הכנת תרבויות העצבית מ Midgastrula עוברים שלב תסיסנית

Summary

וידאו זה מדגים את הכנת תרבויות עצבי ראשוני midgastrula עוברים שלב תסיסנית. צפיות של תרבויות לחיות להראות תאים 1 שעה לאחר ציפוי הנוירונים הבדיל אחרי 2 ימים של גידול בינוני ביקרבונט מבוססי מוגדר. הנוירונים הם להתרגש חשמלית וליצור קשרים סינפטיים.

Abstract

וידאו זה ממחיש את הליך קבלת תרבויות עצבי ראשוני midgastrula עוברים שלב תסיסנית. שיטות לאיסוף עוברים dechorionation שלהם באמצעות אקונומיקה הם הפגינו. שימוש pipet זכוכית המחובר לצינור שאיבה בפה, אנו ממחישים את סילוק כל התאים מעוברים יחיד. השיטה לפיזור תאים מכל embyro לתוך ירידה (5 ליטר) קטן בינוני על coverslip זכוכית ללא ציפוי מודגם. מבט מבעד למיקרוסקופ בשעה 1 לאחר ציפוי ממחיש את צפיפות התאים המועדפת. רוב התאים שורדים כאשר גדל מוגדר בינוני הם neuroblasts כי לחלק אחד או יותר פעמים בתרבות לפני הרחבת תהליכי מדלקת עצבים של 12-24 שעות. מבט מבעד למיקרוסקופ ממחיש את רמת תולדה neurite ו הסתעפות צפוי בתרבות בריא 2 ימים במבחנה. תרבויות מגודלים ביקרבונט פשוטה מבוסס מוגדר בינוני, ב 5% CO ₂ באינקובטור ב 22-24 ° C. תהליכים מדלקת עצבים להמשיך לפרט על השבוע הראשון בתרבות וכשהם ליצור קשר עם neurites מן התאים השכנים הם לעתים קרובות בצורה קשרים סינפטיים תפקודית. הנוירונים בתרביות אלה מבטאים מתח מגודרת נתרן, סידן, אשלגן תעלות והם להתרגש חשמלית. מערכת זו תרבות שימושי ללימוד גורמים גנטיים וסביבתיים מולקולרית המווסתים התמיינות רגישות עצבית, היווצרות הסינפסה / פונקציה.

Protocol

I. תסיסנית אוסף עובריים

1. הכן אוסף צלחות ביצה
   1. מרתיחים 200 מ"ל DH ₂ O עם אגר 8 גרם
   2. מצננים 50 ° C
   3. הוסף 2 מ"ל EtOH ו 2 מ"ל חומצה אצטית
   4. יוצקים לתוך פלסטיק 35 צלחות פטרי מ"מ, צמרות
   5. מצננים ומאחסנים במיכל אוויר חזק ב 4 ° C
   6. גורם כ -80 צלחות
2. הכן משחה שמרים
   1. ממיסים את השמרים Fleishmans אפיה פעיל במים ליצירת הדבק
   2. מיקרוגל במשך 20-30 שניות להרוג את השמרים (להיזהר רותחים)
   3. חנות בתוך מזרק 10 סמ"ק (בלי מחט) בשעה 4 מעלות צלזיוס למשך 2 שבועות
3. זבובים: המבוגרים המשמש לאיסוף ביצים הם בדרך כלל פורה ביותר בין 3 ל 14 ימים לאחר המתעוררים, מתן כי יש להם היתה גישה מזון טרי. מניות מוטנטים רבים יש ירידה בפוריות שיכולה להתבטא בשיעור הוריד הנחת ביצה שינוי הגיל שבו הם הפוריים ביותר. בדרך כלל, כמה מאות מבוגרים לגרום לאוכלוסייה ההטלה טוב.
4. נוהל: מורחים שכבה דקה של שמרים להדביק על צלחת אוסף ביצה. זו מספקת מצע נוח הנחת ביצים. בוגר העברת טס בקבוק אוסף נקי ביצה הקלטת צלחת אוסף אל פיו של הבקבוק. אל תשאיר את זבובים הבקבוקים האלה יותר מ 3-4 שעות כמו הלחות עולה והזבובים להיתקע להדביק על דפנות הבקבוק.

