Summary
Genetische Assoziationen oft im Dunkeln bleiben auf funktionaler Ebene. Diese Methode zielt darauf ab, die Wirkung der Phänotyp-assoziierten genetischen Marker auf die Genexpression zu beurteilen durch die Analyse von Zellen heterozygot für transkribiert SNPs. Die Technologie ermöglicht eine präzise Messung durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie zur Allel-spezifischen Primer Extension-Produkte zu quantifizieren.
Abstract
Die Anzahl der signifikanten genetischen Zusammenhänge mit häufigen komplexe Merkmale nimmt ständig zu. Allerdings haben die meisten dieser Verbände nicht auf molekularer Ebene verstanden worden. Einer der Mechanismen der Vermittlung der Wirkung von DNA-Varianten auf Phänotypen wird die Genexpression, die gezeigt hat, als besonders relevant für komplexe Merkmale 1.
Diese Methode testet im zellulären Kontext die Wirkung spezifischer DNA-Sequenzen auf die Genexpression. Das Prinzip ist die relative Häufigkeit der Transkripte aus den beiden Allele eines Gens, Analyse-Zellen, die eine Kopie der DNA-Sequenzen mit der Krankheit (das Risiko Varianten) 2,3 assoziiert tragen zu messen. Daher sollten die Zellen für diese Methode verwendet erfüllen zwei grundlegende genotypische Anforderungen: Sie müssen sowohl für die DNA-Risiko-Varianten und für die DNA-Marker, die typischerweise Codierung Polymorphismen, die Transkripte auf ihre chromosomale Herkunft (Abbildung 1) unterscheiden kann heterozygot. DNA Risiko Varianten und DNA-Marker müssen nicht das gleiche Allel-Frequenz haben, aber die Phase (haplotypic) Beziehung der genetischen Marker verstanden werden muß. Es ist auch wichtig, um Zelltypen, die das Gen von Interesse exprimieren wählen. Dieses Protokoll bezieht sich speziell auf das Verfahren angenommen, um Nukleinsäuren aus Fibroblasten-Extrakt aber die Methode ist gleichermaßen anwendbar auf andere Zelltypen einschließlich Primärzellen.
DNA und RNA aus dem ausgewählten Zelllinien extrahiert und cDNA generiert. DNA und cDNA sind mit einem Primer-Extension-Assay entwickelt, um die kodierenden DNA-Marker 4 Ziel analysiert. Die Primer-Extension-Assay wird mit dem MassARRAY (Sequenom) 5-Plattform nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Primer Extension-Produkte werden dann durch Matrix-Assisted Laser Desorption / Ionisation Zeit-Flugzeit-Massenspektrometrie (MALDI-TOF/MS) analysiert. Da der ausgewählte Marker heterozygot sind, werden sie generieren zwei Spitzen auf der MS-Profile. Die Fläche der einzelnen Peaks ist proportional zur Niederschrift Fülle und kann mit einer Funktion des MassARRAY Typer Software eine allelische Verhältnis (Allel 1: Allel 2) erzeugen gemessen werden Berechnung. Die Allel-Verhältnis für cDNA gewonnen wird normiert, wobei die aus genomischer DNA, wo die allelische Verhältnis voraussichtlich 1:1 bis zur technischen Artefakten richtig gemessen. Markers mit einem normierten allelische Verhältnis signifikant zu 1 darauf hin, dass die Menge des Transkripts aus den beiden Chromosomen in der gleichen Zelle generiert anders ist, was darauf hindeutet, dass die DNA-Varianten mit dem Phänotyp assoziiert einen Effekt auf die Genexpression haben. Experimentelle Kontrollen sollten verwendet werden, um die Ergebnisse zu bestätigen.
Protocol
1) Cell Culture
- Wählen Zelltypen Expression des Gens von Interesse.
- Wählen Zelllinien heterozygot sowohl für die DNA-Risiko-Varianten und transkribiert Codierung Polymorphismus im Gen von Interesse (Abbildung 1).
- Kultur der ausgewählten Zelllinien nach den Spezifikationen des Lieferanten und für das 2 x 10 cm Petrischalen für die DNA-und RNA-Extraktion bzw..
- Wenn die Zellen bis zu 80% Konfluenz starten Sie die Prozedur, um die Ernten Zellen und Isolierung von DNA und RNA entweder nach dem unten beschriebenen Verfahren oder unter Verwendung kommerziell erhältlicher Kits.
