Preparação de culturas de neurônios a partir de embriões Midgastrula Stage Drosophila

Summary

Este vídeo demonstra a preparação de culturas primárias de neurônios a partir de embriões midgastrula estágio Drosophila. Pontos de vista de culturas vivas mostram as células de 1 hora após o plaqueamento e neurônios diferenciados após 2 dias de crescimento em um meio de bicarbonato baseado definido. Os neurônios são eletricamente excitáveis ​​e formam conexões sinápticas.

Abstract

Este vídeo ilustra o procedimento para a tomada de culturas primárias de neurônios a partir de embriões midgastrula estágio Drosophila. Os métodos de coleta de embriões e sua dechorionation o uso de alvejante são demonstradas. Usando uma pipeta de vidro ligado a um tubo de sucção da boca, que ilustram a remoção de todas as células de embriões individuais. O método para dispersar as células de cada embrionários em uma queda (5 l) pequenas de meio sobre uma lamela de vidro sem revestimento é demonstrada. Uma visão através do microscópio, 1 hora após o plaqueamento ilustra a densidade celular preferido. A maioria das células que sobrevivem quando cultivada em meio definido são neuroblastos que dividem uma ou mais vezes na cultura antes de estender processos neuríticas por 12-24 horas. Uma visão através do microscópio ilustra o nível de crescimento de neuritos e ramificação esperado em uma cultura saudável de dois dias in vitro. As culturas são cultivadas em um bicarbonato simples, baseada médio definido, em um 5% CO ₂ incubadora a 22-24 ° C. Processos neuríticas continuar a desenvolver durante a primeira semana de cultura e quando fazem contato com neurites de células vizinhas que muitas vezes forma funcional conexões sinápticas. Neurônios nessas culturas, se manifesta de sódio voltagem dependentes, cálcio e canais de potássio e são eletricamente excitáveis. Este sistema de cultura é útil para estudar molecular fatores genéticos e ambientais que regulam a diferenciação neuronal, excitabilidade, e formação de sinapses / função.

Protocol

I. de colheita de embriões Drosophila

1. Prepare pratos de coleta de ovos
   1. Ferva 200 ml dH ₂ O com 8 g de agar
   2. Arrefecer a 50 ° C
   3. Adicionar 2 ml EtOH e 2 ml de ácido acético
   4. Despeje em 35 milímetros petri pratos de plástico, tops
   5. Esfriar e guarde em recipiente apertado do ar a 4 ° C
   6. Faz cerca de 80 placas
2. Prepare colar Yeast
   1. Dissolver o fermento Fleishmans ativa fermento em água para formar colar
   2. Microondas por 20-30 segundos para matar levedura (atente para ferver mais)
   3. Loja em seringa de 10 cc (sem agulha) a 4 ° C por 2 semanas
3. Moscas: Os adultos utilizados para a coleta de ovos são geralmente mais produtiva entre 3 e 14 dias depois de sair, desde que tenham tido acesso a alimentos frescos. Muitas ações têm mutante diminuição da fertilidade, que pode se manifestar de uma taxa reduzida de postura de ovos e uma mudança na idade em que eles são mais produtivos. Geralmente, várias centenas de adultos fazem para uma população postura boa.
4. Procedimento: Espalhe uma camada fina de pasta de levedura em uma placa de coleta de ovos. Isto fornece um substrato favorável para a postura dos ovos. Adulto transferência voa para uma garrafa limpa ovo recolha e tape o prato de coleta para a boca da garrafa. Não deixe as moscas nessas garrafas mais do que 3-4 horas como a umidade aumenta e as moscas ficam presas na pasta e nas laterais do frasco.

II. Dechorionation embrião com Bleach

1. Criar um funil de Buchner ligado a um frasco de filtro ligado a um aspirador. Coloque um pedaço de papel Whatman # 1 no funil. Com sucção em execução, molhe o papel com água destilada estéril.
2. Enxágüe embriões a partir de chapas para a coleta de papel de filtro com uma corrente de água de uma garrafa de lavagem.
3. Lave-os em vários volumes de água estéril, desligue aspirador, em seguida, adicionar um volume funil de água sanitária a 50%. Deixe os ovos sentar 5-10 minutos. O córions será dissolvido em 1-2 minutos, mas quanto mais tempo você deixar os embriões no bleach mais da levedura contaminante será destruída. Escolher os adultos e as larvas que têm lavado prato.
4. Enxágüe os embriões em uma placa de Petri estéreis (NÃO cultura de tecidos) com água destilada estéril. Muitos dos embriões grude no fundo do prato, se não tiver sido pré-molhada. Enxaguar várias vezes com água estéril neste prato.
5. Examine os embriões com luz transmitida para escolher embriões meados de gástrula palco.

III. Preparação de culturas único embrião

1. Faça DDM1 (ver receitas na seção IV)
2. Derramar água fora prato de embriões pouco antes de cultivo. Cobrir embriões com meios estéreis.
3. Conjunto com 3, 35 pratos de petri milímetros. Coloque em 4 autoclavado lamínulas redondas em cada prato. Em cada lamela, colocar 5 mL de meio. Use Bellco lamínulas de baixa coverlips vidro de chumbo.
   
