Summary
Генетические ассоциации часто остаются невыясненными на функциональном уровне. Этот метод предназначен для оценки влияния фенотипа связанных генетических маркеров на экспрессию генов, анализируя клетках гетерозиготных по транскрипции SNP. Технология позволяет точному измерению, MALDI-TOF масс-спектрометрии для количественного аллель-специфических продуктов удлинения праймера.
Abstract
Ряд существенных генетических ассоциаций с общим комплексом черт постоянно растет. Однако, большинство этих ассоциаций не понял на молекулярном уровне. Одним из механизмов посредническую эффект ДНК вариантов на фенотипов экспрессии генов, которое было показано, что особенно актуально для сложных признаков 1.
Этот метод испытания в сотовой связи влиянии специфических последовательностей ДНК на экспрессию генов. Принцип заключается в измерении относительного содержания стенограммы, вытекающих из двух аллелей гена, анализа клетки, которые несут по одной копии ДНК, связанные с болезнью (риск вариантов) 2,3. Таким образом, клетки, используемые для этого метода должно отвечать двум основным генотипической требования: они должны быть как для гетерозиготных вариантов ДНК риска и для ДНК-маркеров, как правило кодирования полиморфизмов, которые можно выделить на основе стенограмм их хромосомного происхождения (рис. 1). ДНК риск варианты и ДНК-маркеров, не должны иметь одинаковую частоту аллеля а фаза (haplotypic) связь генетических маркеров, необходимо понимать. Важно также выбрать типы клеток, которые выражают интерес гена. Этот протокол относится конкретно к процедуре, принятой для извлечения нуклеиновых кислот из фибробластов, но метод в равной степени применимо к другим типам клеток, включая первичные клетки.
ДНК и РНК, взяты из выбранных клеточных линий и кДНК генерируется. ДНК и кДНК анализируются с анализа удлинения праймера, разработанные с целью кодирования ДНК-маркеров 4. Анализ удлинения праймера осуществляется с помощью MassARRAY (Sequenom) 5 платформы в соответствии со спецификациями завода-изготовителя. Продуктов удлинения праймера которые затем анализируются на матрицу-активированная лазерная десорбция / ионизация время-пролетного масс-спектрометрии (MALDI-TOF/MS). Поскольку выбранные маркеры гетерозиготных они будут генерировать два пика на профили MS. Площадь каждого пика пропорциональна стенограмму изобилии и могут быть измерены с функцией программного обеспечения Typer MassARRAY генерировать аллельных отношение (аллель 1: аллель 2) расчета. Аллельных соотношение получено для кДНК нормирован с использованием этого измеряется от геномной ДНК, где соотношение аллелей, как ожидается, 1:01 для корректировки технических артефактов. Маркеры с нормированной аллельных соотношение значительно отличается от 1 показывают, что количество стенограмму генерируется из двух хромосом в одной камере отличается, предполагая, что ДНК варианты, связанные с фенотипом влияние на экспрессию генов. Экспериментальные контроля должны быть использованы для подтверждения результатов.
Protocol
1) культуре клеток
- Выберите типы клеток выражения гена.
- Выберите клеточных линий гетерозиготных как для ДНК риск варианты и транскрибируется кодирования полиморфизм в гене интереса (рис. 1).
- Культура выбранных клеточных линий в соответствии со спецификациями поставщиков и подготовить 2 х 10 см чашки Петри для выделения ДНК и РНК соответственно.
- Когда клетки достигают 80% слияния начать процедуру урожай клеток и изолировать ДНК и РНК, либо по методике, описанной ниже, или с использованием коммерчески доступных наборов.
2) выделение ДНК
- Удаление информации из блюда, промыть PBS и добавить к блюду 500 мкл лизис решение (0,6% SDS, 100 мМ NaCl, 50 мМ трис, 20 мМ ЭДТА и 50 мкг / мл РНКазы).
- Рок пластины мягко в течение 20 минут при комнатной температуре.
- Очистите Клеточный лизат в трубку микроцентрифужных и инкубировать при температуре 37 ° С в течение ночи.
- Добавить протеиназы К до конечной концентрации 100 мкг / мл и инкубируют при температуре 37 ° С в течение ночи.
- Извлечение ДНК с равным объемом фенол-хлороформ рН 8, повторить, а затем извлечь с равным объемом хлороформа / изоамиловый спирт.
