Summary
Genetiska föreningar är ofta oförklarlig på en funktionell nivå. Denna metod syftar till att bedöma effekten av fenotyp associerad genetiska markörer på genuttryck genom att analysera celler heterozygot för transkriberas SNP. Tekniken möjliggör exakta mätningar av MALDI-TOF masspektrometri för att kvantifiera allel-specifika produkter primer förlängning.
Abstract
Antalet signifikanta genetiska samband med gemensamma komplexa egenskaper ökar hela tiden. Emellertid har de flesta av dessa föreningar inte förstod på molekylär nivå. En av de mekanismer som förmedlar effekten av DNA-varianter på fenotyper är genuttryck, som har visat sig vara särskilt relevanta för komplexa egenskaper 1.
Denna metod tester i en cellulär sammanhang effekten av specifika DNA-sekvenser på genuttryck. Principen är att mäta den relativa förekomsten av avskrifter till följd av två alleler av en gen, analysera celler som bär en kopia av DNA-sekvenser i samband med sjukdom (risken varianterna) 2,3. Därför bör de celler som används för denna metod uppfylla två grundläggande genotypisk krav: de måste heterozygot för både varianterna DNA risk och för DNA-markörer, typiskt kodning polymorfismer, som kan skilja utskrifterna baserat på deras kromosomala ursprung (figur 1). DNA-risk varianter och markörer DNA behöver inte ha samma allelen frekvens men fasen (haplotypic) Förhållandet mellan genetiska markörer måste förstås. Det är också viktigt att välja celltyper som uttrycker genen av intresse. Det här protokollet hänvisas särskilt till det förfarande som antagits för att extrahera nukleinsyror från fibroblaster men metoden är lika tillämpliga på andra celler typer inklusive primära celler.
DNA och RNA extraheras från utvalda cellinjer och cDNA genereras. DNA och cDNA analyseras med en primer förlängning analys, som avser att rikta kodande DNA-markörer 4. Primern förlängning analysen utförs med MassARRAY (Sequenom) 5-plattform enligt tillverkarens specifikationer. Primer förlängning produkter analyseras sedan av matris-assisterad laser desorption / jonisering tid för flygning masspektrometri (MALDI-TOF/MS). Eftersom de utvalda markörerna är heterozygota de kommer att generera två toppar på MS-profiler. Området för varje topp är proportionell mot avskriften överflöd och kan mätas med en funktion av MassARRAY Typer programvara för att generera en allela förhållande (allelen 1: allel 2) beräkning. Den allela förhållandet som erhålls för cDNA normaliseras med hjälp av att mätt från genomiska DNA, där allela förhållandet förväntas vara 1:1 för att korrigera för tekniska artefakter. Markörer med en normaliserad allela förhållande väsentligt annorlunda än 1 tyder på att mängden utskrift genereras från de två kromosomer i samma cell är annorlunda, vilket tyder på att DNA-varianter i samband med fenotyp har en effekt på genuttryck. Experimentell kontroller bör användas för att bekräfta resultaten.
Protocol
1) Cell Culture
- Välj celltyper uttrycker genen av intresse.
- Välj cellinjer heterozygot för både varianterna DNA risk och transkriberade kodning polymorfism i genen av intresse (Figur 1).
- Kultur valda cellinjer enligt leverantörens specifikationer och förbereda 2 x 10 cm petriskålar för DNA-och RNA-extraktion respektive.
- När celler når 80% sammanflödet börjar det förfarande som skördar celler och isolera DNA och RNA antingen efter den procedur som beskrivs nedan eller med hjälp av kommersiellt tillgängliga kit.
2) DNA-extraktion
- Ta bort materialet från skålen, tvätta med PBS och tillsätt till skålen 500 mikroliter av en lys-lösning (0,6% SDS, 100 mM NaCl, 50 mM Tris, 20 mM EDTA och 50 mikrogram / ml RNas A).
- Rock plattan försiktigt i 20 minuter vid rumstemperatur.
- Skrapa cellen lysat till ett mikrocentrifugrör och inkubera vid 37 ° C över natten.
- Lägg proteinas K till en slutlig koncentration av 100 mikrogram / ml och inkubera vid 37 ° C över natten.
- Extrahera DNA med en lika stor volym av fenol-kloroform pH 8, repetera, sedan ta med en lika stor volym kloroform / Isoamyl alkohol.
