Summary
유전자 단체는 종종 기능 수준에서 설명할 남아있다. 이 방법은 베꼈는데 SNPs에 대한 heterozygous 세포를 분석하여 유전자 발현에 대한 표현형 - 관련 유전자 마커의 효과를 평가하는 것을 목표로하고있다. 이 기술은 allele 특정 뇌관 확장 제품을 수치 든 - TOF 질량 분석법에 의해 정확한 측정이 가능합니다.
Abstract
일반 복잡한 특징과 중요한 유전자 협회의 수가 지속적으로 증가하고있다. 그러나 이러한 단체의 대부분은 분자 수준에서 이해되지 않았습니다. phenotypes에 DNA 변종의 효과를 중재하는 메커니즘 중 하나는 복잡한 특성 1 특히 관련성이 높은 것으로 표시되었습니다 유전자 표현입니다.
이 방법의 휴대폰 컨텍스트 유전자 발현에서 특정의 DNA 시퀀스의 효과를 테스트합니다. 원리는 질병 (위험 변종) 2,3과 관련된 DNA 시퀀스 중 하나 사본을 가지고 세포를 분석, 유전자의 두 대립 유전자에서 발생하는 성적의 상대적 풍부한을 측정하는 것입니다. 따라서,이 방법에 사용되는 전지는 두 근본적인 genotypic 요구 사항을 충족해야합니다 그들은 DNA의 위험 변종에 대한 그들의 염색체 기원 (그림 1)에 따라 기록을 구별할 수있는 DNA 마커, 일반적으로 코딩 polymorphisms, 모두를위한 heterozygous해야합니다. DNA 위험 변종과 DNA 마커는 동일한 allele 주파수를 필요 아니지만 유전자 마커의 단계 (haplotypic) 관계를 이해해야합니다. 관심있는 유전자를 표현하는 세포 유형을 선택하는 것도 중요합니다. 이 프로토콜은 섬유아 세포에서 핵산을 추출 채택 절차를 구체적으로 참조되지만 이러한 방법은 기본 세포 등 다른 세포 유형에 동일하게 적용됩니다.
DNA와 RNA가 선택한 셀 라인에서 추출하고 cDNA가 생성됩니다. DNA와 cDNA는 코딩 DNA 마커 사를 대상으로 설계된 프라이머 확장 분석과 함께 분석하고 있습니다. 뇌관 연장 분석은 제조 업체의 사양에 따라 MassARRAY (Sequenom) 5 플랫폼을 사용 수행됩니다. 프라이머 확장 제품은 다음 매트릭스를 이용한 레이저 탈착 / 질량 분석계 (MALDI-TOF/MS) 비행의 이온화 시간에 따라 분석됩니다. 선택 마커가 heterozygous 있기 때문에 그들은 MS의 프로필에 두 개의 봉우리를 생성합니다. 각 피크의 면적은 사본의 풍요에 비례하고 allelic 비율 (allele 1 : allele 2) 생성하는 MassARRAY의 Typer 소프트웨어의 기능을 측정할 수 계산합니다. cDNA에 대한 획득 allelic 비율은 allelic 비율이 1시 1분 기술 아티팩트에 대한 올바른 될 예정입니다 게놈 DNA에서 측정되는을 사용하여 표준입니다. 1 크게 다른 표준 allelic 비율로 표식은 표현형와 관련된 유전자 변종은 유전자 발현에 영향을 미칠 것을 제안, 동일한 셀에 두 개의 염색체에서 발생하는 성적 증명서의 양이 다르다는 것을 나타냅니다. 실험 컨트롤이 결과를 확인하는 데 사용해야합니다.
Protocol
1) 세포 배양
- 관심있는 유전자를 표현 셀 유형을 선택합니다.
- 두 DNA 위험 변종과 관심의 유전자 (그림 1) 이내 베꼈는데 코딩 다형성에 대한 heterozygous 세포 라인을 선택합니다.
- 문화 공급자의 사양에 각각 DNA와 RNA 추출 2 X 10cm 배양 접시를 준비 따라 선택한 셀 라인.
- 세포는 80 % 합류는 아래에 설명된 절차를 수행하거나 상용 키트를 사용하거나 수확 세포에 대한 절차를 시작하고 DNA와 RNA를 분리 도달했을 때.
2) DNA 추출
- 접시에서 미디어를 제거, PBS로 세척하고 용해 용액 (0.6 % SDS, 100 MM NaCl, 50 MM 트리스, 20 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 및 50 μg / ML RNase A)의 접시 500 μL에 추가할 수 있습니다.
- 실온에서 20 분 동안 부드럽게 접시를 록.
- ° C 야간 37 microcentrifuge 관과 부화에 세포 lysate을 다쳤어요.
- 100 μg / ML의 최종 농도 proteinase K를 추가하고 37 ° C 하룻밤에 품어.