- Осадок ДНК с 1 / 10-й том 3 М NaCl и 2,5 объема 100% этанола.
- Оставьте на льду в течение 5 мин и затем спина при 13000 оборотов в минуту в течение 30 мин при 4 ° C.
- Вымойте ДНК с 70% этанолом, позволяет воздушно-сухой и ресуспендируют в 200 мкл ТЕ.
- Инкубировать при 65 ° С в течение 10 мин, а затем оставить на 2 дня при комнатной температуре.
- Хранить при температуре 4 ° С или долгосрочной перспективе при температуре -20 ° C.
3) выделения РНК
- Удаление информации из блюда, промыть PBS, добавить 1 мл TRIzol и инкубировать в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Очистите клеток, пипетки несколько раз, передачи в микроцентрифужных трубки, инкубировать 5 мин.
- Спиновые течение 10 мин при 10 000 оборотов в минуту при температуре 4 ° C.
- Передача супернатант в новую пробирку и добавляют 200 мкл хлороформа.
- Встряхните и спин течение 10 мин при 10 000 оборотов в минуту при температуре 4 ° C.
- Передача водной фазы в новую пробирку и добавляют равный объем 70% этанола.
- Нагрузка раствора на 1 или 2 (в зависимости от объема) RNeasy столбца и спина в течение 30 сек при максимальной скорости.
- Отсюда следуют указанию RNeasy комплект (Qiagen).
4) нуклеиновых кислот для подготовки образцов
- Количественная ДНК и РНК концентрации использованием NanoDrop Спектрофотометр (Thermo Scientific).
- Подготовка кДНК 500-1000 нг РНК с использованием случайного decamers и надстрочный III обратной транскриптазы (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя.
5) Анализ ПЦР и удлинения праймера
- Дизайн две пары праймеров ПЦР для каждого ДНК маркеров, одна пара для геномной амплификации ДНК, а другая пара для кДНК усиления (рис. 2). Место прямого и обратного праймера для кДНК усиления в различных экзонов, чтобы избежать загрязнения геномной. Дизайн праймеров для получения ПЦР-продуктов в диапазоне 100-500 б.п. длины.
- Подготовка 10 мкл ПЦР в том числе 0,5 U Immolase Taq (Биолайн) 0,8 дНТФ мм, 2 мм MgCl 2, 0,2 М каждого праймера и 20 нг либо кДНК или ДНК. Amplify каждого образца в четырех независимых реакций.
- Выполнить ПЦР реакции в условиях, оптимально для каждой пары праймеров поддержания номер цикла в линейную фазу усиления.
- Удалить ПЦР праймера и дНТФ избыток путем инкубации ПЦР продукт с экзонуклеазная я и креветками щелочной фосфатазы (SAP) при 37 ° С в течение 20 минут.
- Пятно каждого продукта ПЦР в два раза по 384-луночного планшета, так что 8 измерений будет доступна для каждого образца.
- Дизайн удлинения праймера с Пробирной Дизайн (Sequenom) программное обеспечение, так что же грунтовка может быть использована как для геномной и кДНК ПЦР-продуктов. Укажите грунтовка длиной в диапазоне 14-18 б.п. и расширение смеси, включая комбинации 3ddNTPs (рис. 2).
- Провести реакции удлинения праймера и MALDI-TOF/MS анализ с использованием системы MassARRAY (Sequenom) в соответствии с инструкцией изготовителя.
- Типичная реакция удлинения праймера включают начиная шаг при 94 ° С в течение 2 мин, затем 40 циклов 94 ° С в течение 5 с, 52 ° С в течение 5 и 72 ° С в течение 5 сек
- Продуктов удлинения праймера моются SpectroCLEAN смолы и переносится на микрочипов (чип) с дозатором SpectroPOINT nanolitre.
- Расширенные олигонуклеотиды количественно с помощью MALDI-TOF использованием SpectroREADER масс-спектрометра.
6) Статистический анализ
- Проверьте MALDI-TOF/MS результаты с программным обеспечением MassARRAY Typer для общего качества эксперимента.
- Извлечение Allelotyping доклад, который включает в себя пик область данных.
- Для каждого отдельного расчета спектрасоотношение площади пика аллеля 1 и аллель 2 (пик соотношение площади).