השנייה. העובר Dechorionation עם אקונומיקה

1. הגדרת משפך בוכנר מחובר הבקבוק מסנן המחובר aspirator. שימו פיסת נייר Whatman # 1 ב המשפך. עם יניקה זורמים, להרטיב את הנייר עם מים מזוקקים סטריליים.
2. לשטוף עוברים מן אוסף צלחות על נייר הסינון עם זרם של מים מבקבוק לשטוף.
3. יש לשטוף אותם בכמה כרכים של מים סטריליים, לכבות aspirator, ולאחר מכן להוסיף נפח משפך של אקונומיקה 50%. בואו ביצים לשבת 5-10 דקות. Chorions יהיה מומס 1-2 דקות, אבל ככל שאתה עוזב את העוברים אקונומיקה יותר של השמרים לזהם יושמדו. בחרו כל המבוגרים או זחלים אשר שטפה צלחת.
4. שוטפים את העוברים לתוך צלחת פטרי סטרילית (לא בתרבית רקמה) עם מים מזוקקים סטריליים. רבים מן העוברים ידבק בתחתית המנה אם זה לא היה מראש הרטובות. יש לשטוף מספר פעמים עם מים סטריליים בכלי זה.
5. בדוק את העוברים באור מועבר לברור אמצע gastrula עוברים שלב.

ג. הכנת תרביות העובר יחיד

1. הפוך את DDM1 (ראה מתכונים בסעיף IV)
2. יוצקים מים מעל צלחת של עוברים רק לפני culturing. כיסוי עוברים עם התקשורת סטרילית.
3. הגדר את 3, 35 מ"מ בצלחות פטרי. מכניסים 4 coverslips עגול autoclaved בכל צלחת. ביום coverslip כל, לשים 5 μl של המדיום. השתמש Bellco coverslips נמוך זכוכית coverlips להוביל.
   
   Bellco ביולוגית זכוכית
   800-257-7043
   חתול # 1943-00012
   
   
4. משוך כמה pipets משובח למדי. Pipets אנו משתמשים נמשכים על חולץ Narishige PP-83. המידות המדויקות של pipet אינם מכריעים, ואנחנו בדרך כלל למשוך אותם עדין יותר שאנחנו רוצים אותם לנתק את קצה באותו שדה הראייה כפי העובר כדי לאמוד את גודל. אתה לא רוצה להתחנף כל העוברים בבת אחת, ואת שלך לא רוצה טיפ קטן כל כך, כי זה לוקח 5 דקות למצוץ את התאים. כוון איפשהו באמצע. בדוק את העוברים עם האור המועבר ולהשתמש הפה צינור יניקה המחובר pipet כדי להסיר את התוכן של העובר. לפזר את התאים על coverslip שהוכן על ידי גירוש בעדינות את התאים coverslip קרוב ככל האפשר. אולי כדאי לבחון את coverslips בהספק גבוה עוד יותר לפזר את התאים באותו אופן.
5. בואו התאים לשבת לא יותר מ 10 דקות. המבול צלחת עם התקשורת ולשים חממה, CO ₂ בסביבה 4-5%, אם באמצעות מוגדר בינוני. טמפרטורות בין 22-24 ° C. אנו משתמשים באופן שגרתי 23 ° C ו 95% לחות. לחות היא חשובה, כמו שאתה רוצה, כדי למנוע אידוי. ניתן להשתמש החממה יונקים תקן להציב coldroom עם בקרת טמפרטורה מוגדר 23 ° C.