- 페놀 - 클로로포름 산도 8, 반복의 동일한 볼륨으로 DNA를 추출 후, 클로로포름 / isoamyl 알콜의 동일한 볼륨 압축을 풉니다.
- 10분의 1 일 제 3 M NaCl 및 100 % 에탄올 2.5 볼륨으로 DNA를 침전.
- 4 30 분 13,000 rpm으로 회전 후 5 분 얼음에두고 ° C.
- 70 % 에탄올로 DNA를 와시, 공기 건조하고 TE 200 μL에 resuspend 수 있습니다.
- 65 품어 ° C 후 10 분 및 실온에서 2 일간 휴가.
- 4 스토어에서 -20 ° C 또는 장기 ° C.
3) RNA 추출
- 접시에서 미디어를 제거, PBS로 씻어 상온에서 10 분 TRIzol과 부화 1 ML를 추가합니다.
- 스크 레이프 세포는 microcentrifuge 관에 몇 번, 전송 피펫 5 분 알을 품다.
- 4 10,000 RPM 10 분 스핀 ° C.
- 새로운 튜브에 뜨는를 전송하고 클로로포름 200 μL를 추가합니다.
- 흔들 4 10,000 RPM 10 분 스핀 ° C.
- 새로운 튜브에 수성 단계를 전송하고 70 % 에탄올의 동일한 볼륨을 추가합니다.
- 1 또는 2 (볼륨에 따라 다름) 최대 속도 30 초에 대한 RNeasy 컬럼과 스핀에 대한 솔루션을로드합니다.
- 여기에서 RNeasy 키트 (Qiagen)의 지침을 따르십시오.
4) 핵산 샘플 준비
- NanoDrop 분광 (써모 과학)을 사용하여 DNA와 RNA의 농도를 정량.
- 제조 업체의 지시에 따라 임의의 decamers과 어깨 III 거꾸로 Transcriptase (Invitrogen)를 사용하는 RNA의 cDNA 500-1000 NG에서 준비합니다.
5) PCR 및 프리머 확장 분석
- 각각의 DNA 마커에 대한 PCR의 primers, 한 게놈 DNA의 증폭을위한 쌍 및 cDNA 증폭에 대한 다른 쌍 (그림 2)의 디자인 이쌍합니다. 앞으로 장소와 게놈 오염을 피하기 위해 다른 exons의 cDNA 증폭을위한 프라이머를 역방향. 100-500 BP의 길이의 범위에 PCR 제품을 얻기 위해 디자인 입문서.
- 0.5 U Immolase DNA 형성 촉매 (Bioline) 0.8 MM의 dNTPs, 2 MM MgCl 2, 0.2 M 각각의 프라이머와 cDNA 또는 DNA 중 20 NG 포함하여 10 μL PCR 반응을 준비합니다. 네 독립 반응의 각 샘플을 확대.
- 증폭의 선형 사이클 단계에 번호를 유지 각 프라이머 쌍을위한 최적의 조건에서 PCR 반응을 실행합니다.
- exonuclease와 PCR 제품을 잠복기로 여분의 PCR 프라이머 및 dNTPs를 제거 I 및 37 새우 알칼리성 인산 가수 분해 효소 (SAP) · 20 분 C.
- 384 잘 접시에 두 번 각 PCR 제품을 스팟, 8 측정 각 샘플에 대해 사용할 수 있도록.
- 같은 뇌관은 게놈과 cDNA PCR 두 제품에 사용할 수 있도록 분석 설계 (Sequenom) 소프트웨어와 확장 뇌관을 디자인합니다. 3ddNTPs의 조합 (그림 2)을 포함하여 14-18 BP 및 확장 믹스의 범위에서 뇌관의 길이를 지정합니다.
- 제조 업체의 지시에 따라 MassARRAY 시스템 (Sequenom)를 사용하여 뇌관 확장 반응과 MALDI-TOF/MS 분석을 수행합니다.
- 전형적인 프라이머 확장 반응 94에 시작하는 단계 ° C 2 분, 5 초, 52도 ° C 5 S와 72는 ° C를위한 94 ° C의 40주기에 의해 다음 5 S. 위해 포함
- 프라이머 확장 제품은 SpectroCLEAN 수지로 청소하고 SpectroPOINT nanolitre 자동 지급기에서 microarray (칩)에 전송됩니다.
- 확장 oligonucleotides는 SpectroREADER 질량 분석기를 사용하여 든 - TOF에 의해 계량입니다.
6) 통계 분석
- 실험의 일반적인 품질 MassARRAY의 Typer 소프트웨어 MALDI-TOF/MS 결과를 확인합니다.
- 정상 영역 데이터를 포함하는 Allelotyping 보고서를 추출합니다.
