Summary
Genetische associaties blijven vaak onverklaarbare op een functioneel niveau. Deze methode heeft tot doel het effect van de fenotype-geassocieerde genetische markers te beoordelen op gen-expressie door het analyseren van cellen heterozygoot voor getranscribeerd SNPs. De technologie maakt het mogelijk nauwkeurig te meten door middel van MALDI-TOF massaspectrometrie om allel-specifieke primer extension producten te kwantificeren.
Abstract
Het aantal significante genetische associaties met gemeenschappelijke complexe eigenschappen wordt steeds groter. Toch hebben de meeste van deze verenigingen niet begrepen op moleculair niveau. Een van de mechanismen bemiddelende het effect van de DNA-varianten op de fenotypes is genexpressie, die is aangetoond dat het bijzonder relevant voor complexe eigenschappen 1.
Deze methode tests in een cellulaire context het effect van specifieke DNA-sequenties op gen expressie. Het principe is het meten van de relatieve overvloed van transcripten die voortvloeien uit de twee allelen van een gen, het analyseren van cellen die een kopie van de DNA-sequenties geassocieerd met de ziekte (het risico varianten) 2,3 dragen. Daarom moet de cellen die voor deze methode voldoet aan twee fundamentele genotypische eisen: ze moeten heterozygoot zijn voor zowel DNA-varianten het risico en voor het DNA-merkers, meestal codering polymorfismen, die kan onderscheiden transcripties op basis van hun chromosomale herkomst (figuur 1). DNA-risico varianten en DNA-merkers hoeven niet hetzelfde allel frequentie hebben, maar de fase (haplotypic) relatie van de genetische markers moet worden begrepen. Het is ook belangrijk om te kiezen celtypen die het gen van belang uit te drukken. Dit protocol verwijst specifiek naar de procedure goedgekeurd om nucleïnezuren uittreksel uit fibroblasten, maar de methode is ook toepasbaar op andere cellen te types inclusief primaire cellen.
DNA en RNA worden geëxtraheerd uit de geselecteerde cellijnen en cDNA wordt gegenereerd. DNA en cDNA worden geanalyseerd met een primer extensie test, ontworpen om de coderende DNA-merkers 4 target. De primer extensie test is uitgevoerd met behulp van MassARRAY (Sequenom) 5-platform volgens de specificaties van de fabrikant. Primer extensie producten worden vervolgens geanalyseerd door matrix-assisted laser desorptie / ionisatie tijd of-flight massaspectrometrie (MALDI-TOF/MS). Omdat de geselecteerde markers heterozygoot zijn ze genereren twee pieken op de MS profielen. De oppervlakte van elke piek is evenredig met de transcript overvloed en kan gemeten worden met een functie van de MassARRAY Typer software om een allele-ratio (een allel: allel 2) het genereren van berekening. De allelische verhouding verkregen cDNA is genormaliseerd met behulp van dat gemeten vanaf genomisch DNA, waar de allel-ratio naar verwachting 1:01 om te corrigeren voor technische artefacten. Markers met een genormaliseerde allelische verhouding aanzienlijk anders dan een aan te geven dat de hoeveelheid transcript gegenereerd uit de twee chromosomen in dezelfde cel verschillend is, wat suggereert dat het DNA-varianten worden geassocieerd met het fenotype een effect op genexpressie hebben. Experimentele controles moeten worden gebruikt om de resultaten te bevestigen.
Protocol
1) Cel Cultuur
- Selecteer cel types het gen van belang.
- Selecteer cellijnen heterozygoot zowel voor DNA-risico varianten en getranscribeerd codering polymorfisme in het gen van belang (Figuur 1).
- Cultuur van de geselecteerde cellijnen volgens de leverancier de specificaties en 2 x 10 cm Petrischalen voor DNA-en RNA-extractie respectievelijk voor te bereiden.
- Wanneer de cellen bereiken 80% confluentie de procedure te starten om te oogsten cellen en isoleren van DNA en RNA ofwel volgens de hieronder beschreven procedure of het gebruik van commercieel verkrijgbare kits.
2) DNA-extractie
- Verwijder het afdrukmateriaal uit de schotel, wassen met PBS en voeg aan het gerecht 500 pi van een lysis-oplossing (0,6% SDS, 100 mM NaCl, 50 mM Tris, 20 mM EDTA en 50 ug / ml RNase A).
- Schud de plaat gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
- Schraap de cel lysaat in een microcentrifugebuis en incubeer bij 37 ° C gedurende de nacht.
- Voeg proteinase K tot een uiteindelijke concentratie van 100 ug / ml en incubeer bij 37 ° C gedurende de nacht.