2) DNA-Extraktion
- Entfernen Sie das Medium aus der Schale, mit PBS waschen und hinzufügen, um die Schale 500 ul einer Lyse-Lösung (0,6% SDS, 100 mM NaCl, 50 mM Tris, 20 mM EDTA und 50 pg / mL RNase A).
- Rock the Platte sanft 20 Minuten bei Raumtemperatur.
- Kratzen Sie die Zelllysat in ein Mikrozentrifugenröhrchen und bei 37 ° C über Nacht.
- Add Proteinase K in einer Endkonzentration von 100 ug / ml und bei 37 ° C über Nacht.
- Extrahieren Sie die DNA mit dem gleichen Volumen Phenol-Chloroform-pH 8, wiederholen, dann mit dem gleichen Volumen Chloroform / Isoamylalkohol extrahiert.
- Fällung der DNA mit 1 / 10 th Volumen 3 M NaCl und 2,5 Volumen 100% Ethanol.
- Lassen Sie auf Eis für 5 min und dann Spin bei 13.000 rpm für 30 min bei 4 ° C.
- Waschen Sie die DNA mit 70% Ethanol, an der Luft trocknen und resuspendieren in 200 ul TE zu ermöglichen.
- Inkubation bei 65 ° C für 10 min und verlassen dann für 2 Tage bei Raumtemperatur.
- Lagerung bei 4 ° C oder langfristig bei -20 ° C.
3) RNA-Extraktion
- Entfernen Sie das Medium aus der Schale, mit PBS waschen, 1 mL TRIzol und Inkubation für 10 min bei Raumtemperatur.
- Scrape Zellen, Pipette einige Male, Transfer in ein Mikrozentrifugenröhrchen und Inkubation für 5 min.
- Spin für 10 min bei 10.000 rpm bei 4 ° C.
- Übertragen Sie den Überstand in ein frisches Röhrchen und mit 200 ul Chloroform.
- Shake und Spin für 10 min bei 10.000 rpm bei 4 ° C.
- Übertragen Sie die wässrige Phase in ein frisches Röhrchen und ein gleiches Volumen 70% Ethanol.
- Laden Sie die Lösung auf 1 oder 2 (je nach Volumen) RNeasy Säule und Spin für 30 sec bei maximaler Geschwindigkeit.
- Von hier folgen Sie den Anweisungen des RNeasy-Kit (Qiagen).
4) von Nukleinsäuren
- Quantifizierung der DNA-und RNA-Konzentration mit einem NanoDrop Spektralphotometer (Thermo Scientific).
- Bereiten from 500-1000 ng der RNA mit zufälligen Dekameren und SuperScript III Reverse Transkriptase (Invitrogen) gemäß den Anweisungen des Herstellers cDNA.
5) PCR und Primer Extension Assay
- Design zwei Paare von PCR-Primer für jeden DNA-Marker, ein Paar für die genomische DNA-Amplifikation und das andere Paar für cDNA-Amplifikation (Abb. 2). Legen Sie vor-und rückwärts-Primer für cDNA-Amplifikation in verschiedenen Exons, um genomische Kontamination zu vermeiden. Design-Primer ein PCR-Produkt im Bereich von 100-500 bp Länge zu erhalten.
- Bereiten Sie eine 10 l PCR-Reaktion mit 0,5 U Taq Immolase (Bioline) 0,8 mM dNTPs, 2 mM MgCl 2, 0,2 M jedes Primers und 20 ng entweder cDNA oder DNA. Amplify jede Probe in vier unabhängigen Reaktionen.
- Führen Sie die PCR-Reaktion unter den Bedingungen für jedes Primerpaar halten Taktzahl in der linearen Phase der Amplifikation optimiert.
- Nehmen Sie PCR-Primer und dNTPs überschüssige durch Inkubation des PCR-Produkts mit Exonuklease I und Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP) bei 37 ° C für 20 Minuten.
- Spot jedes PCR-Produkt zweimal auf einer 384-Well-Platte, so dass 8 Messungen verfügbar sein wird für jede Probe.
- Entwerfen Sie die Erweiterung Primer mit dem Assay-Design (Sequenom) Software, so dass die gleichen Primer für beide genomischen und cDNA PCR-Produkte verwendet werden kann. Geben Primer Länge im Bereich von 14-18 bp und Erweiterung Mix einschließlich Kombinationen von 3ddNTPs (Abb. 2).
- Führen Sie die Primerverlängerungsreaktion und MALDI-TOF/MS Analyse mit dem MassARRAY-System (Sequenom) nach den Anweisungen des Herstellers.