   Bellco Biológica Copos
   800-257-7043
   Cat # 1943-00012
   
   
4. Puxar alguns pipetas razoavelmente bem. O pipetas que usamos são puxados em um extrator Narishige PP-83. As dimensões exatas da pipeta não são cruciais e que geralmente puxá-los mais finos do que queremos e eles quebram a ponta no mesmo campo de visão como o embrião para medir o tamanho. Você não quer para sugar todos os embriões de uma só vez, e seu não quer a ponta tão pequena que leva 5 minutos para sugar as células. Apontar para algures no meio. Examine os embriões com luz transmitida e usar um tubo de sucção da boca ligado ao pipeta para remover o conteúdo do embrião. Dispersar as células para a lamínula cuidadosamente preparado por expelir as células tão perto da lamela possível. Você pode querer examinar as lamelas com maior poder e mais dispersar as células da mesma maneira.
5. Permitir que as células sentar-se por não mais que 10 minutos. Flood o prato com a mídia e colocar em incubadora, de 4-5% CO ₂ ambiente, se estiver usando meio definido. Temperatura entre 22-24 ° C. Rotineiramente use 23 ° C e umidade de 95%. Umidade é importante, como você quiser evitar a evaporação. Você pode usar uma incubadora de padrão de mamíferos colocado em uma das câmaras frias com controle de temperatura definida para 23 ° C.

IV. DDM1 meio definido para o cultivo das culturas

1. Faça DMEM: Para 100 mls de F12/DME Ham Media (DMEM) (Irvine Scientific # 9052).
   1. Adicionar 0,476 g Hepes (20mM) (Sigma # H-3375). Mix.
   2. Adicionar 1,25 ml L-Glutamina 200 mM (Irvine Scientific # 9317). Mix.
   3. Filtro na capa com 0,2 m de acetato de seringa filtro (precisa de 2 filtros).
   4. O pH é 6,64 e Osm 288.
   5. Faça alíquotas de 10ml em tubos de centrífuga de 15ml.
   6. Armazenar a 4 ° C por não mais de 2 semanas.
      
      Nota: Utilize sempre água filtrada e fazer autoclavado em recipientes que são reservados para Mídia e suplementos apenas. Nunca coloque um eletrodo de pH ou agitar bar utilizado para outros fins em Media.To fazer DDM1: suplementos Adicionar listados abaixopara DMEM pouco antes de cultivo.
      
      
2. A 10 ml de DMEM acrescentar:
   • 100 mL Transferrina
   • 100 mL Putrescine
   • 100 mL Selenium
   • 100 mL de progesterona
   • 50 mL de insulina

Discussion

Em culturas de Drosophila preparados a partir de embriões em estágio midgastrula os neurônios surgem a partir de precursores neuroblastos, muitos dos quais divide antes de diferenciação in vitro. Este sistema, portanto, proporciona uma oportunidade única para a exploração de fatores genéticos e ambientais importantes em fases muito iniciais de desenvolvimento neuronal (Rohrbaugh et al., 2003). Nós temos mostrado que os neurônios cultivados em um meio simples definida diferenciar em neurônios eletricamente excitáveis ​​que também forma funcional conexões sinápticas (O Dowd, 1995; Lee e O Dowd, 1999). Usando análise de mutantes e / ou manipulação farmacológica, em combinação com as técnicas de células inteiras gravação deste sistema modelo pode ser usado para explorar o papel genes e fatores ambientais envolvidos no desenvolvimento da excitabilidade elétrica e transmissão sináptica (Hodges et al, 2002;. Lee e O Dowd, 2000; Lee et al, 2003)..

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila melanogaster	Animal			Fruit flies
Transferrin	Reagent	Sigma-Aldrich	T-1147	100x Stock: 10 mg/ml in water. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C.
Insulin		Sigma-Aldrich	I-6634	200x Stock: 10 mg/ml in 0.05N HCl. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 120 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C.
Putrescine		Sigma-Aldrich	P-5780	100x Stock: 10 mM in ddH2O. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20 C
Selenium		Sigma-Aldrich	S-5261	100x Stock: 3 uM in ddH2O. Put 0.0051 g Selenium in a 15 ml tube labeled A (3 mM stock). Add 10 ml of sterile water. Take 10 ul from Tube A to Tube B with 10 ml ddH2O (3 uM stock). Filter Tube B through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C
Progesterone		Sigma-Aldrich	P-6149	100x Stock: 2 ug/ml1.Add 1ml of 100% EtOH to 0.001 g Progesterone bottle2.Add 49 ml ddH2O3.Transfer 1 ml of this to second tube with 9 ml ddH2O4.Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate)5.Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C
DDM1	Medium			To 10 mls of DMEM add from stocks:100 ul Transferrin, 100 ul Putrescine,100 ul Selenium,100 ul Progesterone, 50 ul Insulin
Petri dishes
Cover-slips		Bellco Glass	1943-00012	Low lead glass, autoclaved.
Paper filter		Whatman, GE Healthcare	#1
10cc syringe	Tool
The cultures made in this media must be maintained in a 5% CO2 incubator at about 22-24°C. We use a standard mammalian tissue culture incubator placed in a cold room and heated to 23°C. Always used autoclaved filtered water and make in containers that are reserved for media and supplements only. Never put a pH meter or stir bar used for other purposes in media.