Summary
Asociaciones genéticas con frecuencia permanecen sin explicación a un nivel funcional. Este método tiene como objetivo evaluar el efecto del fenotipo asociado a los marcadores genéticos en la expresión génica mediante el análisis de las células heterocigotos para SNPs transcrito. La tecnología permite la medición precisa de MALDI-TOF espectrometría de masas para cuantificar alelo-específicas de los productos de extensión del cebador.
Abstract
El número de importantes asociaciones genéticas con rasgos comunes complejo está en constante aumento. Sin embargo, la mayoría de estas asociaciones no se han entendido a nivel molecular. Uno de los mecanismos que median el efecto de las variantes de ADN en los fenotipos es la expresión de genes, que ha demostrado ser particularmente relevante para los rasgos complejos 1.
Este método de análisis en un contexto celular el efecto de las secuencias específicas de ADN sobre la expresión génica. El principio consiste en medir la abundancia relativa de las transcripciones resultantes de los dos alelos de un gen, el análisis de las células que llevan una copia de las secuencias de ADN asociadas con la enfermedad (las variantes de riesgo) 2,3. Por lo tanto, las células utilizan para este método debe cumplir dos requisitos fundamentales genotípica: tienen que ser heterocigotos para ambas variantes de riesgo del ADN y los marcadores de ADN, los polimorfismos general de codificación, que puede distinguir las transcripciones en base a su origen cromosómico (Figura 1). Variantes de ADN de riesgo y marcadores de ADN no es necesario que la frecuencia del alelo mismo, pero la fase (haplotípica) relación de los marcadores genéticos tiene que ser entendido. También es importante elegir los tipos de células que expresan el gen de interés. Este protocolo se refiere específicamente al procedimiento adoptado para extraer los ácidos nucleicos a partir de fibroblastos, pero el método es igualmente aplicable a otros tipos de células incluyendo las células primarias.
ADN y el ARN se extraen de las líneas celulares seleccionadas y cDNA se genera. ADN y el cDNA se analizan con un ensayo de extensión del cebador, diseñado para los marcadores de ADN que codifica 4. El ensayo de extensión del cebador se lleva a cabo utilizando el MassARRAY (Sequenom) 5 plataforma de acuerdo a las especificaciones del fabricante. Productos de extensión del cebador son analizadas por láser asistida por matriz de desorción / ionización tiempo de vuelo espectrometría de masas (MALDI-TOF/MS). Debido a que los marcadores seleccionados son heterocigotos que va a generar dos picos en los perfiles. El área de cada pico es proporcional a la abundancia de transcripción y se puede medir con una función del software Typer MassARRAY para generar una relación de alelos (alelo 1: alelo 2) Cálculo. La relación alélica obtenida para cDNA se normaliza el uso que se mide a partir del ADN genómico, donde se espera que la proporción de alelos de 1:1 para corregir los artefactos técnicos. Marcadores con una relación normalizada alélicas significativamente diferentes a 1 indican que la cantidad de transcripción generada a partir de los dos cromosomas de la célula misma es diferente, lo que sugiere que las variantes de ADN asociados con el fenotipo de tener un efecto sobre la expresión génica. Controles experimentales se debe utilizar para confirmar los resultados.
Protocol
1) Cultivos Celulares
- Seleccione los tipos de células que expresan el gen de interés.
- Seleccione las líneas celulares heterocigotos tanto para las variantes de riesgo y el polimorfismo de ADN transcrito de codificación en el gen de interés (Figura 1).
- La cultura de la líneas de células seleccionadas de acuerdo a las especificaciones del proveedor y preparar 2 x 10 cm placas de Petri para la extracción de ADN y ARN, respectivamente.
- Cuando las células alcanzan el 80% de confluencia de iniciar el procedimiento para las células cosechas y aislar el ADN y el ARN o bien siguiendo el procedimiento descrito a continuación o utilizando los kits disponibles en el mercado.