- Ein typisches Primerverlängerungsreaktion gehören ein Start bei 94 ° C für 2 min, gefolgt von 40 Zyklen von 94 ° C für 5 s, 52 ° C für 5 s und 72 ° C folgte für 5 s.
- Die Primer-Extension-Produkte sind mit SpectroCLEAN Harz gereinigt und übertragen auf Microarray-(Chip) von SpectroPOINT Nanoliter Dispenser.
- Die erweiterte Oligonukleotide werden durch MALDI-TOF mit einem SpectroREADER Massenspektrometer quantifiziert.
6) Statistische Analyse
- Überprüfen Sie MALDI-TOF/MS Ergebnisse mit dem MassARRAY Typer Software für allgemeine Qualität des Experiments.
- Entpacken Sie die Allelotyping Bericht, der die Peakfläche Daten enthält.
- Für jedes einzelne Spektrum berechnenVerhältnis zwischen der Peakfläche von Allel 1 und Allel 2 (Peakflächenverhältnis).
- Für jede cDNA-Probe abzuleiten Peakflächenverhältnis Mittelwert und Standardabweichung, über die entsprechende Funktion in Excel, über die 8 Messungen.
- Leiten Sie das gleiche bedeuten Peakflächenverhältnis über den 8 Messungen für genomische DNA.
- Teilen Sie die cDNA mittlere Verhältnis von der genomischen mittlere Verhältnis der Abweichung der erwarteten 1:1-Verhältnis zu bewerten.
7) Experimentelle Kontrollen
- Um auszuschließen, experimentelle Artefakte, wiederholen Sie das Experiment mindestens dreimal.
- Wann immer möglich, Design-Assays für weitere DNA-Marker.
- Entwerfen Sie mehrere PCR-Primerpaare und Erweiterung Primer Annealing sowohl vorwärts als auch rückwärts Stränge.
- Wann immer möglich Test als Negativ-Kontrollen Zelllinien, die heterozygot für DNA-Marker sind jedoch nicht mit der DNA Risiko-Varianten mit dem Phänotyp assoziiert (Abb. 1 und Abb.. 3)
8) repräsentative Ergebnisse
Ein Beispiel für eine Allel-spezifische Expressions-Analyse ist in Abbildung 3 mit Beispielen der Massenspektrometrie Spuren gezeigt. Die Abbildung zeigt die Ergebnisse aus der Analyse von 4-Allel-spezifischen Primer Extension-Produkte auf 4 verschiedene Vorlagen durchgeführt. Die Top-Grafiken stellen die Ergebnisse aus der Analyse der genomischen DNA von zwei verschiedenen Zelllinien, die sowohl heterozygot für eine transkribiert Codierung Polymorphismus erhalten. Allerdings nur Zelllinie A ist heterozygot für das Risiko DNA-Variante (Abbildung 1). Die unteren Diagramme stellen die Ergebnisse aus der Analyse der cDNA aus dem gleichen Zelllinien erzeugt wird. Als Ergebnis der experimentellen Artefakt der erste Gipfel ist immer höher als die zweite Spitze auch in der Genomanalyse. Daher sind die Ergebnisse aus der genomischen Analyse verwendet, um die cDNA Daten zu normalisieren. Nach der Normalisierung ist das Allel-Verhältnis signifikant von 1 in Zell-Linie A (wobei der zweite Peak erscheint niedriger im Vergleich zu den anderen Spektren), während es ist sehr nahe an 1 liegt in Zell-Linie B. Die Daten, die Zell-Linie deuten auf eine trägt eine DNA-Variante, in Phase mit dem Allel durch die zweite Spitze, die die Expression des Gens in der Analyse reduziert gemessen. Zelllinie B bietet eine sehr komfortable negative Kontrolle.
Abbildung 1. Zelllinie Auswahl Strategie. Zelllinien A und B sind heterozygot für eine transkribiert Codierung Markierung (Dreieck), sondern nur Zelllinie A ist heterozygot für das Risikomanagement DNA-Variante (Kreis). Die blaue Allel das Risiko-Variante assoziiert ist (entweder mit einem direkten Effekt, oder weil in enger Korrelation mit dem tatsächlichen funktionelle Variante) mit einer niedrigeren Ebene der Transkription.
