Beredning av Neuronal kulturer från Midgastrula Stage Drosophila embryon

Summary

Denna video visar förberedelserna primära neuronala kulturer från midgastrula skede Drosophila embryon. Utsikt över levande kulturer visar celler 1 timme efter bordläggning och differentierade nervceller efter 2 dagar på tillväxten i ett definierat bikarbonat-baserat medium. Nervceller är elektriskt retbara och form synapsförbindelser.

Abstract

Denna video illustrerar förfarandet för primära neuronala kulturer från midgastrula skede Drosophila embryon. Metoderna för insamling av embryon och deras dechorionation använda blekmedel demonstreras. Använda ett glas pipett bifogas en mun sugrör, illustrerar vi avlägsnandet av alla celler från enstaka embryon. Metoden för spridning celler från varje embyro i en liten (5 l) droppe medium på ett obestruket glas täckglas visas. En vy genom mikroskop på 1 timme efter bordläggning illustrerar föredra celltäthet. De flesta av de celler som överlever när de odlas i definierat medium är neuroblaster som delar en eller flera gånger i kultur innan utvidga neuritic processer 12-24 timmar. En vy i mikroskopet visar nivån på neurite utväxt och förgrening förväntas i en sund kultur på 2 dagar in vitro. Kulturer odlas på ett enkelt bikarbonat baserat definierat medium, i en 5% CO ₂ inkubator vid 22-24 ° C. Neuritic processer fortsätter att utveckla under den första veckan i kultur och när de tar kontakt med neurites från närliggande celler som de ofta bildar funktionella synapsförbindelser. Nervceller i dessa kulturer uttrycker spänningskänsliga natriumkanaler, kalcium och kalium kanaler och är elektriskt retbara. Denna kultur-systemet är användbart för att studera molekylära genetiska och miljömässiga faktorer som reglerar neuronala differentiering, upphetsning och synaps bildning / funktion.

Protocol

I. Drosophila embryosamlingsgrupp

1. Förbered plattor insamling av ägg
   1. Koka 200 ml dH ₂ O med 8 g agar
   2. Kyl till 50 ° C
   3. Tillsätt 2 ml EtOH och 2 ml Ättiksyra
   4. Häll i 35 Petri mm plastskålar, toppar
   5. Kyl och förvara i lufttät behållare vid 4 ° C
   6. Gör cirka 80 plattor
2. Förbered jäst pasta
   1. Lös Fleishmans aktiva bakning jästen i vattnet och bildar klistra
   2. Mikrovågsugn i 20-30 sekunder för att döda jäst (se upp för kokar över)
   3. Förvaras i 10 cc spruta (utan nål) vid 4 ° C i 2 veckor
3. Flugor: De vuxna som används för insamling av ägg är i allmänhet mest produktiva mellan 3 och 14 dagar efter ny, förutsatt att de har haft tillgång till färska livsmedel. Många mutant lagren har minskat fertilitet som kan manifestera sig i en sänkt hastighet av äggläggning och en förändring i den ålder då de är mest produktiva. Generellt flera hundra vuxna gör för en bra äggläggning befolkningen.
4. Förfarande: Bred ett tunt lager av jäst klistra på en insamling av ägg tallrik. Detta ger ett gynnsamt substrat för utläggning av ägg. Överföring vuxna flugor till en ren insamling av ägg flaskan och tejpa samlingen plattan till munnen av flaskan. Lämna inte flyger i dessa flaskor längre än 3-4 timmar som luftfuktigheten stiger och flugorna fastnar i pasta och på sidan av flaskan.

II. Embryo Dechorionation med blekmedel

1. Inrätta en Buchner-tratt kopplad till en filtrerkolv bifogas en aspirator. Lägg en bit Whatman # 1 papper i tratten. Med sug igång, våta papperet med sterilt destillerat vatten.
2. Skölj embryon från samlingen plattorna mot filtret papper med en ström av vatten från en sprutflaska.
3. Skölj dem i flera volymer med sterilt vatten, stänga aspirator, och sedan lägga en tratt volym på 50% blekmedel. Låt äggen sitta 5-10 minuter. Den chorions kommer att upplösas i 1-2 minuter, men ju längre du lämnar embryona i bleka mer av förorenande jästen kommer att förstöras. Välj ut några vuxna eller larver som sköljs av maträtt.
4. Skölj embryon till en steril petriskål (INTE vävnadsodling) med sterilt destillerat vatten. Många av de embryon fastnar på botten av skålen, om det inte har pre-fuktade. Skölj flera gånger med sterilt vatten i denna maträtt.
5. Undersök embryon med ljus att plocka ut mitten gastrulastadium embryon.

III. Beredning av enstaka embryo kulturer

1. Gör DDM1 (se recept i avsnitt IV)
2. Häll vatten från skålen av embryon strax före odling. Täck embryon med sterilt media.
3. Ställ ut 3, 35 mm petriskålar. Sätt i 4 autoklaveras runda täckglas i varje rätt. På varje täckglas, satte 5 ìl av medium. Använd Bellco täckglas låg coverlips blyglas.
   