- 각 스펙트럼은을 계산을 위해allele 1 allele 2 (최대 면적 비율)의 피크 영역 사이의 비율.
- 각 cDNA 샘플의 경우 8 측정에 걸쳐, Excel에서 해당 함수를 사용, 최대 면적 비율 의미 및 표준 편차를 도출.
- 게놈 DNA를 8 측정에서 동일한 의미 피크 면적 비율을 도출.
- 예상 1시 1분 비율에 편차를 평가하기 위해 게놈 의미의 비율에 의해 cDNA 의미 비율을 나누십시오.
7) 실험 컨트롤
- 실험 유물을 배제하기 위해 적어도 세 번 실험을 반복합니다.
- 추가 DNA 마커에 대해 가능하다면, 디자인 assays.
- 순방향 및 역방향 모두 가닥을 어닐링 여러 PCR 프라이머 쌍 및 확장 primers을 디자인합니다.
- 때마다 DNA 마커에 대한 heterozygous 있지만 표현형과 관련된 DNA 위험 변종 다니지 말고 부정적인 제어 세포 라인을 최대한 시험 (그림 1과 그림 3.)
8) 대표 결과
allele 특정 표현 분석의 예제는 질량 분석계의 흔적을 예제와 함께 그림 3에 표시됩니다. 그림은 4 가지 템플릿에서 실시 4 allele 특정 뇌관 확장 제품의 분석 결과를 보여줍니다. 상단 그래프 베꼈는데 코딩 다형성에 대한 heterozygous 모두 두 가지 세포 라인의 게놈 DNA의 분석에서 얻은 결과를 나타냅니다. 단, 셀 라인은 위험 유전자 변형 (그림 1) heterozygous입니다. 하단 그래프는 동일한 세포 라인에서 생성된 cDNA의 분석에서 얻은 결과를 나타냅니다. 실험 유물의 결과로 첫 번째 정상은 항상도 게놈 분석에서 두 번째로 정상보다 높은 것입니다. 따라서 게놈 분석의 결과는 cDNA 데이터를 정상화하는 데 사용됩니다. 정규화 후, allele 비율이 세포 라인 1에서 크게 다른 (두 번째 정상가 다른 스펙트럼에 비해 낮은 나타나는 위치) 데이터를 그 세포 라인을 제안 B. 그것이 세포 라인에 1 매우 가까운 동안 운반 분석에서 유전자의 표현을 줄여 두 번째 정상에 의해 측정 allele와 단계에서 DNA의 변형. 셀 라인 B는 매우 편리한 부정적인 제어를 제공합니다.
그림 1. 세포주 선택 전략. 셀 라인은 A와 B는 오직 세포 라인은 위험 유전자 변형 (동그라미)에 대한 heterozygous입니다 베꼈는데 코딩 마커 (삼각형)에 대한 heterozygous 있습니다. 위험 변종의 푸른 allele은 전사의 낮은 수준 (실제 작동 변종에 가까운 상관 관계에 직접적인 영향이나하기 때문에)를 연결됩니다.
그림 2. Allele 특정 뇌관 연장 분석.이 그림은 cDNA (왼쪽)와 게놈 DNA (오른쪽) 템플릿 모두에 대해 수행 실험 절차의 업무 흐름을 보여줍니다. PCR primers (회색 사각형)를 heterozygous 코딩 다형성 (삼각형)를 증폭하도록 설계되었습니다. 게놈 오염 PCR primers가 증폭이 cDNA 템플릿에서 수행됩니다 다른 exons (하늘색 막대)에 배치 순서를 어닐링 피하기 위해. PCR 제품은 다음 다형성에 다음 기지 어닐링, 확장 프라이머와 함께 진행 프라이머 확장 반응에 대한 템플릿으로 사용되고, 세 dideoxynucleotide의 적절한 믹스 (ddNTPs)는 터미네이터 (광장) 한 deoxynucleotide (동그라미)가 확장 각각 하나 또는 두 개의 기초의 기본 이지요. 그 결과 프라이머 확장 제품 든 - TOF 질량 분광법에 의해 분리 및 부량 수 있도록 다양한 대중 있습니다. DNA 마커의 푸른 allele에 해당하는 제품의 수량은 붉은 allele 상대적으로 낮습니다.
그림 3. allele 특정 표현 분석의 결과. 그림은 게놈 DNA를 수행 분석에서 질량 분석계 결과 및 세포주의 cDNA를 표시하고 셀 라인 B (그림 1).