- Extract van het DNA met een gelijk volume fenol-chloroform pH 8, herhalen, dan extract met een gelijk volume van chloroform / isoamylalcohol.
- Neerslag het DNA met 1 / 10 e deel 3 M NaCl en 2,5 volumes 100% ethanol.
- Laat op ijs gedurende 5 minuten en dan draaien op 13.000 rpm gedurende 30 min bij 4 ° C.
- Was de DNA met 70% ethanol, laat aan de lucht drogen en resuspendeer in 200 pi van TE.
- Incubeer bij 65 ° C gedurende 10 minuten en laat gedurende 2 dagen bij kamertemperatuur.
- Bewaren bij 4 ° C of lange termijn bij -20 ° C.
3) RNA-extractie
- Verwijder het afdrukmateriaal uit de schotel, wassen met PBS, voeg 1 ml TRIzol en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Schraap cellen en pipetteer een paar keer, transfer in een microcentrifugebuis en incubeer gedurende 5 minuten.
- Spin gedurende 10 minuten bij 10.000 rpm bij 4 ° C.
- Breng het supernatans in een nieuwe buis en voeg 200 pi chloroform.
- Schudden en draaien gedurende 10 minuten bij 10.000 rpm bij 4 ° C.
- Breng de waterige fase in een nieuwe buis en voeg een gelijk volume van 70% ethanol.
- Laad de oplossing om 1 of 2 (afhankelijk van het volume) RNeasy kolom en spin voor 30 sec op maximale snelheid.
- Vanaf hier volgt u de instructies van RNeasy kit (Qiagen).
4) Nucleic Acid Monstervoorbereiding
- Kwantificeren DNA en RNA-concentratie met behulp van een NanoDrop Spectrofotometer (Thermo Scientific).
- Bereid cDNA van 500-1000 ng van het RNA met behulp van willekeurige decamers en SuperScript III reverse transcriptase (Invitrogen) volgens de instructies van de fabrikant.
5) PCR en Primer Extension Assay
- Ontwerp twee paar PCR-primers voor elke DNA merker, een paar voor genomische DNA-amplificatie en het andere paar voor cDNA amplificatie (afb. 2). Plaats vooruit en reverse primer voor cDNA versterking in verschillende exonen aan genomische besmetting te voorkomen. Ontwerp primer om een PCR-product te verkrijgen in de range van 100-500 bp lengte.
- Bereid een 10 pi PCR-reactie met 0,5 U Taq Immolase (Bioline) 0,8 mM dNTPs, 2 mM MgCl 2, 0,2 M elke primer en 20 ng van een van beide cDNA of DNA. Versterken elk monster in vier onafhankelijke reacties.
- Lopen de PCR-reactie onder de voorwaarden geoptimaliseerd voor elke primerpaar houden cyclus nummer in de lineaire fase van de versterking.
- Verwijder de PCR-primer en dNTPs teveel door het incuberen van het PCR-product met exonuclease I en Garnalen alkalische fosfatase (SAP) bij 37 ° C gedurende 20 minuten.
- Twee keer Spot elk PCR-product op een 384-wells plaat, zodat de acht metingen beschikbaar zal zijn voor elk monster.
- Het ontwerp van de uitbreiding primer met de Assay Design (Sequenom) software zodat dezelfde primer gebruikt kan worden voor zowel genomische en cDNA PCR-producten. Geef primer lengte in de range van 14-18 bp en uitbreiding mix inclusief combinaties van 3ddNTPs (figuur 2).
- Het uitvoeren van de primer extensie reactie en MALDI-TOF/MS analyse met behulp van de MassARRAY systeem (Sequenom) volgens de aanwijzingen van de fabrikant.
- Een typische primer extensie reactie onder een beginnend stap bij 94 ° C gedurende 2 min, gevolgd door 40 cycli van 94 ° C gedurende 5 s, 52 ° C gedurende 5 s en 72 ° C gedurende 5 s.
- De primer extensie producten worden gereinigd met SpectroCLEAN hars en overgebracht naar microarray (chip) door SpectroPOINT nanoliter dispenser.
- De uitgebreide oligonucleotiden worden gekwantificeerd door middel van MALDI-TOF met behulp van een SpectroREADER massaspectrometer.
6) Statistische analyse
- Controleer MALDI-TOF/MS resultaten met de MassARRAY Typer software voor algemene kwaliteit van het experiment.
- Pak de Allelotyping verslag dat de piekoppervlakken gegevens bevat.
- Voor elke individuele spectrum het berekenen van deverhouding tussen het piekoppervlak van allel 1 en 2 allel (piekoppervlakte ratio).