   Bellco Biologiska Glas
   800-257-7043
   Katt # 1943-00.012
   
   
4. Dra några ganska fin pipetter. Det pipetter vi använder är drog på ett Narishige PP-83 avdragare. Den exakta mått Pipettera inte är avgörande och vi brukar dra dem finare än vi vill och dem bryta spetsen i samma synfält som ett embryo att mäta storleken. Du vill inte att suga upp alla de embryon på en gång, och din inte vill spetsen så små att det tar 5 minuter för att suga upp cellerna. Sikta på någonstans mittemellan. Undersök embryon med ljus och använder en tub munnen sug bifogas pipett för att ta bort innehållet i embryot. Skingra cellerna på det färdigställda täckglas genom att försiktigt utvisa cellerna så nära täckglaset som möjligt. Du kanske vill undersöka täckglas med högre effekt och ytterligare sprida cellerna på samma sätt.
5. Låt cellerna sitta längre än 10 minuter. Flood skålen med medier och sätta i kuvös, 4-5% CO ₂ miljö, om du använder definierat medium. Temperatur mellan 22-24 ° C. Vi använder rutinmässigt 23 ° C och 95% luftfuktighet. Fukt är viktigt, eftersom du vill undvika avdunstning. Du kan använda en vanlig däggdjur inkubator placeras i en coldroom med temperaturkontroll satt till 23 ° C.

IV. DDM1 definierat medium för odling av de kulturer

1. Gör DMEM: till 100 ml av Ham F12/DME Media (DMEM) (Irvine Scientific # 9052).
   1. Tillsätt 0,476 g Hepes (20mm) (Sigma # H-3375). Mix.
   2. Tillsätt 1,25 ml L-Glutamin 200 mm (Irvine Scientific # 9317). Mix.
   3. Filter i huva med 0,2 ìm acetat sprutfilter (behöver 2 filter).
   4. PH-värdet 6,64 och OSM 288.
   5. Gör portioner om 10 ml i 15 ml centrifugrör.
   6. Förvaras vid 4 ° C under högst 2 veckor.
      
      Anmärkning: Använd alltid autoklaveras filtrerat vatten och göra i behållare som är reserverade för media och tillägg bara. Ställ aldrig ett pH-elektrod eller omrörare används för andra ändamål i Media.To göra DDM1: Lägg kosttillskott nedanatt DMEM strax före odling.
      
      
2. Till 10 ml av DMEM tillägga:
   • 100 l Transferrin
   • 100 l Putrescine
   • 100 l Selen
   • 100 l Progesteron
   • 50 l Insulin

Discussion

I Drosophila kulturer beretts av midgastrula stadium embryon nervceller uppstår neuroblast prekursorer, av vilka många delar före differentiering in vitro. Detta system ger alltså en unik möjlighet för utforskning av genetiska och miljömässiga faktorer viktiga i mycket tidiga faser av nervsystemets utveckling (Rohrbaugh et al., 2003). Vi har visat att nervceller som odlats i ett definierat enkla medel differentieras till elektriskt retbara nervceller som utgör också funktionella synapsförbindelser (O Dowd, 1995; Lee och O Dowd, 1999). Använda analys av mutanter och / eller farmakologiska manipulationer, i kombination med normala hela tekniker cell inspelning denna modell kan användas för att utforska den roll gener och miljöfaktorer är inblandade i utvecklingen av elektriska retbarhet och synaptisk transmission (Hodges et al, 2002;. Lee och O Dowd, 2000; Lee et al, 2003)..

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila melanogaster	Animal			Fruit flies
Transferrin	Reagent	Sigma-Aldrich	T-1147	100x Stock: 10 mg/ml in water. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C.
Insulin		Sigma-Aldrich	I-6634	200x Stock: 10 mg/ml in 0.05N HCl. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 120 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C.
Putrescine		Sigma-Aldrich	P-5780	100x Stock: 10 mM in ddH2O. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20 C
Selenium		Sigma-Aldrich	S-5261	100x Stock: 3 uM in ddH2O. Put 0.0051 g Selenium in a 15 ml tube labeled A (3 mM stock). Add 10 ml of sterile water. Take 10 ul from Tube A to Tube B with 10 ml ddH2O (3 uM stock). Filter Tube B through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C
Progesterone		Sigma-Aldrich	P-6149	100x Stock: 2 ug/ml1.Add 1ml of 100% EtOH to 0.001 g Progesterone bottle2.Add 49 ml ddH2O3.Transfer 1 ml of this to second tube with 9 ml ddH2O4.Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate)5.Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C
DDM1	Medium			To 10 mls of DMEM add from stocks:100 ul Transferrin, 100 ul Putrescine,100 ul Selenium,100 ul Progesterone, 50 ul Insulin
Petri dishes
Cover-slips		Bellco Glass	1943-00012	Low lead glass, autoclaved.
Paper filter		Whatman, GE Healthcare	#1
10cc syringe	Tool
The cultures made in this media must be maintained in a 5% CO2 incubator at about 22-24°C. We use a standard mammalian tissue culture incubator placed in a cold room and heated to 23°C. Always used autoclaved filtered water and make in containers that are reserved for media and supplements only. Never put a pH meter or stir bar used for other purposes in media.