Summary
Associations génétiques restent souvent inexpliquées au niveau fonctionnel. Cette méthode vise à évaluer l'effet du phénotype associé marqueurs génétiques sur l'expression des gènes par l'analyse de cellules hétérozygotes pour SNP transcrites. La technologie permet une mesure précise par MALDI-TOF spectrométrie de masse pour quantifier allèle-spécifique des produits d'extension d'amorces.
Abstract
Le nombre d'associations génétiques significatives avec des traits communs complexe est en constante augmentation. Cependant, la plupart de ces associations n'ont pas été compris au niveau moléculaire. Un des mécanismes de médiation de l'effet des variants d'ADN sur des phénotypes est l'expression des gènes, qui a été montré pour être particulièrement pertinent pour les traits complexes 1.
Cette méthode teste dans un contexte cellulaire de l'effet de séquences d'ADN spécifiques sur l'expression génique. Le principe est de mesurer l'abondance relative des transcrits issus des deux allèles d'un gène, l'analyse des cellules qui portent une copie des séquences d'ADN associées à la maladie (les variantes de risque) 2,3. Par conséquent, les cellules utilisées pour cette méthode doit répondre à deux exigences fondamentales génotypique: ils doivent être hétérozygotes à la fois pour le risque variantes de l'ADN et des marqueurs de l'ADN, polymorphismes généralement de codage, qui permet de distinguer les transcriptions en fonction de leur origine chromosomique (Figure 1). Variantes de risque de l'ADN et des marqueurs d'ADN n'ont pas besoin d'avoir la fréquence de l'allèle mêmes, mais la phase (haplotypique) relation des marqueurs génétiques doit être comprise. Il est également important de choisir des types de cellules qui expriment le gène d'intérêt. Ce protocole se réfère spécifiquement à la procédure adoptée pour extraire les acides nucléiques à partir de fibroblastes, mais la méthode est également applicable à d'autres types de cellules, y compris des cellules primaires.
ADN et ARN sont extraits à partir des lignées cellulaires sélectionnées et d'ADNc est généré. ADN et d'ADNc sont analysées avec un test d'extension d'amorces, conçu pour cibler les marqueurs d'ADN codant 4. Le test extension d'amorce est réalisée en utilisant les MassARRAY (Sequenom) 5 plate-forme selon les spécifications du fabricant. Produits d'extension d'amorce sont ensuite analysées par laser assistée par matrice de désorption / ionisation de temps de vol spectrométrie de masse (MALDI-TOF/MS). Parce que les marqueurs sélectionnés sont hétérozygotes, ils génèrent deux pics sur les profils de MS. La surface de chaque pic est proportionnelle à l'abondance et la transcription peut être mesurée avec une fonction du logiciel Typer MassARRAY pour générer un rapport allélique (allèle 1: allèle 2) du calcul. Le ratio obtenu pour allélique ADNc est normalisé en utilisant celle mesurée à partir d'ADN génomique, où le ratio allélique devrait être de 1:1 pour corriger les artefacts techniques. Marqueurs avec un ratio normalisé alléliques significativement différente de 1 indiquent que la quantité de transcrit généré par les deux chromosomes dans la même cellule est différente, ce qui suggère que les variantes génétiques associées au phénotype ont un effet sur l'expression des gènes. Contrôles expérimentaux devraient être utilisées pour confirmer les résultats.
Protocol
Culture Cellulaire 1)
- Sélectionnez les types de cellules exprimant le gène d'intérêt.
- Sélectionner des lignées de cellules hétérozygotes à la fois pour des variantes de l'ADN des risques et transcrit le polymorphisme de codage au sein du gène d'intérêt (figure 1).
- Culture des lignées cellulaires sélectionnées selon les spécifications du fournisseur et de préparer 2 x 10 cm boîtes de Pétri pour l'extraction d'ADN et d'ARN, respectivement.
- Lorsque les cellules atteignent 80% de confluence lancer la procédure pour les cellules des récoltes et d'isoler l'ADN et l'ARN soit en suivant la procédure décrite ci-dessous ou en utilisant des kits disponibles dans le commerce.