Abbildung 2. Allel-spezifische Primer-Extension-Assay. Diese Zahl zeigt die Work-Flow des experimentellen Verfahrens für beide cDNA (links) und genomischer DNA (rechts) Vorlagen durchgeführt. PCR-Primer (graue Rechtecke) sind entworfen, um eine heterozygote Kodierung Polymorphismus (Dreieck) zu verstärken. Zur Vermeidung von Kontaminationen genomischer PCR-Primer anlagern Sequenzen in verschiedenen Exons (hellblaue Linien), wenn Amplifikation auf cDNA-Template durchgeführt platziert. Das PCR-Produkt wird dann als Vorlage für eine Primer-Extension-Reaktion mit einer Verlängerung Primer durchgeführt verwendet, Glühen eine Basis neben dem Polymorphismus und die geeignete Dosierung von drei Didesoxynukleotid (ddNTPs) Terminatoren (Quadrate) und eine Desoxynukleotid (Kreis) zu verlängern die Grundierung von einem oder zwei Basis bzw.. Die daraus resultierende Primerverlängerungsprodukte haben unterschiedliche Massen, die Trennung und Quantifizierung von MALDI-TOF-Massenspektrometrie ermöglicht. Die Menge des Produkts entsprechend der blauen Allel des DNA-Marker ist relativ niedriger die rote Allel.
Abbildung 3. Ergebnisse einer Allel-spezifische Expression Assays. Die Abbildung zeigt die Massenspektrometrie ergibt sich aus der durchgeführten Analyse der genomischen DNA und der cDNA der Zelllinie A-und B-Zelllinie (Abbildung 1).
Discussion
Diese Methode ermöglicht die Evaluierung der Wirkung von krankheits-assoziierte DNA-Varianten auf die Genexpression durch die Beurteilung in vivo Allel-spezifischen Unterschied in der Niederschrift Ebene. In diesem Protokoll relativen Transkript Fülle von MALDI-TOF, sondern auch andere Technologien, die Allel-spezifische Quantifizierung, wie TaqMan 6,7 gemessen wird, verwendet werden können. Die wesentliche Einschränkung dieses Ansatzes ist die Verfügbarkeit von transkribiert Codierung Marker. Methoden, die auf dem Prinzip, hier beschriebenen, aber unter Ausnutzung der verschiedenen Klassen von Polymorphismen beschrieben worden. Die haploChip Assay misst Allel-spezifische Expression mittels Markern innerhalb von 1 kb der transkriptionellen Anfang oder Ende Gelände eines Gens, das vorhanden sein würde in Chromatin Immunopräzipitation Material mit spezifischen Antikörpern gegen RNA-Polymerase II 8 isoliert gelegen. Alternativ können intronischen SNPs verwendet werden, wenn die Vorlage heteronukleare RNA 9 sein.
Die spezifischen hier beschriebene Protokoll, in Kombination mit dem haploChip Assay wurde erfolgreich zu einem Kandidatengen für Legasthenie (oder Leseschwäche) zu identifizieren. Zunächst wird eine genetische Assoziation Studie identifizierte eine DNA-Sequenz mit Legasthenie und die war über drei Gene 10 zugeordnet. Die Allel-spezifische Gen-Expression Assays zeigten, dass in Anwesenheit der Legasthenie-assoziierten DNA-Varianten Ausdruck Variation wurde für nur einen der drei Genen beobachtet, nicht aber die anderen beiden 11.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Wellcome Trust durch Zuschüsse finanziert APM [076566/Z/05/Z], JCK [074318] und einem Kern Zuschlag auf das Wellcome Trust Centre for Human Genetics [075491/Z/04].Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | Sigma-Aldrich | P-4417-100TAB | |
| SDS | Bio-Rad | 161-0416 | |
| NaCl | VWR international | 27788.366 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503-1KG | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134-500G | |
| RNase A | Qiagen | 19101 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308-500MG | |
| Phenol: chloroform | Sigma-Aldrich | 77617 | |
| Chloroform | VWR international | 100777C | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 32221-2.5L | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| RNeasy kit | Qiagen | 74104 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18080-044 | |
| Immolase Taq | Bioline | BIO-21048 | |
| dNTP | Sigma-Aldrich | DNTP100A | |
| Exonuclease 1 | New England Biolabs | M0293S | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase | GE Healthcare | E70092Z | |
| SpectroCLEAN resin | Sequenom | 10053 | |
| MassEXTEND ddNTP/dNTP mix | Sequenom | Varies according to assay design | |
| MassEXTEND thermosequenase | Sequenom | 10052 | |
| Equipment | |||
| Chilled microcentrifuge | Eppendorf | ||
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| SpectroPOINT nanolitre dispenser | Sequenom | ||
| SpectroREADER mass spectrometer | Sequenom |
References
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