IV. DDM1 מוגדר בינוני לגידול התרבויות

1. הפוך את DMEM: כדי 100 MLS של מדיה F12/DME חם של (DMEM) (אירווין מדעי # 9052).
   1. הוסף 0.476 גרם Hepes (20mm) (Sigma # H-3375). מערבבים.
   2. הוסף 1.25 L-גלוטמין 200 מ"ל מ"מ (אירווין מדעי # 9317). מערבבים.
   3. סנן ברדס עם 0.2 מיקרומטר אצטט מזרק המסנן (צריך 2 פילטרים).
   4. PH הוא 6.64 ו OSM 288.
   5. הפוך את aliquots של 10 מ"ל ב צינורות צנטריפוגה 15 מ"ל.
   6. חנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מ -2 שבועות.
      
      הערה: תמיד להשתמש במים מסוננים autoclaved ולעשות במיכלים כי שמורים מדיה תוספי בלבד. לעולם לא לשים אלקטרודה pH או לבחוש בר משמש למטרות אחרות Media.To לעשות DDM1: תוספי הוסף המפורטים להלןכדי DMEM קצר לפני culturing.
      
      
2. כדי 10 MLS של DMEM להוסיף:
   • 100 μl transferrin
   • 100 μl Putrescine
   • 100 μl סלניום
   • 100 μl הפרוגסטרון
   • 50 μl אינסולין

Discussion

בתרבויות תסיסנית מוכן מעוברים בשלב midgastrula הנוירונים נובעים מבשרי neuroblast, שרבים מהם מחלקים לפני בידול במבחנה. מערכת זו ובכך מספק הזדמנות ייחודית למחקר של גורמים גנטיים וסביבתיים חשובים בשלבים מוקדמים מאוד של התפתחות עצבית (Rohrbaugh et al., 2003). הראינו כי נוירונים שגודלו בינוני מוגדר פשוט להתמיין לנוירונים להתרגש חשמלית כי גם טופס קשרים סינפטיים תפקודית (O דאוד, 1995; לי O דאוד, 1999). באמצעות אנליזה של מוטציות ו / או מניפולציות תרופתי, בשילוב עם תקן כל הקלטה טכניקות תא מערכת מודל זה יכול לשמש כדי לחקור את תפקיד גנים וגורמים סביבתיים מעורב בפיתוח של עירור חשמלי בשידור סינפטי (הודג'ס et al, 2002;. Lee ו-O דאוד, 2000; Lee et al, 2003)..

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila melanogaster	Animal			Fruit flies
Transferrin	Reagent	Sigma-Aldrich	T-1147	100x Stock: 10 mg/ml in water. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C.
Insulin		Sigma-Aldrich	I-6634	200x Stock: 10 mg/ml in 0.05N HCl. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 120 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C.
Putrescine		Sigma-Aldrich	P-5780	100x Stock: 10 mM in ddH2O. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20 C
Selenium		Sigma-Aldrich	S-5261	100x Stock: 3 uM in ddH2O. Put 0.0051 g Selenium in a 15 ml tube labeled A (3 mM stock). Add 10 ml of sterile water. Take 10 ul from Tube A to Tube B with 10 ml ddH2O (3 uM stock). Filter Tube B through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C
Progesterone		Sigma-Aldrich	P-6149	100x Stock: 2 ug/ml1.Add 1ml of 100% EtOH to 0.001 g Progesterone bottle2.Add 49 ml ddH2O3.Transfer 1 ml of this to second tube with 9 ml ddH2O4.Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate)5.Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C
DDM1	Medium			To 10 mls of DMEM add from stocks:100 ul Transferrin, 100 ul Putrescine,100 ul Selenium,100 ul Progesterone, 50 ul Insulin
Petri dishes
Cover-slips		Bellco Glass	1943-00012	Low lead glass, autoclaved.
Paper filter		Whatman, GE Healthcare	#1
10cc syringe	Tool
The cultures made in this media must be maintained in a 5% CO2 incubator at about 22-24°C. We use a standard mammalian tissue culture incubator placed in a cold room and heated to 23°C. Always used autoclaved filtered water and make in containers that are reserved for media and supplements only. Never put a pH meter or stir bar used for other purposes in media.