Midgastrulaステージショウジョウバエの胚からの神経培養の準備

Summary

このビデオはmidgastrulaステージショウジョウバエの胚からの一次ニューロン培養の準備を示しています。ライブ文化の景色は、重炭酸塩ベースの定義培地での生育の2日後に細胞を1めっき後の時間と分化した神経細胞を示す。神経細胞は電気的興奮性であり、シナプス結合を形成する。

Abstract

このビデオはmidgastrulaステージショウジョウバエの胚からの主ニューロン培養を行うための手順を示しています。漂白剤を使用して、胚とそのdechorionationを収集するための方法が実証されています。口の吸引管に接続されているガラスピペットを用いて、我々は、単一の胚からのすべてのセルの除去を示しています。コー​​ティングされていないガラスのカバースリップ上で培地の小さな（5リットル）ドロップに各embyroから細胞を分散させるための方法が示されている。めっき後の1時間での顕微鏡を使用してビューには、好ましい細胞密度を示しています。定義された培地中で増殖させた場合、生存細胞のほとんどは12-24時間で神経突起のプロセスを拡張する前に、文化に1回以上の分割神経芽です。顕微鏡を使用してビューには、神経突起伸長のレベルを示し、in vitroで2日間で健全な文化の中で期待分岐を。培養は22〜24℃、5％CO ₂インキュベーター中で、定義された培地をベースにシンプルな炭酸で栽培されています神経突起のプロセスは、文化としたとき、彼らはしばしば機能的なシナプス結合を形成する隣接セルからの神経突起と接触するように最初の週にわたって詳しく説明し続ける。これらの培養物における神経細胞は、電位依存性ナトリウム、カルシウム、カリウムチャネルを発現しており、電気的興奮性があります。この培養系は、ニューロンの分化、興奮性、およびシナプス形成/機能を調節する分子遺伝学的要因と環境要因を研究するために有用です。

Protocol

I.ショウジョウバエの胚のコレクション

1. 卵のコレクションプレートを準備
   1. 8グラムの寒天を加えて200mlのdH ₂ Oを沸かす
   2. 50℃まで冷却
   3. 2ミリリットルエタノール、2mlの酢酸を追加
   4. トップス、35mmプラスチックシャーレに注ぐ
   5. クールと4で気密容器° Cで保管
   6. 約80枚になります
2. 酵母ペーストを準備する
   1. 貼り形成するために水にFleishmansアクティブベーキング酵母を溶かす
   2. 酵母を殺すために20〜30秒のためのマイクロ波（以上沸騰に注意）
   3. 4℃で2週間で10 ccシリンジ（針なし）で保管して
3. ハエ：卵の収集に使用される大人は、彼らは新鮮な食料へのアクセスがあったことを提供、3〜14日、新興の後に、一般的に最も生産的です。多くの変異株は、産卵とは、最も生産的となる年齢の変化の低下率で現れることができる肥沃度が低下している。一般的に、数百の大人は、良い産卵個体群ために作る。
4. 手順：卵のコレクション板に貼り付け酵母の薄層を広げて。これは、卵の産卵のための良好な基質を提供します。転送成人は、瓶の口の中にきれいな卵のコレクションのボトルとテープコレクションプレートに飛ぶ。湿度が上昇するとハエがペーストにし、瓶の側面にはまり込むように長く3-4時間よりも、これらのボトルにハエを放置しないでください。

II。ブリーチと胚Dechorionation

1. アスピレーターに接続されているフィルターフラスコに接続したブフナー漏斗を設定します。漏斗でワットマン＃1枚の紙を置く。吸引を実行している状態で、滅菌蒸留水で紙を濡らし。
2. 洗浄瓶からの水の流れとろ紙の上にコレクションのプレートから胚を洗浄します。
3. 滅菌水のいくつかのボリュームでそれらをすすぎ、吸引器の電源をオフにし、50％の漂白剤の漏斗のボリュームを追加します。卵は5〜10分放置します。 chorionsは1〜2分で溶解されますが、長くて、漂白剤で胚を残す汚染酵母の多くは破棄されます。料理を洗い流したているすべての大人や幼虫を取り出す。
4. 滅菌蒸留水で滅菌ペトリ皿（NOT組織培養）に胚を洗浄します。それは事前に接液されていない場合の胚の多くは、皿の底に残ることでしょう。この料理の滅菌水で数回すすいでください。
5. 中期原腸胚期の胚を取り出すために透過光による胚を調べます。

III。単一の胚培養の準備

1. DDM1を作る（セクションIVのレシピを参照してください）
2. 直前の培養に胚の皿から水を注ぐ。滅菌メディアで胚をカバー。
3. 3、35ミリメートルペトリ皿を設定します。各皿の4オートクレーブ円形カバーグラスに入れて。各カバースリップ上で、培地の5μlを置く。 Bellcoカバーガラス - 低鉛ガラスcoverlipsを使用してください。
   