- Fällning DNA med 1 / 10: e volym 3 M NaCl och 2,5 volymer av 100% etanol.
- Lämna på is i 5 min och sedan snurra på 13.000 rpm i 30 minuter vid 4 ° C.
- Tvätta DNA med 70% etanol, låt lufttorka och återsuspendera i 200 mikroliter av TE.
- Inkubera vid 65 ° C i 10 min och sedan lämna i 2 dagar i rumstemperatur.
- Förvaras vid 4 ° C eller lång sikt vid -20 ° C.
3) RNA-extraktion
- Ta bort materialet från skålen, tvätta med PBS, tillsätt 1 ml TRIzol och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur.
- Skrapa celler, pipett ett par gånger, överföring i ett mikrocentrifugrör och inkubera i 5 minuter.
- Spin i 10 min vid 10.000 rpm vid 4 ° C.
- Överför supernatanten i en fräsch rör och tillsätt 200 mikroliter av kloroform.
- Skaka och snurra i 10 min vid 10.000 rpm vid 4 ° C.
- Överför vattenfasen i en fräsch rör och tillsätt en lika stor volym av 70% etanol.
- Ladda lösningen på 1 eller 2 (beroende på volym) RNeasy kolumn och snurra i 30 sekunder med maximal hastighet.
- Härifrån följer instruktionerna i RNeasy kit (Qiagen).
4) nukleinsyra Provberedning
- Kvantifiera DNA och RNA-koncentrationen med en NanoDrop Spektrofotometer (Thermo Scientific).
- Förbered cDNA from 500-1000 ng av RNA med slumpmässiga decamers och upphöjd III omvänt transkriptas (Invitrogen) enligt tillverkarens anvisningar.
5) PCR och Primer Extension-analys
- Design två par PCR för varje DNA-markör, ett par för genomisk DNA-amplifiering och det andra paret för cDNA förstärkning (Fig. 2). Placera framåt och bakåt primer för cDNA förstärkning i olika exoner för att undvika genomiska kontamination. Design primer för att få en PCR-produkt i intervallet 100-500 bp längd.
- Förbered en 10 mikroliter PCR-reaktionen, inklusive 0,5 U Immolase Taq (Bioline) 0,8 mM dNTPs, 2 mM MgCl 2, 0,2 M varje grundfärg och 20 ng av antingen cDNA eller DNA. Förstärk varje prov i fyra självständiga reaktioner.
- Kör PCR-reaktionen på de villkor som optimeras för varje primer par hålla cykeln nummer i linjär fas av förstärkning.
- Ta bort PCR primer och dNTPs överskott genom inkubering av PCR-produkten med exonuclease jag och räkor alkaliskt fosfatas (SAP) vid 37 ° C i 20 minuter.
- Spot varje PCR-produkt två gånger på en 384-brunnar, så att 8 mätningar kommer att vara tillgängliga för varje prov.
- Design förlängningen primer med analysen Design (Sequenom) programvara så att samma grundfärg kan användas för både genetiska och cDNA PCR-produkter. Ange primer längd i intervallet 14-18 räntepunkter och utbyggnad blandning inklusive kombinationer av 3ddNTPs (Fig. 2).
- Utför reaktionen primer förlängning och MALDI-TOF/MS analys med hjälp av MassARRAY systemet (Sequenom) enligt tillverkarens anvisningar.
- En typisk primer förlängning reaktion inbegriper start steg vid 94 ° C i 2 min, följt av 40 cykler på 94 ° C under 5 s, 52 ° C för 5 S och 72 ° C under 5 s.
- Grundfärgen förlängningen produkterna rengörs med SpectroCLEAN harts och överförs på microarray (chip) genom SpectroPOINT nanolitre dispenser.
- Den utökade oligonukleotider kvantifieras av MALDI-TOF med en SpectroREADER masspektrometer.
6) Statistisk analys
- Kontrollera MALDI-TOF/MS resultat med MassARRAY Typer programvara för allmänna kvalitet experimentet.
- Extrahera Allelotyping rapport som skall innehålla den topp som data.
- För varje spektrum beräknaförhållandet mellan topparean av allel 1 och allelen 2 (toppyta ratio).