Discussion
이 방법은 사본 수준의 생체내 allele 특정 차이 평가에 의해 유전자 발현에 질병 관련 유전자 변종의 효과의 평가를 수 있습니다. 이 프로토콜의 상대적인 대본 풍부한이 든 - TOF하지만 같은 TaqMan 6,7와 같은 allele 특정 부량을 수 있도록 다른 기술에 의해 측정, 사용할 수 있습니다. 이 방법의 주요 제한은 베꼈는데 코딩 마커의 가용성이다. 원칙에 따라 방법은 여기에 설명된하지만, polymorphisms 다른 클래스의 활용, 설명되었습니다. haploChip 분석은 transcriptional 시작하거나 II 8 효소를 RNA 특정 항체와 격리 염색질 immunoprecipitated 자료에있는 것입니다 유전자의 최종 사이트의 1킬로바이트 내에 위치한 마커를 사용하여 allele 특정 표현을 측정합니다. 템플릿 RNA 9 헤테로핵 때 또는 intronic SNPs를 사용할 수 있습니다.
특정 프로토콜은 haploChip 분석과 함께, 여기에 설명된 dyslexia에 대한 후보 유전자 (또는 읽기 장애)를 식별하기 위해 성공적으로 사용되었습니다. 처음에는 유전자 협회 연구 dyslexia 세 유전자 10 스패닝되었습니다과 관련된 DNA 순서 확인. allele 특정 유전자 발현 분석은 dyslexia - 관련 DNA 변종 표현 변동의 존재에 세 유전자 중 하나만에 대한 관찰하지만 다른 두 11 것으로 나타났다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 부여를 통해 웰컴 트러스트에 의해 투자되었다 APM [076566/Z/05/Z] JCK [074318]와 인간 유전학에 대한 웰컴 트러스트 센터의 핵심 수상 [075491/Z/04].Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | Sigma-Aldrich | P-4417-100TAB | |
| SDS | Bio-Rad | 161-0416 | |
| NaCl | VWR international | 27788.366 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503-1KG | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134-500G | |
| RNase A | Qiagen | 19101 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308-500MG | |
| Phenol: chloroform | Sigma-Aldrich | 77617 | |
| Chloroform | VWR international | 100777C | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 32221-2.5L | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| RNeasy kit | Qiagen | 74104 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18080-044 | |
| Immolase Taq | Bioline | BIO-21048 | |
| dNTP | Sigma-Aldrich | DNTP100A | |
| Exonuclease 1 | New England Biolabs | M0293S | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase | GE Healthcare | E70092Z | |
| SpectroCLEAN resin | Sequenom | 10053 | |
| MassEXTEND ddNTP/dNTP mix | Sequenom | Varies according to assay design | |
| MassEXTEND thermosequenase | Sequenom | 10052 | |
| Equipment | |||
| Chilled microcentrifuge | Eppendorf | ||
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| SpectroPOINT nanolitre dispenser | Sequenom | ||
| SpectroREADER mass spectrometer | Sequenom |
References
- Cookson, W., Liang, L., Abecasis, G., Moffatt, M., Lathrop, M. Mapping complex disease traits with global gene expression. Nat Rev Genet. 10, 184-194 (2009).
- Singer-Sam, J., LeBon, J. M., Dai, A., Riggs, A. D. A sensitive, quantitative assay for measurement of allele-specific transcripts differing by a single nucleotide. PCR Methods Appl. 1, 160-163 (1992).
- Yan, H., Yuan, W., Velculescu, V. E., Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Allelic variation in human gene expression. Science. 297, 1143-11 (2002).
- Ding, C., Cantor, C. R. A high-throughput gene expression analysis technique using competitive PCR and matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight MS. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 3059-3064 (2003).
- Gabriel, S., Ziaugra, L. SNP genotyping using Sequenom MassARRAY 7K platform. Curr Protoc Hum Genet Chapter. Chapter 2 (Unit 2), 12-12 (2004).
- Lo, H. S. Allelic variation in gene expression is common in the human genome. Genome Res. 13 (8), 1855-1862 (2003).
- Liu, X. Expression-based discovery of variation in the human glutathione S-transferase M3 promoter and functional analysis in a glioma cell line using allele-specific chromatin immunoprecipitation. Cancer Res. 65, 99-104 (2005).
- Knight, J. C., Keating, B. J., Rockett, K. A., Kwiatkowski, D. P. In vivo characterization of regulatory polymorphisms by allele-specific quantification of RNA polymerase loading. Nat Genet. 33 (4), 469-475 (2003).
- Pastinen, T. A survey of genetic and epigenetic variation affecting human gene expression. Physiol Genomics. 16 (2), 184-193 (2004).
- Francks, C. A 77-kilobase region of chromosome 6p22.2 is associated with dyslexia in families from the United Kingdom and from the United States. Am J Hum Genet. 75 (6), 1046-1058 (2004).
- Paracchini, S. The chromosome 6p22 haplotype associated with dyslexia reduces the expression of KIAA0319, a novel gene involved in neuronal migration. Hum Mol Genet. 15 (10), 1659-1666 (2006).