   Bellco生物学的ガラス製品
   800-257-7043
   猫＃1943から00012
   
   
4. いくつかの非常に微細なピペットを引き出します。我々が使用するピペットはナリシゲPP - 83プラーに引っ張られている。ピペットの正確な寸法は重要ではなく、我々は通常、私たちが望むよりも細かそれらを引き出し、それらは大きさを測定するために胚のような視野の同じ分野で先端を折る。あなたが一度に胚のすべてを吸うしたくない、と自分は、それが細胞を吸うために5分かかるという情報が非常に小さくしたくない。両者の間のどこかを目指しています。透過光で胚を調べて、胚の内容を削除するには、ピペットに接続されている口の吸引管を使用してください。可能な限りカバースリップの近くに優しく細胞を追い出すことで、準備カバースリップ上に細胞を分散させる。あなたは、より高い電力でカバースリップを調査し、さらに同様の方法で細胞を分散させる場合があります。
5. 細胞は10分以上、もはや放置。洪水は、メディアと皿とインキュベーターに入れ、4-5％のCO ₂環境、定義された培地を使用する場合。 22〜24℃の温度我々は日常的に23℃、湿度95％を使用。湿度は、蒸発を避けるためにしたいとして、重要です。あなたは23に設定された温度制御℃で冷凍庫に入れ、標準の哺乳類の培養器を使用することができます

IV。文化を成長させるためのDDM1定義培地

1. DMEMを加える：ハムのF12/DMEメディアの100 MLS（DMEM）（アーバインサイエンティフィック＃9052）に。
   1. 0.476グラムのHepes（20mMの）（シグマ＃H - 3375）を追加します。ミックス。
   2. 1.25ミリリットル、L -グルタミン200mMのを（アーバインサイエンティフィック＃9317）を追加します。ミックス。
   3. 0.2μmの酢酸シリンジフィルター（2種類のフィルターを必要とする）とフードでフィルタリング。
   4. pHは6.64とOSM 288です。
   5. 15ミリリットルの遠心チューブに10ミリリットルのアリコートを行います。
   6. 4℃で2週間以上ないため。
      
      注：常にメディアやサプリメントだけのために予約されているコンテナでオートクレーブ滅菌ろ過水を使用して行う。以下に記載されている追加補足：pH電極を置くか、またはMedia.To内の他の目的に使用される攪拌棒を絶対にDDM1を作るDMEM直前に培養することに。
      
      
2. DMEM追加の10〜MLS：
   • 100μlのトランスフェリン
   • 100μlのプトレシン
   • 100μlのセレン
   • 100μlのプロゲステロン
   • 50μlのインスリン

Discussion

midgastrula期胚から調製ショウジョウバエの培養では神経細胞はin vitroで分化に先立って分割しその多くが神経芽細胞の前駆体、から生じる。このシステムは、このように神経発達のごく初期の段階（Rohrbaughら、2003）で重要な遺伝的要因と環境要因の探査のためのユニークな機会を提供します。我々は、単純な定義の培地中で増殖させた神経細胞でも（;リーとOダウド、1999 Oダウド、1995）機能的なシナプス結合を形成する電気的興奮性ニューロンへの分化が示されている。このモデルシステムは、電気的興奮性とシナプス伝達（ホッジスら、2002の開発に関与する役割の​​遺伝子と環境要因を探るために使用できる標準的な全細胞記録技術と組み合わせて、変異体および/または薬理学的操作の分析を使用;リーとOダウド、2000; Leeら、2003）。。

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila melanogaster	Animal			Fruit flies
Transferrin	Reagent	Sigma-Aldrich	T-1147	100x Stock: 10 mg/ml in water. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C.
Insulin		Sigma-Aldrich	I-6634	200x Stock: 10 mg/ml in 0.05N HCl. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 120 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C.
Putrescine		Sigma-Aldrich	P-5780	100x Stock: 10 mM in ddH2O. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20 C
Selenium		Sigma-Aldrich	S-5261	100x Stock: 3 uM in ddH2O. Put 0.0051 g Selenium in a 15 ml tube labeled A (3 mM stock). Add 10 ml of sterile water. Take 10 ul from Tube A to Tube B with 10 ml ddH2O (3 uM stock). Filter Tube B through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C
Progesterone		Sigma-Aldrich	P-6149	100x Stock: 2 ug/ml1.Add 1ml of 100% EtOH to 0.001 g Progesterone bottle2.Add 49 ml ddH2O3.Transfer 1 ml of this to second tube with 9 ml ddH2O4.Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate)5.Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C
DDM1	Medium			To 10 mls of DMEM add from stocks:100 ul Transferrin, 100 ul Putrescine,100 ul Selenium,100 ul Progesterone, 50 ul Insulin
Petri dishes
Cover-slips		Bellco Glass	1943-00012	Low lead glass, autoclaved.
Paper filter		Whatman, GE Healthcare	#1
10cc syringe	Tool
The cultures made in this media must be maintained in a 5% CO2 incubator at about 22-24°C. We use a standard mammalian tissue culture incubator placed in a cold room and heated to 23°C. Always used autoclaved filtered water and make in containers that are reserved for media and supplements only. Never put a pH meter or stir bar used for other purposes in media.