- Voor elke cDNA monster ontlenen een piekoppervlak verhouding gemiddelde en de standaardafwijking, met behulp van de overeenkomstige functie in Excel, over de acht metingen.
- Leid hetzelfde betekenen piekoppervlak verhouding tussen de 8 maatvoeringen voor genomisch DNA.
- Verdeel de cDNA gemiddelde verhouding door de genomische betekenen verhouding tot de afwijking van de verwachte verhouding van 1:1 te beoordelen.
7) Experimentele Controls
- Uit te sluiten experimentele artefacten, herhaalt het experiment ten minste drie keer.
- Waar mogelijk, design assays voor extra DNA-merkers.
- Ontwerp meerdere PCR primer paren en uitbreiding primers gloeien om zowel vooruit als achteruit strengen.
- Waar mogelijk test als negatieve controles cellijnen die heterozygoot zijn voor DNA-merkers, maar dragen niet het risico DNA-varianten worden geassocieerd met het fenotype (figuur 1 en figuur 3.)
8) representatieve resultaten
Een voorbeeld van allel-specifieke expressie analyse is weergegeven in figuur 3 met voorbeelden van massaspectrometrie sporen. De figuur toont de resultaten van de analyse van 4 allel-specifieke primer extension producten op vier verschillende sjablonen uitgevoerd. De bovenste grafieken geven de resultaten van de analyse van genomisch DNA van twee verschillende cellijnen, die beide heterozygoot voor een getranscribeerd codering polymorfisme. Echter, alleen cellijn A is heterozygoot voor het risico op DNA variant (figuur 1). De onderste grafieken geven de resultaten van de analyse van het cDNA gegenereerd uit dezelfde cel lijnen. Als gevolg van experimenteel artefact de eerste piek is altijd hoger dan de tweede piek zelfs in de genomische analyse. Daarom worden de resultaten van de genomische analyse wordt gebruikt om de cDNA gegevens normaliseren. Na normalisatie, het allel-ratio sterk afwijkt van een in cellijn A (waar de tweede piek lijkt lager in vergelijking met de andere spectra), terwijl het erg om een dicht in cel lijn B. De gegevens suggereren dat cellijn A draagt een DNA-variant, in fase met de allel gemeten door de tweede piek, die de expressie van het gen onder analyse vermindert. Cellijn B biedt een zeer gunstige negatieve controle.
Figuur 1. Cellijn selectie-strategie. Cell lijnen A en B zijn heterozygoot voor een getranscribeerd codering marker (driehoek), maar slechts cellijn A is heterozygoot voor de risico-DNA variant (cirkel). De blauwe allel van de risico-variant wordt geassocieerd (al dan niet met een direct effect of omdat in nauwe samenhang met de feitelijke functionele variant) met een lager niveau van transcriptie.
Figuur 2. Allel-specifieke primer extensie test. Deze figuur tonen het werk-flow van de experimentele procedure uitgevoerd voor zowel de cDNA (links) en genomische DNA (rechts) templates. PCR-primers (grijze rechthoeken) zijn ontworpen om een heterozygote codering polymorfisme (driehoek) te versterken. Om te voorkomen dat verontreiniging genomische PCR-primers gloeien sequenties geplaatst in verschillende exonen (licht blauwe balken) als versterking wordt uitgevoerd op cDNA sjabloon. Het PCR-product wordt vervolgens gebruikt als template voor een primer uitbreiding reactie uitgevoerd met een uitbreiding primer, gloeien een voet naast de polymorfisme, en de juiste mix van drie dideoxynucleotide (ddNTPs) terminators (vierkantjes) en een deoxynucleotide (cirkel) uit te breiden de primer van een of twee basis respectievelijk. De resulterende primer extensie producten hebben verschillende massa's, die scheiding en kwantificering van MALDI-TOF massaspectrometrie mogelijk te maken. De hoeveelheid van het product overeenkomt met de blauwe allel van het DNA-merker relatief lager is naar de rode allel.
Figuur 3. Resultaten van een allel-specifieke expressie assay. De figuur tonen de massaspectrometrie resultaten van de analyse op het genomische DNA uitgevoerd en het cDNA van cellijn A-en B-cellijn (figuur 1).
