의 tubings 통해 솔루션 저수지의 재관류 솔루션을 밖으로 밀어 가압 질소를 사용하고, 재관류의 연필과 팁합니다. 재관류 솔루션의 각 스트림의 흐름을 한 저수지 밸브 하나의 전자 밸브에 의해 제어됩니다. 이 프로토콜에서는, 저수지 중 하나는 폐기물 수집뿐 아니라 압력 릴리스 메커니즘으로 가압 및 기능하지 않습니다. (사진은 공급 업체의 웹 사이트 http://www.autom8.com에서 적응)
- 재관류의 연필에 tubings를 연결합니다. 전자 밸브 컨트롤러의 전원을 켜고 전자 밸브를 엽니다.
- 탈이온수 가득한 주사기를 사용하여 각 튜브를 통해 deionized (DI) 물을 밀어 tubings 및 재관류의 연필이 나막신과 공기 거품없는 것을 확신합니다.
- 솔루션 저수지에 tubings를 연결하고 가압 질소를 적용하는 실린더 가스의 밸브를 엽니다.
- 저수지 솔루션 튜빙을 채우기 위해 저수지 밸브를 엽니다. 필요한 경우 솔루션에 거품을 제거하기 위해 저수지 밸브를 버려. 튜빙이 솔루션으로 가득 후 밸브를 닫습니다.
- 물로 세례 팁을 입력하고 재관류의 연필에 그것을 나사. 팁을 연결할 때 모든 거품을 함정하지 않도록주의하십시오.
- 모델링 점토를 사용하여 목욕 단계에 재관류의 연필을 수정. 재관류 팁는 목욕 공간에 있는지 확인하십시오. 재관류 시스템은 지금 설정됩니다.
- 욕조에 물을 DI를 추가합니다. 재관류 팁이 물 속에 빠져들 있는지 확인하십시오.
- 각 재관류 솔루션이 제대로 재관류 팁 나오는 것 테스트합니다. 쓰레기 수집기의 튜브에 연결된 전자 밸브를 닫고 한 번에 하나의 재관류 솔루션 (140 MM의 칼륨 수산화 (코에 대한 밸브를 열어 M R 56.1 g / 몰), 20 MM 4 - (2 - 히드록시 에틸) -1 - piperazineethanesulfonic 산 (HEPES, M R 238.31 g / 몰), 2 MM의 칼륨 염화물 (KCl, M R 74.56 g / 몰), 1 MM 에틸렌 글리콜 - 비스 (2 - aminoethylether) - N, N, N ', N' - tetraacetic 산 (EGTA, M R 380.35 g / 몰)는 산도가 methanesulfonic 산성 (MeSO 3, M R 96.1 g / 몰), CA 2 7.1-7.2하도록 조정됩니다 +이나 Mg2 + 필요할 때) 원하는 농도에 추가됩니다.이 현미경, 재관류 팁 나오는 재관류 유체의 제트를 관찰합니다. 재관류 솔루션을위한 밸브를 닫고 쓰레기 수집기를 위해 밸브를 엽니다. 재관류 제트는 거의 사라질 것입니다. 모든 재관류 솔루션에 대해 동일한 시험을 반복합니다.
- 제대로 모든 재관류 솔루션 흐름을 확인했으면, 목욕 솔루션 욕조 (140 MM의 칼륨 수산화 (코에서 DI 워터를 교체 M R 56.1 g / 몰), 20 MM 4 - (2 - 히드록시 에틸) - 1 - piperazineethanesulfonic 산 (HEPES, M R 238.31 g / 몰), 2 MM의 칼륨 염화물 (KCl, M R 74.56 g / 몰)는 산도가 methanesulfonic 산성 (MeSO 3, M R 96.1 g / 몰))에 의해 7.1-7.2로 조정됩니다.
3. 패치 클램핑
- Recoat AgCl과 자세 기록 전극은 각 패치는 세션을 클램핑하기 전에. 첫째, 피펫 홀더 및 잠수함 적어도 15 분 동안 신선한 표백제가 들어있는 유리병에 전극 와이어의 끝에 절반의 전극 와이어를 제거합니다. 와이어에 AgCl의이 예금은 레이어.
- 탈이온수으로 전극 와이어를 씻어 건조 얼룩. 다음 피펫 홀더에 다시 자세 / AgCl 전극을 설치합니다.
- headstage에 목욕 (참조) 전극을 연결하고 목욕에 놓으십시오. 이것은 기록을위한 전극을 준비합니다.