- Для каждого образца кДНК получить пик среднее отношение площади и стандартное отклонение, используя соответствующую функцию в Excel, через 8 измерений.
- Вывести же среднее отношение площади пика через 8 measurments для геномной ДНК.
- Разделите кДНК среднее отношение к геномной среднее отношение оценить отклонение от ожидаемого соотношения 1:1.
7) Экспериментальная управления
- Чтобы исключить экспериментальные артефакты, повторите эксперимент по крайней мере три раза.
- Когда это возможно, дизайн анализы для дополнительных маркеров ДНК.
- Дизайн несколько пар праймеров ПЦР и расширение грунтовки отжига прямом и обратном прядей.
- По возможности тест отрицательный ячейка контроля линии, гетерозиготных по ДНК-маркеров, но не несут риск ДНК варианты, связанные с фенотипом (рис. 1 и рис. 3)
8) представитель Результаты
Примером аллель-специфического анализа выражения показано на рисунке 3 с примерами массового следы спектрометрии. Рисунке показаны результаты анализа 4 аллель-специфического праймера расширение продукции осуществляется на 4-х различных шаблонов. Топ графы представляют результаты, полученные из анализа геномной ДНК из двух различных клеточных линий, которые находятся в гетерозиготных по транскрипции кодирования полиморфизма. Однако, только клеточные линии является гетерозиготных по варианту риск ДНК (рис. 1). Ниже графы представляют результаты, полученные из анализа кДНК генерируется из той же линии клеток. В результате экспериментальных артефактов первый пик всегда выше, чем второй пик даже в геномного анализа. Таким образом, результаты геномного анализа используются для нормализации кДНК данных. После нормализации, аллель соотношение значительно отличается от 1 в клеточной линии (там, где появляется второй пик ниже по сравнению с другими спектрами), а это очень близко к 1 в клеточной линии B. данные показывают, что клеточная линия несет ДНК вариант, в фазе с аллель измеряется второй пик, что снижает экспрессию гена под анализа. Сотовые линии B обеспечивает очень удобный отрицательного контроля.
Рисунок 1. Сотовые выбора линии стратегии. Клеточных линий А и В гетерозиготных по транскрипции кодирования маркера (треугольник), но только клеточные линии является гетерозиготных по риску ДНК вариант (круг). Синий аллеля риска вариант связан (либо с прямого действия или потому, что в тесной корреляции с фактическим функциональным вариант) с более низким уровнем транскрипции.
Рисунок 2. Аллель-специфичная анализа удлинения праймера. Эта цифра показывает работы потока экспериментальной процедуры проводятся как для кДНК (слева) и геномной ДНК (справа) шаблонов. ПЦР-праймеров (серые прямоугольники) предназначены для усиления гетерозиготных кодирования полиморфизм (треугольник). Для того чтобы избежать загрязнения геномной ПЦР праймеры отжига последовательности, расположенными в разных экзонов (светло синий баров), когда усиление осуществляется на кДНК шаблона. Продукт ПЦР затем используется в качестве шаблона для реакции удлинения праймера осуществляется с удлинения праймера, отжиг одну базу рядом с полиморфизмом, и соответствующий набор из трех дидезоксинуклеотида (ddNTPs) терминаторы (квадраты) и один дезоксинуклеотидов (круг), чтобы расширить грунтовку из одной или двух основе соответственно. Полученных продуктов удлинения праймера имеют разные массы, которые позволяют разделение и количественное определение на MALDI-TOF масс-спектрометрии. Количество продукта, соответствующего синей аллеля ДНК маркера относительно ниже, чтобы красный аллель.
Рисунок 3. Результаты аллель-специфической анализа выражения. Рисунке показывают результаты спектрометрии массы из анализа, проведенного на геномной ДНК и кДНК линии клеток и клеточной линии B (рис. 1).
Discussion
Этот метод позволяет оценить влияние болезни, связанные вариантов ДНК на экспрессию генов путем оценки в естественных условиях аллель-специфической разница в стенограмме уровне. В этом протоколе относительное изобилие стенограмму измеряется MALDI-TOF, но и других технологий, позволяющих аллель-специфической количественного определения, такие как TaqMan 6,7, может быть использован. Основным недостатком такого подхода является наличие транскрипции кодирования маркеров. Методы, основанные на принципе, описанные здесь, но воспользоваться различными классами полиморфизмов, были описаны. Анализ haploChip меры аллель-специфическая экспрессия с помощью маркеров расположенных в пределах 1 кб транскрипционных начало или конец сайте гена, который будет присутствовать в хроматин иммунопреципитации материала изолированы антитела, специфичные к РНК-полимеразы II 8. Кроме того, интронных ОНП можно использовать, когда шаблон гетероядерных РНК 9.