- För varje cDNA prov härleda en topp betyder areaförhållandet och standardavvikelse med hjälp av motsvarande funktion i Excel, över 8 mätningar.
- Härled samma medelvärde förhållandet toppyta över 8 mätningarna för genomisk DNA.
- Dela cDNA Genomsnittlig kvot av genomiska Genomsnittlig kvot för att bedöma avvikelsen till den förväntade förhållandet 1:1.
7) Experimentell Controls
- För att utesluta experimentella artefakter, upprepa experimentet minst tre gånger.
- När det är möjligt utforma tester för ytterligare DNA-markörer.
- Design flera PCR primerpar och grundfärger förlängning glödgning både framåt och bakåt trådar.
- Om möjligt testa som negativa kontroller cellinjer som är heterozygota för DNA-markörer men inte bär varianter DNA riskerna med fenotypen (Fig. 1 och fig. 3).
8) representativa resultat
Ett exempel på allel-specifika uttryck analysen visas i figur 3 med exempel på masspektrometri spår. Figuren visar resultaten från analysen av 4 allel-specifika produkter primer förlängning utförs på 4 olika mallar. Den översta diagrammen representerar resultaten från analysen av arvsmassans DNA i två olika cellinjer, som båda är heterozygota för ett transkriberat kodning polymorfism. Det är dock bara cellinje A är heterozygot för risken DNA-variant (Figur 1). Den nedre diagrammen representerar resultaten från analysen av det cDNA som genereras från samma cell linjer. Som ett resultat av experimentella artefakt den första toppen är alltid högre än den andra toppen även i de genomiska analysen. Därför är resultaten från den genomiska analyser används för att normalisera cDNA data. Efter normalisering är allelen förhållandet avsevärt skiljer sig från en i cell linje A (där den andra toppen verkar lägre jämfört med de andra spektra), medan det är mycket nära 1 i cell linje B. De uppgifter som tyder på att cellinje A bär en DNA-variant, i fas med allelen mäts med den andra toppen, vilket minskar uttrycket av genen som analyseras. Cellinje B ger en mycket bekväm negativ kontroll.
Figur 1. Cell linjeval strategi. Cellinjer A och B är heterozygot för ett transkriberat kodning markör (triangel) men bara cellinje A är heterozygot för risk DNA-variant (cirkel). Den blå allelen av risken varianten är förknippad (antingen med en direkt effekt eller för att i nära samband med den faktiska funktionell variant) med en lägre nivå av transkription.
Figur 2. Allelspecifik primer förlängning analys. Denna siffra visar arbets-flöde av den experimentella procedur genomförs för både cDNA (vänster) och genomisk DNA (höger) mallar. PCR-primers (grå rektanglar) är utformade för att förstärka en heterozygot kodning polymorfism (triangel). För att undvika genomiska kontamination PCR glödga sekvenser placeras i olika exoner (ljusblå staplar) när förstärkningen sker på cDNA mall. PCR-produkten används sedan som mall för en primer förlängning reaktion utförs med en förlängning primer, glödgning en bas intill polymorfism, och en lämplig blandning av tre dideoxynucleotide (ddNTPs) termineringarna (torg) och en deoxinukleotidtrifosfater (cirkel) för att utöka grundfärgen av en eller två bas respektive. Den resulterande primer förlängning produkter har olika massor som tillåter separation och kvantifiering av MALDI-TOF masspektrometri. Den mängd av produkten som motsvarar den blå allelen i DNA-markör är relativt lägre till den röda allelen.
Figur 3. Resultat av en allel-specifika uttryck analysen. Siffran visar masspektrometri resultaten från den analys som utförts på arvsmassans DNA och cDNA i cellinje A och cellinje B (figur 1).
Discussion
Denna metod möjliggör utvärdering av effekten av sjukdomar förknippade DNA-varianter på genuttryck genom att bedöma in vivo allelspecifik skillnad i avskrift nivå. I detta protokoll relativa avskrift överflöd mäts med MALDI-TOF, men andra tekniker gör allelspecifik kvantifiering, såsom TaqMan 6,7, kan användas. Den största begränsningen av denna metod är att det finns transkriberade kodning markörerna. Metoder som bygger på den princip som beskrivs här, men att dra nytta av olika klasser av polymorfismer, har beskrivits. Den haploChip analys mäter allelspecifik uttryck med hjälp av markörer ligger inom 1 kB för transkriptionell början eller slutet platsen för en gen som skulle vara närvarande i kromatin immunoprecipitated material som isoleras med antikroppar som är specifika för RNA-polymeras II 8. Alternativt kan intronic SNP användas när mallen heteronukleär RNA 9.
