Summary
Associações genéticas freqüentemente permanecem sem explicação em um nível funcional. Este método tem como objetivo avaliar o efeito do fenótipo associado marcadores genéticos na expressão do gene através da análise de células heterozigotos para SNPs transcritas. A tecnologia permite uma medição precisa por espectrometria de massa MALDI-TOF para quantificar alelo-específico produtos de extensão de primer.
Abstract
O número significativo de associações genéticas com características complexas comuns está aumentando constantemente. No entanto, a maioria destas associações não foram compreendidas a nível molecular. Um dos mecanismos de mediação do efeito de variantes de DNA em fenótipos é de expressão gênica, que tem se mostrado particularmente relevante para traços complexos 1.
Este método testa em um contexto celular o efeito de seqüências específicas de DNA na expressão gênica. O princípio é medir a abundância relativa de transcritos resultantes dos dois alelos de um gene, análise de células que carregam uma cópia de seqüências de DNA associadas com a doença (a variantes de risco) 2,3. Portanto, as células usadas para este método deve atender a dois requisitos fundamentais genotípica: eles têm que ser heterozigotos tanto para variantes de risco DNA e dos marcadores de DNA, polimorfismos tipicamente codificação, o que pode distinguir transcrições com base em sua origem cromossômicas (Figura 1). Variantes de DNA de risco e marcadores de DNA não precisa ter a freqüência do alelo mesmo, mas a fase de relacionamento (haplotypic) dos marcadores genéticos precisa ser entendido. Também é importante escolher os tipos de células que expressam o gene de interesse. Este protocolo se refere especificamente ao procedimento adotado para extração dos ácidos nucléicos a partir de fibroblastos, mas o método é igualmente aplicável a outros tipos de células, incluindo células primárias.
DNA e RNA são extraídos das linhagens de células selecionadas e cDNA é gerado. DNA e cDNA são analisados, com um teor de extensão de primer, projetado para atacar os marcadores de DNA de codificação 4. O ensaio de extensão de primer é realizado usando o MassARRAY (Sequenom) 5 plataforma de acordo com as especificações do fabricante. Produtos de extensão de primer são então analisados por matrix-assisted laser de dessorção / ionização de tempo de vôo-espectrometria de massa (MALDI-TOF/MS). Porque os marcadores selecionados são heterozigotos que irá gerar dois picos nos perfis de MS. A área de cada pico é proporcional à abundância transcrição e pode ser medido com uma função do software Typer MassARRAY para gerar uma relação de alelos (alelo 1: alelo 2) cálculo. A proporção alélica obtida para cDNA é normalizada usando essa medida a partir do DNA genômico, onde a proporção alélica deve ser de 1:1 para corrigir artefatos técnicos. Marcadores com uma relação normalizada alélicas significativamente diferentes de 1 indicam que a quantidade de transcrição gerados a partir de dois cromossomos na mesma cela é diferente, sugerindo que as variantes do DNA associado com o fenótipo ter um efeito sobre a expressão gênica. Controles experimentais devem ser utilizados para confirmar os resultados.
Protocol
1) Cultura de Células
- Selecionar os tipos de células que expressam o gene de interesse.
- Selecionar linhagens de células heterozigotas para ambas as variantes de risco e polimorfismo de DNA de codificação transcrito dentro do gene de interesse (Figura 1).
- Cultura selecionado linhagens de células de acordo com as especificações do fornecedor e preparar 2 x 10 centímetros pratos petri para a extração de DNA e RNA, respectivamente.
- Quando as células atingem 80% confluência iniciar o procedimento para as células colheitas e isolar DNA e RNA, quer mediante o procedimento descrito abaixo ou usando kits disponíveis comercialmente.
2) Extração de DNA
- Remova a mídia do prato, lavar com PBS e adicione ao prato 500 mL de uma solução de lise (0,6% SDS, 100 mM NaCl, 50 mM Tris, 20 mM EDTA e 50 mg / mL de RNase A).
- Rocha a placa suavemente durante 20 minutos em temperatura ambiente.
- Raspar o lisado de células em um tubo de microcentrífuga e incubar a 37 ° C durante a noite.
- Adicionar proteinase K para uma concentração final de 100 mcg / ml e incubar a 37 ° C durante a noite.
- Extrair o DNA com um volume igual de fenol-clorofórmio pH 8, repito, em seguida, extrair, com um volume igual de clorofórmio / álcool isoamílico.
- Precipitar o DNA com 1 / 10 º volume 3 M NaCl e 2,5 volumes de etanol 100%.
- Deixar no gelo por 5 min e depois girar a 13.000 rpm por 30 min a 4 ° C.
- Lavar o DNA com etanol 70%, deixe secar e ressuspender em 200 mL de TE.
- Incubar a 65 ° C por 10 min e depois deixar por 2 dias à temperatura ambiente.
- Armazenar a 4 ° C ou a longo prazo a -20 ° C.
3) Extração de RNA
- Remova a mídia do prato, lavar com PBS, adicione 1 mL de TRIzol e incubar por 10 min em temperatura ambiente.