2) Extracción de ADN
- Retire el medio del plato, lavar con PBS y añadir a la cazuela 500 l de una solución de lisis (0,6% SDS, 100 mM NaCl, 50 mM Tris, 20 mM EDTA y 50 mg / ml RNasa A).
- Roca suavemente la placa durante 20 minutos a temperatura ambiente.
- Raspe el lisado de células en un tubo de microcentrífuga y se incuba a 37 ° C durante la noche.
- Añadir proteinasa K a una concentración final de 100 mg / ml y se incuba a 37 ° C durante la noche.
- Extraer el ADN con un volumen igual de fenol-cloroformo pH 8, repito, a continuación, extraer con un volumen igual de cloroformo / alcohol isoamílico.
- Precipitar el ADN con 1 / 10 del volumen 3 M NaCl y 2,5 volúmenes de etanol al 100%.
- Dejar en hielo durante 5 minutos y luego girar a 13.000 rpm durante 30 min a 4 ° C.
- Lavar el ADN con etanol al 70%, permiten secar al aire y volver a suspender en 200 l de TE.
- Se incuba a 65 ° C durante 10 minutos y luego se van por 2 días a temperatura ambiente.
- Almacenar a 4 ° C o largo plazo a -20 ° C.
3) La extracción de RNA
- Retire el medio del plato, lavar con PBS, se añade 1 ml de Trizol y se incuba durante 10 min a temperatura ambiente.
- Raspar las células, una pipeta de transferencia de un par de veces, en un tubo de microcentrífuga y se incuba durante 5 min.
- Girar durante 10 minutos a 10.000 rpm a 4 ° C.
- Transferir el sobrenadante en un tubo nuevo y añadir 200 l de cloroformo.
- Agitar y girar durante 10 minutos a 10.000 rpm a 4 ° C.
- Pasar la fase acuosa en un tubo nuevo y añadir un volumen igual de etanol al 70%.
- Cargue la solución a 1 ó 2 (dependiendo del volumen) y la columna RNeasy spin durante 30 segundos a velocidad máxima.
- A partir de aquí siga las instrucciones del kit RNeasy (Qiagen).
4) Preparación de muestras de ácidos nucleicos
- Cuantificar el ADN y la concentración de ARN utilizando un espectrofotómetro NanoDrop (Thermo Scientific).
- Preparar cDNA a partir de 500-1000 ng de ARN utilizando decámeros azar y superíndice III de la transcriptasa inversa (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
5) Ensayo de PCR y la extensión de los iniciadores
- Diseño de dos pares de cebadores de PCR para cada uno de los marcadores de ADN, un par de amplificación de ADN genómico y el otro par para la amplificación de cDNA (Fig. 2). Lugar de avance y retroceso de imprimación para la amplificación de cDNA en diferentes exones para evitar la contaminación genómica. Diseño de la cartilla para obtener un producto de PCR en el rango de 100-500 pb de longitud.
- Prepare una reacción de 10 l PCR incluyendo 0,5 U Taq Immolase (Bioline) 0,8 mM dNTPs, 2 mM MgCl 2, 0,2 M de cada cebador y 20 ng de cualquiera de cDNA o DNA. Amplificar cada muestra en cuatro reacciones independientes.
- Ejecutar la reacción de PCR en las condiciones optimizadas para cada primer par mantener el número de ciclo en la fase lineal de amplificación.
- Eliminar cebador de PCR y el exceso de dNTPs incubando el producto de PCR con exonucleasa I y fosfatasa alcalina del camarón (SAP) a 37 ° C durante 20 minutos.
- Lugar de cada producto de PCR dos veces en una placa de 384 pozos, de manera que las mediciones de 8 estará disponible para cada muestra.
- Diseño de la cartilla de extensión con el diseño del ensayo (Sequenom) de software para que el mismo cebador se puede utilizar para los productos de PCR tanto genómico y cDNA. Especificar la duración de imprimación en el rango de 14 a 18 pb y la mezcla de extensión, incluyendo las combinaciones de 3ddNTPs (Fig. 2).