De specifika protokoll som beskrivs här, i kombination med haploChip analysen har använts framgångsrikt för att identifiera en kandidat gen för dyslexi (eller läs-och skrivsvårigheter). Inledningsvis en genetisk förening studie identifierat en DNA-sekvens i samband med dyslexi och som spänner över tre gener 10. Den allelspecifik genuttryck-test visade att i närvaro av dyslexi-associerade DNA-varianter uttryck variation observerades för endast en av tre gener, men inte de andra två 11.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats av Wellcome Trust genom bidrag till APM [076566/Z/05/Z], JCK [074.318] och en kärna utmärkelse till Wellcome Trust Centre for Human Genetics [075491/Z/04].Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | Sigma-Aldrich | P-4417-100TAB | |
| SDS | Bio-Rad | 161-0416 | |
| NaCl | VWR international | 27788.366 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503-1KG | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134-500G | |
| RNase A | Qiagen | 19101 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308-500MG | |
| Phenol: chloroform | Sigma-Aldrich | 77617 | |
| Chloroform | VWR international | 100777C | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 32221-2.5L | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| RNeasy kit | Qiagen | 74104 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18080-044 | |
| Immolase Taq | Bioline | BIO-21048 | |
| dNTP | Sigma-Aldrich | DNTP100A | |
| Exonuclease 1 | New England Biolabs | M0293S | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase | GE Healthcare | E70092Z | |
| SpectroCLEAN resin | Sequenom | 10053 | |
| MassEXTEND ddNTP/dNTP mix | Sequenom | Varies according to assay design | |
| MassEXTEND thermosequenase | Sequenom | 10052 | |
| Equipment | |||
| Chilled microcentrifuge | Eppendorf | ||
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| SpectroPOINT nanolitre dispenser | Sequenom | ||
| SpectroREADER mass spectrometer | Sequenom |
References
- Cookson, W., Liang, L., Abecasis, G., Moffatt, M., Lathrop, M. Mapping complex disease traits with global gene expression. Nat Rev Genet. 10, 184-194 (2009).
- Singer-Sam, J., LeBon, J. M., Dai, A., Riggs, A. D. A sensitive, quantitative assay for measurement of allele-specific transcripts differing by a single nucleotide. PCR Methods Appl. 1, 160-163 (1992).
- Yan, H., Yuan, W., Velculescu, V. E., Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Allelic variation in human gene expression. Science. 297, 1143-11 (2002).
- Ding, C., Cantor, C. R. A high-throughput gene expression analysis technique using competitive PCR and matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight MS. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 3059-3064 (2003).
- Gabriel, S., Ziaugra, L. SNP genotyping using Sequenom MassARRAY 7K platform. Curr Protoc Hum Genet Chapter. Chapter 2 (Unit 2), 12-12 (2004).
- Lo, H. S. Allelic variation in gene expression is common in the human genome. Genome Res. 13 (8), 1855-1862 (2003).
- Liu, X. Expression-based discovery of variation in the human glutathione S-transferase M3 promoter and functional analysis in a glioma cell line using allele-specific chromatin immunoprecipitation. Cancer Res. 65, 99-104 (2005).
- Knight, J. C., Keating, B. J., Rockett, K. A., Kwiatkowski, D. P. In vivo characterization of regulatory polymorphisms by allele-specific quantification of RNA polymerase loading. Nat Genet. 33 (4), 469-475 (2003).
- Pastinen, T. A survey of genetic and epigenetic variation affecting human gene expression. Physiol Genomics. 16 (2), 184-193 (2004).
- Francks, C. A 77-kilobase region of chromosome 6p22.2 is associated with dyslexia in families from the United Kingdom and from the United States. Am J Hum Genet. 75 (6), 1046-1058 (2004).
- Paracchini, S. The chromosome 6p22 haplotype associated with dyslexia reduces the expression of KIAA0319, a novel gene involved in neuronal migration. Hum Mol Genet. 15 (10), 1659-1666 (2006).