- Células raspar, pipeta alguns tempos de transferência, em um tubo de microcentrífuga e incubar por 5 min.
- Giro por 10 min a 10.000 rpm a 4 ° C.
- Transferir o sobrenadante em um novo tubo e adicionar 200 mL de clorofórmio.
- Agitar e girar por 10 min a 10.000 rpm a 4 ° C.
- Transferir a fase aquosa em um novo tubo e adicionar igual volume de etanol 70%.
- Carregar a solução para 1 ou 2 (dependendo do volume) coluna RNeasy e spin por 30 segundos na velocidade máxima.
- A partir daqui siga as instruções do kit RNeasy (Qiagen).
4) Preparação de amostras de ácido nucléico
- Quantificar DNA e RNA de concentração utilizando um Espectrofotômetro NanoDrop (Thermo Scientific).
- Prepare cDNA de 500-1000 ng de RNA aleatórias e usando decamers SuperScript III Transcriptase Reversa (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante.
5) PCR e Ensaio Extensão Primer
- Desenho de dois pares de primers de PCR para cada marcador de DNA, um par para amplificação de DNA genômico e outro par para amplificação de cDNA (Fig. 2). Coloque frente e verso primer para amplificação de cDNA em exons diferentes para evitar a contaminação genômica. Cartilha de design para obter um produto PCR na faixa de 100-500 bp de comprimento.
- Prepare a 10 mL reação de PCR, incluindo 0,5 U Taq Immolase (Bioline) 0,8 mM dNTPs, 2 mM MgCl 2, 0,2 M de cada primer e 20 ng de qualquer cDNA ou DNA. Ampliar cada amostra em quatro reações independentes.
- Executar a reação de PCR nas condições otimizadas para cada par de primer mantendo número do ciclo na fase linear de amplificação.
- Remover PCR primer e dNTPs excesso de incubação do produto da PCR com exonuclease I e Fosfatase Alcalina Camarão (SAP) a 37 ° C por 20 minutos.
- Ponto cada produto PCR duas vezes em uma placa de 384 poços, de modo que oito medições estarão disponíveis para cada amostra.
- Projeto de extensão do primer com o software Assay Design (Sequenom) para que o primer mesmo pode ser utilizado tanto para genômica e de cDNA produtos de PCR. Especificar o comprimento primário na faixa de 14-18 bp e mix de extensão, incluindo combinações de 3ddNTPs (Fig. 2).
- Realizar a reação de extensão de primer e análise MALDI-TOF/MS usando o sistema MassARRAY (Sequenom) de acordo com as instruções do fabricante.
- Uma reação típica de extensão cartilha inclui uma etapa a partir de 94 ° C por 2 min, seguida de 40 ciclos de 94 ° C por 5 s, 52 ° C por 5 s e 72 ° C durante 5 s.
- Os produtos de extensão de primer são limpos com resina SpectroCLEAN e transferidos para microarray (chip) por SpectroPOINT dispenser nanolitre.
- O oligonucleotides estendido são quantificados por MALDI-TOF usando um espectrômetro de massa SpectroREADER.
6) Análise Estatística
- Verificar os resultados MALDI-TOF/MS com o software Typer MassARRAY para a qualidade geral do experimento.
- Extraia o relatório Allelotyping que inclui os dados da área dos picos.
- Para cada indivíduo calcular o espectrorazão entre a área do pico do alelo 1 e alelo 2 (relação de área do pico).
- Para cada amostra de cDNA derivar uma razão média de pico área e desvio padrão, usando a função correspondente no Excel, através do 8 medições.
- Derive a relação de mesma área média do pico entre os 8 measurments de DNA genômico.
- Divide a relação cDNA dizer com a relação do genoma significa para avaliar o desvio para a proporção de 1:1 esperado.
7) Controles Experimental
- Para descartar artefatos experimentais, repetir a experiência, pelo menos, três vezes.
- Sempre que possível, os ensaios de design para marcadores de DNA adicional.
- Design vários pares de primers PCR e primers extensão annealing às costas para a frente e para trás.
- Sempre que possível teste como negativo controles linhas de células que são heterozigotos para os marcadores de DNA, mas não carregam o DNA variantes de risco associados com o fenótipo (Fig. 1 e Fig. 3.)
8) Resultados Representante
Um exemplo de alelo-específico análise de expressão é mostrado na Figura 3, com exemplos de traços de espectrometria de massa. A figura mostra os resultados da análise de 4 alelo-específico produtos cartilha de extensão realizado em 4 modelos diferentes. Os gráficos topo representam os resultados obtidos a partir da análise do DNA genômico de duas linhas de células diferentes, que são heterozigotos para um polimorfismo transcrita codificação. No entanto, apenas uma linha de células é heterozigoto para a variante de DNA de risco (Figura 1). Os gráficos inferiores representam os resultados obtidos com a análise do cDNA gerado a partir das linhas de mesma célula. Como resultado do artefato experimental o primeiro pico é sempre maior do que o segundo pico mesmo na análise genômica. Portanto, os resultados da análise genômica são utilizados para normalizar os dados de cDNA. Após a normalização, a relação alelo é significativamente diferente de 1 em linhagem de células A (onde o segundo pico aparece menor em comparação com os espectros de outro), enquanto ele está muito próximo de 1 em linhagem de células B. Os dados sugerem que uma linha celular carrega um DNA variante, em fase com o alelo medido pelo segundo pico, o que reduz a expressão do gene em análise. Célula da linha B fornece um controle muito conveniente negativo.