Extraction de l'ADN 2)
- Retirez le support de l'antenne, se laver avec du PBS et ajouter au plat 500 ul d'une solution de lyse (0,6% de SDS, 100 mM NaCl, 50 mM Tris, EDTA 20 mM et 50 ug / ml de RNase A).
- Rocher de la plaque doucement pendant 20 minutes à température ambiante.
- Racler le lysat cellulaire dans un tube à centrifuger et incuber à 37 ° C pendant la nuit.
- Ajouter la protéinase K à une concentration finale de 100 pg / ml et incuber à 37 ° C pendant la nuit.
- Extrait de l'ADN avec un volume égal de phénol-chloroforme pH 8, répéter, puis extrait avec un volume égal de chloroforme / alcool isoamylique.
- Précipiter l'ADN avec 1 / 10 ème volume de NaCl 3 M et 2,5 volumes d'éthanol 100%.
- Laisser sur la glace pendant 5 min, puis tourner à 13000 rpm pendant 30 min à 4 ° C.
- Laver l'ADN à l'éthanol 70%, permettant à l'air sec et remettre en suspension dans 200 ul de TE.
- Incuber à 65 ° C pendant 10 min puis laisser reposer 2 jours à température ambiante.
- Conserver à 4 ° C ou à long terme à -20 ° C.
3) Extraction de l'ARN
- Retirez le support de l'antenne, se laver avec du PBS, ajouter 1 ml de Trizol et incuber pendant 10 min à température ambiante.
- Racler les cellules, une pipette quelques fois, le transfert dans un microtube et incuber pendant 5 min.
- Spin pendant 10 min à 10000 rpm à 4 ° C.
- Transférer le surnageant dans un nouveau tube et ajouter 200 ul de chloroforme.
- Secouez et de spin pendant 10 min à 10000 rpm à 4 ° C.
- Transférer la phase aqueuse dans un tube frais et ajouter un volume égal d'éthanol à 70%.
- Chargez la solution à 1 ou 2 (selon le volume) et de spin colonne RNeasy pendant 30 sec à vitesse maximale.
- De là, suivre les instructions du kit RNeasy (Qiagen).
4) Préparation Nucleic Acid échantillon
- Quantifier l'ADN et la concentration d'ARN en utilisant un spectrophotomètre NanoDrop (Thermo Scientific).
- Préparer ADNc à partir de 500-1000 ng d'ARN en utilisant décamères aléatoire et SuperScript III de la transcriptase inverse (Invitrogen) selon les instructions du fabricant.
5) PCR et Assay extension d'amorce
- Conception de deux paires d'amorces de PCR pour chaque marqueur d'ADN, une paire pour l'amplification de l'ADN génomique et l'autre paire pour l'amplification de l'ADNc (figure 2). Placez avant et arrière d'amorces pour l'amplification d'ADNc dans les exons différents pour éviter la contamination génomique. Primer la conception pour obtenir un produit de PCR dans la gamme de 100-500 pb de longueur.
- Préparer une réaction 10 uL de PCR dont 0,5 U de Taq Immolase (Bioline) 0,8 mM de dNTPs, MgCl2 2 mM, 0,2 M de chaque amorce et 20 ng d'ADNc ou ADN soit. Amplifier chaque échantillon en quatre réactions indépendantes.
- Exécutez la réaction de PCR dans les conditions optimisées pour chaque paire d'amorces garder le numéro du cycle en phase linéaire de l'amplification.
- Retirer amorces PCR et dNTPs excès en incubant le produit de PCR avec l'exonucléase I et phosphatase alcaline de crevette (SAP) à 37 ° C pendant 20 minutes.
- Spot de chaque produit de PCR à deux reprises sur une plaque de 384 puits, de sorte que 8 mesures seront disponibles pour chaque échantillon.
- Conception de l'amorce d'extension avec la conception Assay (Sequenom) logiciel de sorte que la même amorce peut être utilisée pour les deux génomiques et d'ADNc produits de PCR. Précisez longueur de l'amorce de la gamme de 14-18 pb et mélanger vulgarisation, y compris des combinaisons de 3ddNTPs (Fig 2).