Конкретного протокола, описанные здесь, в сочетании с анализа haploChip, успешно используется для идентификации генов-кандидатов для дислексией (или чтение инвалидности). Первоначально генетические исследования ассоциации определили последовательность ДНК, связанных с дислексией и который был охватывающих три гена 10. Аллель-специфической анализа экспрессии генов показал, что в присутствии дислексии связанной изменение экспрессии ДНК вариантов наблюдался лишь у одного из трех генов, а не двумя другими 11.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась Wellcome Trust через гранты APM [076566/Z/05/Z], JCK [074318] и основные награды Wellcome Trust Центр генетики человека [075491/Z/04].Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | Sigma-Aldrich | P-4417-100TAB | |
| SDS | Bio-Rad | 161-0416 | |
| NaCl | VWR international | 27788.366 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503-1KG | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134-500G | |
| RNase A | Qiagen | 19101 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308-500MG | |
| Phenol: chloroform | Sigma-Aldrich | 77617 | |
| Chloroform | VWR international | 100777C | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 32221-2.5L | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| RNeasy kit | Qiagen | 74104 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18080-044 | |
| Immolase Taq | Bioline | BIO-21048 | |
| dNTP | Sigma-Aldrich | DNTP100A | |
| Exonuclease 1 | New England Biolabs | M0293S | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase | GE Healthcare | E70092Z | |
| SpectroCLEAN resin | Sequenom | 10053 | |
| MassEXTEND ddNTP/dNTP mix | Sequenom | Varies according to assay design | |
| MassEXTEND thermosequenase | Sequenom | 10052 | |
| Equipment | |||
| Chilled microcentrifuge | Eppendorf | ||
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| SpectroPOINT nanolitre dispenser | Sequenom | ||
| SpectroREADER mass spectrometer | Sequenom |
References
- Cookson, W., Liang, L., Abecasis, G., Moffatt, M., Lathrop, M. Mapping complex disease traits with global gene expression. Nat Rev Genet. 10, 184-194 (2009).
- Singer-Sam, J., LeBon, J. M., Dai, A., Riggs, A. D. A sensitive, quantitative assay for measurement of allele-specific transcripts differing by a single nucleotide. PCR Methods Appl. 1, 160-163 (1992).
- Yan, H., Yuan, W., Velculescu, V. E., Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Allelic variation in human gene expression. Science. 297, 1143-11 (2002).
- Ding, C., Cantor, C. R. A high-throughput gene expression analysis technique using competitive PCR and matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight MS. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 3059-3064 (2003).
- Gabriel, S., Ziaugra, L. SNP genotyping using Sequenom MassARRAY 7K platform. Curr Protoc Hum Genet Chapter. Chapter 2 (Unit 2), 12-12 (2004).
- Lo, H. S. Allelic variation in gene expression is common in the human genome. Genome Res. 13 (8), 1855-1862 (2003).
- Liu, X. Expression-based discovery of variation in the human glutathione S-transferase M3 promoter and functional analysis in a glioma cell line using allele-specific chromatin immunoprecipitation. Cancer Res. 65, 99-104 (2005).
- Knight, J. C., Keating, B. J., Rockett, K. A., Kwiatkowski, D. P. In vivo characterization of regulatory polymorphisms by allele-specific quantification of RNA polymerase loading. Nat Genet. 33 (4), 469-475 (2003).
- Pastinen, T. A survey of genetic and epigenetic variation affecting human gene expression. Physiol Genomics. 16 (2), 184-193 (2004).
- Francks, C. A 77-kilobase region of chromosome 6p22.2 is associated with dyslexia in families from the United Kingdom and from the United States. Am J Hum Genet. 75 (6), 1046-1058 (2004).
- Paracchini, S. The chromosome 6p22 haplotype associated with dyslexia reduces the expression of KIAA0319, a novel gene involved in neuronal migration. Hum Mol Genet. 15 (10), 1659-1666 (2006).