Discussion
Deze methode maakt de evaluatie van het effect van de ziekte-geassocieerde DNA-varianten op genexpressie door het beoordelen van in vivo allel-specifieke verschillen in transcript niveau. In dit protocol relatieve overvloed transcript wordt gemeten door middel van MALDI-TOF, maar andere technologieën waardoor allel-specifieke kwantificering, zoals de TaqMan 6,7, kunnen worden gebruikt. De belangrijkste beperking van deze aanpak is de beschikbaarheid van getranscribeerd codering markers. Methoden op basis van het principe hier beschreven, maar gebruik te maken van verschillende klassen van polymorfismen, zijn beschreven. De haploChip test meet allel-specifieke expressie met behulp van markers zich binnen een kb van de transcriptie begin of het einde plaats van een gen dat aanwezig zou zijn in chromatine immunogeprecipiteerd materiaal geïsoleerd met antilichamen die specifiek RNA polymerase II 8. Als alternatief kan intronische SNPs worden gebruikt wanneer de sjabloon wordt heteronucleair RNA 9.
De specifieke protocol hier beschreven, in combinatie met de haploChip assay, is met succes gebruikt om een kandidaat-gen voor dyslexie (of lezen handicap) te identificeren. In eerste instantie een genetische associatie studie is een DNA-sequentie in verband met dyslexie en die is verspreid over drie genen 10. Het allel-specifieke genexpressie test toonde aan dat in de aanwezigheid van de dyslexie-geassocieerde DNA-varianten uitdrukking variatie werd waargenomen bij slechts een van de drie genen, maar niet de andere twee 11.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door de Wellcome Trust door middel van subsidies aan APM [076566/Z/05/Z], JCK [074318] en een kern te gunnen aan de Wellcome Trust Centre for Human Genetics [075491/Z/04].Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | Sigma-Aldrich | P-4417-100TAB | |
| SDS | Bio-Rad | 161-0416 | |
| NaCl | VWR international | 27788.366 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503-1KG | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134-500G | |
| RNase A | Qiagen | 19101 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308-500MG | |
| Phenol: chloroform | Sigma-Aldrich | 77617 | |
| Chloroform | VWR international | 100777C | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 32221-2.5L | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| RNeasy kit | Qiagen | 74104 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18080-044 | |
| Immolase Taq | Bioline | BIO-21048 | |
| dNTP | Sigma-Aldrich | DNTP100A | |
| Exonuclease 1 | New England Biolabs | M0293S | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase | GE Healthcare | E70092Z | |
| SpectroCLEAN resin | Sequenom | 10053 | |
| MassEXTEND ddNTP/dNTP mix | Sequenom | Varies according to assay design | |
| MassEXTEND thermosequenase | Sequenom | 10052 | |
| Equipment | |||
| Chilled microcentrifuge | Eppendorf | ||
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| SpectroPOINT nanolitre dispenser | Sequenom | ||
| SpectroREADER mass spectrometer | Sequenom |
References
- Cookson, W., Liang, L., Abecasis, G., Moffatt, M., Lathrop, M. Mapping complex disease traits with global gene expression. Nat Rev Genet. 10, 184-194 (2009).
- Singer-Sam, J., LeBon, J. M., Dai, A., Riggs, A. D. A sensitive, quantitative assay for measurement of allele-specific transcripts differing by a single nucleotide. PCR Methods Appl. 1, 160-163 (1992).
- Yan, H., Yuan, W., Velculescu, V. E., Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Allelic variation in human gene expression. Science. 297, 1143-11 (2002).
- Ding, C., Cantor, C. R. A high-throughput gene expression analysis technique using competitive PCR and matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight MS. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 3059-3064 (2003).
- Gabriel, S., Ziaugra, L. SNP genotyping using Sequenom MassARRAY 7K platform. Curr Protoc Hum Genet Chapter. Chapter 2 (Unit 2), 12-12 (2004).
- Lo, H. S. Allelic variation in gene expression is common in the human genome. Genome Res. 13 (8), 1855-1862 (2003).
- Liu, X. Expression-based discovery of variation in the human glutathione S-transferase M3 promoter and functional analysis in a glioma cell line using allele-specific chromatin immunoprecipitation. Cancer Res. 65, 99-104 (2005).
- Knight, J. C., Keating, B. J., Rockett, K. A., Kwiatkowski, D. P. In vivo characterization of regulatory polymorphisms by allele-specific quantification of RNA polymerase loading. Nat Genet. 33 (4), 469-475 (2003).
- Pastinen, T. A survey of genetic and epigenetic variation affecting human gene expression. Physiol Genomics. 16 (2), 184-193 (2004).
- Francks, C. A 77-kilobase region of chromosome 6p22.2 is associated with dyslexia in families from the United Kingdom and from the United States. Am J Hum Genet. 75 (6), 1046-1058 (2004).
- Paracchini, S. The chromosome 6p22 haplotype associated with dyslexia reduces the expression of KIAA0319, a novel gene involved in neuronal migration. Hum Mol Genet. 15 (10), 1659-1666 (2006).