- 이제 데이터 수집을위한 준비. 컴퓨터를 켜고 컴퓨터의 프린터 포트에 하드웨어 키를 꽂습니다. 당신이 HEKA 파동있는 데이터 수집 소프트웨어를 사용하는 하드웨어 키를 연결해야합니다.
- (액슨 인 스트 루먼트, AXO 앰프에 스위치패치 200B) 및 시작 HEKA 펄스. 같은 자극 규모로, 프로토콜 파일을로드하고 구성 설정을 조정합니다. 구성 설정을 조정 목표는 테스트 가능성이 명령 잠재 정확히 같다는 것을 보증하는 것입니다. 이것은 데이터 수집 장비를 준비합니다.
- oocytes를 준비합니다. 스트립 솔루션에서 잠수함 oocyte (200 MM N - 메틸 - D - glucamine (NMG, M R 195.22 g / 몰), 200 MM의 Aspartate (NO K +) (M R 133.1 g / 몰), 2 MM 염화칼륨 (KCl , M R 74.56 g / 몰), 10 MM 에틸렌 글리콜 - 비스 (2 - aminoethylether) - N, N, N ', N' - tetraacetic 산 (EGTA, M R 380.35 g / 몰), 1 MM 마그네슘 염화물 (MgCl 2 • 6H 2 O, M R 203.31 g / 몰), 10 MM 4 - (2 - 히드록시 에틸) - 1 - piperazineethanesulfonic 산 (HEPES, M R 238.31 g / 몰)는 산도가 (NaOH, 수산화 나트륨에 의해 7.4로 조정됩니다 5 M R 40.0 g / 몰) -. 10 분 스트립 솔루션은 가능한 vitelline 막 제거하기 위해서 만드는 플라즈마 막에서 vitelline 멤브레인를 분리합니다.
- 부드럽게 포셉 두 쌍을 사용하여 oocyte에서 vitelline 막을 스트립. devitellinized oocyte 필요로 작은로 매우 연약하기 때문에 이동해야합니다.
- 공기 또는 거품에 devitellinized oocyte를 노출되지 않도록 돌보는 것은 욕조에 oocyte를 전송하기에 충분한 해결책 가득한 유리 피펫을 사용합니다. 이 기록에 대한 oocyte를 준비합니다.
- 패치 pipettes 준비. 서터 P - 97 플라밍 / 브라운 Micropipette 풀러에 유리 모세관 (VWR 인터내셔널, 고양이 # 53432-921)을 삽입 후 유리 pipettes을 당기세요. 팁 모양과 개방 직경을 결정하는 현미경 pipettes을 준수. 여는 직경 2-4 micrometers해야합니다.
- 녹화 중에 용량성 전류를 감소하고 부드러운 팁, 코팅 왁스로 끝부분을 보장하기 위해 다음을 해고 - 폴란드어.
- (2 - 히드록시 에틸) - 1 - piperazineethanesulfonic 산 (HEPES, M R - 피펫 솔루션 (140 MM의 칼륨 수산화 (코, M R 56.1 g / 몰), 20 MM 네 안에있는 피펫의 팁을 배치하여 피펫 팁을 작성 238.31 g / 몰), 2 MM의 칼륨 염화물 (KCl, M R 74.56 g / 몰), 2 MM 마그네슘 염화물 (MgCl 2 • 6H 2 O, M R 203.31 g / 몰)는 산도가 methanesulfonic으로 7.1-7.2로 조정됩니다 산성 (MeSO 3, M R 96.1 g / 몰))와 플런저를 그리기. 이것은 끝에 오줌 싼다.
- 주사기를 사용하여 피펫 솔루션 피펫 전체 1 / 3 입력하고 자세 / AgCl 전극 내부 피펫 솔루션 문의와 피펫 홀더에 피펫을 놓으십시오. 이것은 패치 피펫을 준비합니다.
- 준비 oocyte에서 소비세 내부 아웃 패치를하려면, 현미경 oocyte의 명확한 가장자리를 찾으십시오. 조작하는 사람을 사용하여 oocyte 가까운 패치 피펫을 이동합니다. 피펫의 일련 저항을 기록합니다. 패치 피펫의 이상적인 직렬 저항은 피펫 솔루션 가득, 욕실 솔루션에 빠져들 때 MΩ 1-1.5 사이입니다.
- 저항이 약 두 배로 때까지 천천히 oocyte에 대한 피펫 밀어.