- Llevar a cabo la reacción de extensión del cebador y el análisis MALDI-TOF/MS utilizando el sistema de MassARRAY (Sequenom) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Una reacción de extensión del cebador típicos son un paso inicial a 94 ° C durante 2 minutos, seguido por 40 ciclos de 94 ° C durante 5 s, 52 ° C durante 5 s, y 72 ° C durante 5 s.
- Los productos de extensión del cebador se limpian con resina SpectroCLEAN y se transfirió a los microarrays (chips) por SpectroPOINT dispensador nanolitre.
- Los oligonucleótidos extendidas son cuantificados por MALDI-TOF utilizando un espectrómetro de masas SpectroREADER.
6) Análisis estadístico
- Comprobar los resultados con el software MALDI-TOF/MS Typer MassARRAY de la calidad general de la prueba.
- Extracto del informe Allelotyping que incluye los datos del área del pico.
- Para cada individuo calcular el espectro derelación entre el área del pico del alelo 1 y alelo 2 (relación de área de pico).
- Para cada muestra de cDNA derivar un área promedio de relación de pico y la desviación estándar, usando la función correspondiente en Excel, a través de los 8 mediciones.
- Derivar la misma proporción media del área del pico a través de los 8 Medicion de ADN genómico.
- Divida la proporción media de ADNc por la relación genómica significa para evaluar la desviación a la espera una proporción de 1:1.
7) Control Experimental
- Para descartar artefactos experimentales, repetir el experimento por lo menos tres veces.
- Siempre que sea posible, los ensayos de diseño de marcadores de ADN adicional.
- Diseño de múltiples pares de cebadores de PCR y cebadores de extensión de líneas de recocido hacia adelante y hacia atrás.
- Siempre que sea posible prueba como negativos los controles de líneas celulares que son heterocigotos para los marcadores de ADN, pero no llevan el ADN de variantes de riesgo asociados con el fenotipo (Fig. 1 y Fig. 3).
8) Los resultados representativos
Un ejemplo de alelo específico de análisis de la expresión se muestra en la Figura 3 con ejemplos de trazas de espectrometría de masas. La figura muestra los resultados del análisis de cuatro alelo-específicas de los productos de extensión del cebador llevó a cabo el 4 de diferentes plantillas. Los gráficos de arriba representan los resultados obtenidos del análisis de ADN genómico de dos líneas celulares diferentes, que son heterocigotos para un polimorfismo transcrito de codificación. Sin embargo, sólo una línea celular es heterocigota para la variante de ADN de riesgo (Figura 1). Las gráficas inferiores representan los resultados obtenidos del análisis de la cDNA generada a partir de las mismas líneas celulares. Como resultado de artefacto experimental el primer pico es siempre mayor que el segundo pico, incluso en el análisis genómico. Por lo tanto, los resultados de los análisis genómico se utilizan para normalizar los datos de cDNA. Después de la normalización, la proporción de alelos es significativamente diferente de 1 en la línea celular A (donde aparece el segundo pico más bajo en comparación con los espectros de otros), mientras que es muy cercano a 1 en la línea celular B. Los datos sugieren que la línea celular A lleva a bordo un variante de ADN, en fase con el alelo medido por el segundo pico, lo que reduce la expresión del gen analizado. Línea de células B ofrece un control negativo muy conveniente.
Figura 1. La línea celular estrategia de selección. Las líneas celulares A y B son heterocigotos para un marcador transcrito de codificación (triángulo), pero sólo una línea celular es heterocigota para la variante de riesgo del ADN (círculo). El alelo azul de la variante de riesgo está asociado (ya sea con un efecto directo o porque en estrecha correlación con la variante funcional actual) con un menor nivel de la transcripción.