Figura 1. Linhagens de células estratégia de seleção de linha. Célula A e B são heterozigotos para um marcador transcrita codificação (triângulo), mas apenas uma linha de células é heterozigoto para a variante de risco DNA (círculo). O alelo azul a variante de risco está associada (ou com um efeito directo ou porque, em estreita correlação com a variante actual funcionais) com um menor nível de transcrição.
Figura 2. Alelo-específico do ensaio de extensão primer. Esta figura mostra o fluxo de trabalho do procedimento experimental realizado para ambos DNA cDNA (esquerda) e genômica (direita) modelos. PCR (retângulos cinzas) são projetados para amplificar um polimorfismo heterozigotos codificação (triângulo). Para evitar a contaminação genômica PCR anneal seqüências colocado em exons diferentes (bares luz azul) quando a amplificação é realizada no modelo de cDNA. O produto da PCR é então usado como modelo para uma reação de extensão de primer realizado com um primer de extensão, uma base de recozimento ao lado do polimorfismo, ea mistura adequada de três dideoxynucleotide (ddNTPs) terminadores (quadrados) e um desoxinucleotídeo (círculo) para estender a cartilha de uma ou duas base, respectivamente. Os produtos resultantes de extensão de primer têm massas diferentes, que permitem a separação e quantificação por MALDI-TOF espectrometria de massa. A quantidade de produto correspondente ao alelo azul do marcador de DNA é relativamente mais baixos para o alelo vermelho.
Figura 3. Resultados de um alelo-específico do ensaio de expressão. A figura mostra os resultados de espectrometria de massa a partir da análise realizada no DNA genômico e do cDNA da linhagem celular de células A e B da linha (Figura 1).
Discussion
Este método permite a avaliação do efeito da doença associada a variantes de DNA na expressão do gene através da avaliação in vivo alelo-específico diferença no nível de transcrição. Neste protocolo abundância transcrição relativa é medida por MALDI-TOF, mas outras tecnologias que permite a quantificação alelo-específico, como TaqMan 6,7, pode ser usado. A principal limitação dessa abordagem é a disponibilidade de transcritos marcadores de codificação. Métodos baseados no princípio descrito aqui, mas aproveitando as diferentes classes de polimorfismos, têm sido descritas. O ensaio haploChip medidas alelo-específico expressão usando marcadores localizados a 1 kb do início da transcrição ou site final de um gene que estaria presente na cromatina materiais immunoprecipitated isolados com anticorpos específicos para o RNA polimerase II 8. Alternativamente, SNPs intrônicos pode ser utilizado quando o modelo é heteronuclear RNA 9.
O protocolo específico descrito aqui, em combinação com o ensaio haploChip, tem sido utilizado com sucesso para identificar um gene candidato para a dislexia (ou incapacidade de leitura). Inicialmente um estudo de associação genética identificada uma seqüência de DNA associado com a dislexia e que foi ao longo de três genes 10. O alelo-específico do ensaio de expressão gênica mostrou que na presença da dislexia associados variação DNA expressão variantes foi observado por apenas um dos três genes, mas não os outros dois 11.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo Wellcome Trust através de subsídios à APM [076566/Z/05/Z], JCK [074,318] e um prêmio principal para o Wellcome Trust Centre para Genética Humana [075491/Z/04].Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | Sigma-Aldrich | P-4417-100TAB | |
| SDS | Bio-Rad | 161-0416 | |
| NaCl | VWR international | 27788.366 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503-1KG | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134-500G | |
| RNase A | Qiagen | 19101 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308-500MG | |
| Phenol: chloroform | Sigma-Aldrich | 77617 | |
| Chloroform | VWR international | 100777C | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 32221-2.5L | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| RNeasy kit | Qiagen | 74104 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18080-044 | |
| Immolase Taq | Bioline | BIO-21048 | |
| dNTP | Sigma-Aldrich | DNTP100A | |
| Exonuclease 1 | New England Biolabs | M0293S | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase | GE Healthcare | E70092Z | |
| SpectroCLEAN resin | Sequenom | 10053 | |
| MassEXTEND ddNTP/dNTP mix | Sequenom | Varies according to assay design | |
| MassEXTEND thermosequenase | Sequenom | 10052 | |
| Equipment | |||
| Chilled microcentrifuge | Eppendorf | ||
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| SpectroPOINT nanolitre dispenser | Sequenom | ||
| SpectroREADER mass spectrometer | Sequenom |
References
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