- Réaliser la réaction d'extension d'amorces et d'analyse MALDI-TOF/MS utilisant le système MassARRAY (Sequenom) conformément aux instructions du fabricant.
- Une réaction typique de l'extension d'amorces comprennent une étape de départ à 94 ° C pendant 2 min, suivie de 40 cycles de 94 ° C pendant 5 s, 52 ° C pendant 5 s et 72 ° C pendant 5 s.
- Les produits d'extension d'amorces sont nettoyés avec de la résine SpectroCLEAN et transférés sur microréseau (puce) par SpectroPOINT nanolitre distributeur.
- Les oligonucléotides étendu sont quantifiés par MALDI-TOF en utilisant un spectromètre de masse SpectroREADER.
6) Analyse statistique
- Vérifiez les résultats MALDI-TOF/MS avec le logiciel Typer MassARRAY pour la qualité générale de l'expérience.
- Extrait du rapport allélotypage qui comprend la zone de données de pointe.
- Pour chaque spectre individuel calculer larapport entre la surface du pic de l'allèle 1 et allèle 2 (rapport surface des pics).
- Pour chaque échantillon d'ADNc dérivent d'une moyenne surface du pic ratio et l'écart-type, en utilisant la fonction correspondante dans Excel, à travers les 8 mesures.
- Dériver le même rapport de la surface moyenne de pointe à travers le 8 measurments pour l'ADN génomique.
- Diviser le rapport d'ADNc dire par le ratio signifie génomique afin d'évaluer l'écart à l'attendus ratio de 1:1.
7) des contrôles expérimentaux
- Pour écarter les artefacts expérimentaux, répéter l'expérience au moins trois fois.
- Autant que possible la conception des essais, des marqueurs d'ADN supplémentaires.
- Conception de plusieurs paires d'amorces de PCR et des amorces d'extension de recuit à des brins à la fois avant et arrière.
- Chaque fois que possible, de test comme négatif contrôle des lignées cellulaires qui sont hétérozygotes pour les marqueurs de l'ADN, mais ne portent pas le risque de variantes génétiques associées au phénotype (Fig. 1 et Fig. 3)
8) Les résultats représentatifs
Un exemple de l'allèle spécifique d'analyse d'expression est montré dans la figure 3, avec des exemples de traces par spectrométrie de masse. La figure montre les résultats de l'analyse de quatre allèle-spécifique des produits d'extension d'amorces réalisées sur 4 modèles différents. Les graphiques haut représentent les résultats obtenus à partir de l'analyse de l'ADN génomique de deux lignées cellulaires différentes, qui sont tous deux hétérozygotes pour un polymorphisme transcrit codage. Toutefois, seule lignée cellulaire A est hétérozygote pour la variante ADN risque (figure 1). Les graphiques du bas représentent les résultats obtenus à partir de l'analyse de l'ADNc générés à partir des mêmes lignées cellulaires. En raison de l'artefact expérimental premier pic est toujours plus élevé que le deuxième pic, même dans l'analyse génomique. Par conséquent, les résultats de l'analyse génomique sont utilisés pour normaliser les données d'ADNc. Après la normalisation, le ratio allèle est significativement différent de 1 dans une lignée cellulaire (où le second pic apparaît faible par rapport aux spectres d'autres), alors qu'elle est très proche de 1 dans la lignée cellulaire B. Les données suggèrent que la lignée cellulaire Un porte une variante de l'ADN, en phase avec l'allèle mesurée par le deuxième pic, ce qui réduit l'expression du gène en cours d'analyse. Lignée cellulaire B fournit un contrôle très pratique négative.
Figure 1. Les lignées cellulaires stratégie de sélection de cellules en ligne. A et B sont hétérozygotes pour un marqueur de codage transcrit (triangle), mais seule lignée cellulaire A est hétérozygote pour la variante ADN risque (cercle). L'allèle bleu de la variante de risque est associé (que ce soit avec un effet direct ou parce que en étroite corrélation avec la variante fonctionnelle réelle) avec un faible niveau de la transcription.