Figura 2. Alelo específico de ensayo de extensión del cebador. Esta figura muestra el flujo de trabajo del procedimiento experimental realizado para los dos ADNc (izquierda) y genómica (derecha) plantillas. PCR (rectángulos grises) están diseñados para amplificar un polimorfismo heterocigota de codificación (triángulo). Para evitar la contaminación genómica PCR primers recocido secuencias colocados en diferentes exones (barras azules) cuando la amplificación se lleva a cabo en la plantilla de cDNA. El producto de PCR se utiliza como plantilla para una reacción de extensión del cebador llevado a cabo con una cartilla de extensión, recocido una base junto al polimorfismo, y la combinación adecuada de tres didesoxinucleótidos (ddNTPs) terminadores (cuadrados) y una desoxinucleótidos (círculo) se extienden a la imprimación de una o dos bases, respectivamente. Los productos resultantes de imprimación extensión tienen masas diferentes, que permiten la separación y cuantificación por espectrometría de masa MALDI-TOF. La cantidad de producto correspondiente al alelo azul del marcador de ADN es relativamente menor que el alelo rojo.
Figura 3. Los resultados de un alelo específico de ensayo de expresión. La figura muestra los resultados de la espectrometría de masas a partir del análisis llevado a cabo en el ADN genómico y el cDNA de la línea celular A y la línea de células B (Figura 1).
Discussion
Este método permite la evaluación del efecto de las enfermedades asociadas a las variantes de ADN en la expresión génica mediante la evaluación en el alelo-específicas vivo diferencia en el nivel de transcripción. En este protocolo la abundancia de transcripción relativa se mide por MALDI-TOF, pero otras tecnologías que permite la cuantificación alelo-específicas, tales como TaqMan 6,7, se puede utilizar. La principal limitación de este enfoque es la disponibilidad de transcribir los marcadores de codificación. Los métodos basados en el principio descrito aquí, pero aprovechando las diferentes clases de polimorfismos, se han descrito. El ensayo haploChip medidas alelo específico de expresión utilizando los marcadores situados en 1 kb del inicio de la transcripción o en el sitio final de un gen que estaría presente en el material de la cromatina immunoprecipitated aisladas con anticuerpos específicos para la ARN polimerasa II 8. Por otra parte, SNPs intrónicas se puede utilizar cuando la plantilla es heteronuclear ARN 9.
El protocolo específico descrito aquí, en combinación con el ensayo haploChip, se ha utilizado con éxito para identificar un gen candidato para la dislexia (o discapacidad de lectura). Inicialmente, un estudio de asociación genética identifica una secuencia de ADN asociados a la dislexia y que abarca tres genes 10. El alelo-específicas de ensayo de la expresión de genes mostró que en la presencia de la dislexia asociada a la variación de expresión de ADN variantes se observó en sólo uno de los tres genes, pero no los otros dos 11.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por el Wellcome Trust a través de subvenciones a la APM [076566/Z/05/Z], JCK [074.318] y un premio principal del Centro Wellcome Trust de Genética Humana [075491/Z/04].Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | Sigma-Aldrich | P-4417-100TAB | |
| SDS | Bio-Rad | 161-0416 | |
| NaCl | VWR international | 27788.366 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503-1KG | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134-500G | |
| RNase A | Qiagen | 19101 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308-500MG | |
| Phenol: chloroform | Sigma-Aldrich | 77617 | |
| Chloroform | VWR international | 100777C | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 32221-2.5L | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| RNeasy kit | Qiagen | 74104 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18080-044 | |
| Immolase Taq | Bioline | BIO-21048 | |
| dNTP | Sigma-Aldrich | DNTP100A | |
| Exonuclease 1 | New England Biolabs | M0293S | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase | GE Healthcare | E70092Z | |
| SpectroCLEAN resin | Sequenom | 10053 | |
| MassEXTEND ddNTP/dNTP mix | Sequenom | Varies according to assay design | |
| MassEXTEND thermosequenase | Sequenom | 10052 | |
| Equipment | |||
| Chilled microcentrifuge | Eppendorf | ||
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| SpectroPOINT nanolitre dispenser | Sequenom | ||
| SpectroREADER mass spectrometer | Sequenom |
References
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