- 기가 - 옴 밀봉을 얻을 때까지 피펫 홀더에 연결된 흡입 튜브를 통하여 입안으로 멤브레인에 부드러운 흡입을 적용합니다. 몇 분 동안은 전압 -30 MV에서 개최하여 패치를 안정화.
- 빨리 oocyte에 추가로 피펫을 밀고하고 부드럽게 그것을 철수하여 내부 아웃 패치, 소비세에게 패치를 구하십시오.
- 내부 아웃 패치 클램핑 이제 준비가되었습니다. 재관류 팁의 개통 떨어져 약 100 미크론에 내부 아웃 패치를 들고 피펫 이동합니다.
- 폐기물 수집에 대한 전자 밸브를 닫고 원하는 재관류 솔루션을위한 저수지의 밸브를 열어
- 패치를 통해 전류를 녹음 시작합니다. 원하는대로 전압과 재관류 솔루션을 변경합니다.
- 당신은 녹음을 완료하면, 나막신을 피하기 위해 탈이온수을 통해 추진하여 재관류의 tubings, 연필 및 팁을 청소하십시오.
4. 대표 결과
패치 클램프에 대한 oocytes의 준비 기간 동안, 스트립 솔루션의 50-10 분 치료 vitelline 막가 벗겨진 가능하게 플라즈마 막에서 vitelline 멤브레인를 분리합니다.
패치 피펫의 이상적인 직렬 저항은 피펫 솔루션 가득, 욕실 솔루션에 빠져들 때 MΩ 1-1.5 사이입니다.
다음은 oocyte 막 패치에 야생 형 BK 채널의 대표적인 기록이다. 50 MV 50 MV의 증가 200 MV 전압 증가의 두 번째 단계 - 왼쪽 상단에서 광장 파도 패치에 적용된 전압을 나타냅니다. 아래 재관류 솔루션 공칭 0 칼슘 2 + (무료 [칼슘 2 +]는 약 0.5 nm의)이 해당 현재의 흔적입니다. 에현재 진폭의 포복 절도는 BK 채널의 개방 가능성이 전압 증가시킬 수있다는 것을 나타냅니다. 오른쪽에서 동일한 패치는 1.0 μm의 칼슘 2 perfused입니다 + 같은 전압 프로토콜 적용하면. 현재 진폭은 오픈 확률 [칼슘 2 +]로 증가시킬 수있다는 것을 나타내는 같은 전압에 따라 더 증가합니다. 
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Discussion
oocyte 표현 시스템은 내생 채널 상대적으로 낮은 배경에 의한 전압 - 의존 이온 채널의 electrophysiological 특성에 이상적입니다. 또한, 그것이 일시적 표현 시스템이기 때문에, 그것은 이러한 채널의 돌연변이 유발 연구를 수행하는 효율적인 방법을 제공합니다. 그러나, 그것이 oocyte 표현 시스템은 포유 동물 세포에서 다른 것을 지적해야하므로 다른 subunits와 포스트 translational 수정 및 결사의 차이가있을 수 있습니다. 또한 지질 농도는 채널의 기능적 속성을 영향을 미칠 수있는 두 셀 사이에 다를 수 있습니다.
재관류의 tubings, 연필과 팁은 DI 워터와 방해할을 피하기 위해 실험 후 매번 청소해야합니다. 항상 그것이 녹음이 정확합니다 그렇지 않으면, AgCl로 코팅되어 있는지 확인하는 자세 전극 와이어를 치료하기 위해 새로운 표백제를 사용합니다. 테스트 잠재력이 명령 잠재력을 정확히 동일하므로 데이터 수집에 대한 구성 설정을 조정합니다. 그것은 깨끗한 패치 pipettes 너무 먼지만을 사용하기 전에 그들을 해고 - 폴란드어에서 그들을 보호하기 위해 뚜껑을 사용하여 유지하는 도움이 될 것입니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 건강 보조금 R01 - HL70393 및 JCJC에 R01 - NS060706 국립 연구소에 의해 지원되었다 스펜서 T. 올린 엔다우먼트에 의생명 공학 교수이다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Perfusion System and Electronic Controller | AutoMate Scientific, Inc. | ValveLink 16 | Inner diameter of perfusion tip: 100 microns |
| Inverted Microscope | Olympus Corporation | CKX31 | |
| Glass Pipettes | VWR international | 53432-921 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Amplifier | Axon Instruments | AXOPATCH 200B | |
| Computer Interface | INSTRUTECH Corporation | ITC-18 | |
| Headstage | Axon Instruments | CV 203BU |
References
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