Figure 2. Allèle-spécifique de dosage extension d'amorce. Ce chiffre montre le travail d'écoulement de la procédure expérimentale menée à la fois pour l'ADN d'ADNc (à gauche) et de la génomique (à droite) des modèles. Des amorces de PCR (rectangles gris) sont conçues pour amplifier un polymorphisme hétérozygote codage (triangle). Pour éviter la contamination des amorces PCR génomique recuit séquences placées dans des exons différents (barres bleues) lorsque l'amplification est réalisée sur matrice d'ADNc. Le produit PCR est ensuite utilisé comme matrice pour une réaction d'extension d'amorces réalisée avec une amorce d'extension, une base de recuit à côté du polymorphisme, et la combinaison appropriée de trois didésoxynucléotides (ddNTP) terminateurs (carrés) et un désoxynucléotides (cercle) pour étendre l'apprêt d'un ou deux de base respectivement. Les produits résultant d'extension d'amorces ont des masses différentes qui permettent la séparation et la quantification par spectrométrie de masse MALDI-TOF. La quantité de produit correspondant à l'allèle bleu du marqueur d'ADN est relativement faible à l'allèle rouge.
Figure 3. Résultats d'un allèle spécifique de dosage d'expression. La figure montre les résultats de spectrométrie de masse à partir de l'analyse effectuée sur l'ADN génomique et l'ADNc de la lignée cellulaire A et B lignée cellulaire (figure 1).
Discussion
Cette méthode permet d'évaluer l'effet des maladies associées aux variantes de l'ADN sur l'expression génique par l'évaluation dans le allèle-spécifique in vivo de différence dans le niveau de transcription. Dans ce protocole d'abondance relative est mesurée la transcription par MALDI-TOF, mais d'autres technologies permettant la quantification allèle-spécifique, tels que TaqMan 6,7, peut être utilisé. La principale limitation de cette approche est la disponibilité des transcrits des marqueurs de codage. Méthodes basées sur le principe décrit ici, mais en profitant des différentes classes de polymorphismes ont été décrits. Le dosage de haploChip mesures spécifiques d'un allèle d'expression en utilisant des marqueurs situés dans 1 kb de l'initiation de la transcription ou le site fin d'un gène qui serait présent dans la chromatine du matériel immunoprécipité isolés avec des anticorps spécifiques à l'ARN polymérase II 8. Alternativement, les SNP intronique peut être utilisé lorsque le modèle est hétéronucléaires ARN 9.
Le protocole spécifique décrit ici, en combinaison avec le dosage haploChip, a été utilisée avec succès pour identifier un gène candidat pour la dyslexie (ou d'un handicap de lecture). Initialement une étude d'association génétique identifié une séquence d'ADN associés à la dyslexie et qui a été couvrant trois gènes 10. L'allèle épreuves spécifiques ont montré que l'expression des gènes dans la présence de la dyslexie associée variations d'expression d'ADN variantes a été observé pour un seul des trois gènes, mais pas les deux autres 11.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par le Wellcome Trust au moyen de subventions à l'APM [076566/Z/05/Z], JCK [074318] et un prix de base pour le Centre Wellcome Trust for Human Genetics [075491/Z/04].Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | Sigma-Aldrich | P-4417-100TAB | |
| SDS | Bio-Rad | 161-0416 | |
| NaCl | VWR international | 27788.366 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503-1KG | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134-500G | |
| RNase A | Qiagen | 19101 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308-500MG | |
| Phenol: chloroform | Sigma-Aldrich | 77617 | |
| Chloroform | VWR international | 100777C | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 32221-2.5L | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| RNeasy kit | Qiagen | 74104 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18080-044 | |
| Immolase Taq | Bioline | BIO-21048 | |
| dNTP | Sigma-Aldrich | DNTP100A | |
| Exonuclease 1 | New England Biolabs | M0293S | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase | GE Healthcare | E70092Z | |
| SpectroCLEAN resin | Sequenom | 10053 | |
| MassEXTEND ddNTP/dNTP mix | Sequenom | Varies according to assay design | |
| MassEXTEND thermosequenase | Sequenom | 10052 | |
| Equipment | |||
| Chilled microcentrifuge | Eppendorf | ||
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| SpectroPOINT nanolitre dispenser | Sequenom | ||
| SpectroREADER mass spectrometer | Sequenom |
References
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