Summary
نحن لشرح كيفية تنفيذ أسلوب الصيدلة السلوكية في تكييف نموذج الشمية ترغبي في نحل العسل (أبيس mellifera) عن طريق التطبيق المنهجي للمخدرات. هذا الأسلوب يسمح التحقيق في آليات التعلم وتكوين الذاكرة الكامنة في طريقة بسيطة وموثوق بها.
Abstract
ومن المعروف جيدا نحل العسل (أبيس mellifera) للاتصالات ومهاراتهم والتوجه لعروضه الرائعة التعلم 1،2 القدرة. لأن بقاء مستعمرة نحل العسل تعتمد على استغلال مصادر الغذاء ، والنحل ، تعلم وحفظ المؤن مواقع زهرة متغير فضلا عن ربحيتها. ويمكن بسهولة تدريب النحل المؤن في البيئات الطبيعية حيث العلف في موقع التغذية وتعلم الإشارات ذات الصلة مثل رائحة أو لون. ويمكن أيضا التعلم النقابي مشهي دراستها في ظل ظروف متحكم بها في المعمل عن طريق تكييف الاستجابة ملحق خرطوم (PER) من نحل العسل تسخيرها بشكل فردي 3،4. هذا النموذج يمكن تعلم ودراسة الآليات الجزيئية والخلايا العصبية التي تكمن وراء التعلم والذاكرة في تشكيل وسيلة بسيطة وموثوق بها للغاية 12/05. ويستخدم نهج الصيدلة السلوكية لدراسة الآليات الجزيئية. يتم حقن المخدرات بشكل منتظم في التدخل مع وظيفة جزيئات محددة أثناء أو بعد التعلم وتكوين الذاكرة 13-16.
نحن هنا لشرح كيفية تسخيرها في تدريب النحل على تكييف الواحد وكيفية تطبيق الأدوية بشكل منتظم عن طريق الحقن في عضلة طيران النحل.
Protocol
1. اصطياد النحل من الخلية
- قبل يوم واحد تبدأ التجربة ، ما بين 2 و 4 مساء ، واشتعلت النحل يترك الخلية. للقيام بذلك ، والأشعة فوق البنفسجية الهرم شبكي منفذة للضوء (ارتفاع = 30 سم ، وقمة 3،5 × 3 ، 5 سم ، وقاعدة 18 × 18 سم) هو عقد ، وهو في ذروة محكمة السد والقاعدة ، في 20 -- أغلقت مسافة 30 سم امام مدخل الخلية مع فتح قاعدة وقمة والنحل بحيث يترك خلية إدخال قاعدة الهرم. ثم يتم إغلاق القاعدة ويتم إحضارها إلى القبض على النحل في المختبر لمزيد من المعالجة.
2. نقل النحل من الهرم في قوارير الزجاج
- في المختبر ، ويتم وضع الهرم على قاعدته. هي مظلمة جدران الهرم (على سبيل المثال مع منشفة) ، ولكن يتم ترك كشفت قمة. بسبب انجذاب ضوئي الإيجابية ، وسوف يغادر النحل من خلال قمة الهرم عند فتحه. واحدا تلو الآخر ، يتم نقل النحل من الهرم في قوارير الزجاج من خلال عقد قارورة خلال قمة مفتوحة. ويستخدم واحد لكل قنينة النحل. لذلك ، يتم إغلاق قمة عند واحد يدخل النحل القارورة.
3. النحل في تسخير أنابيب
- ويجمد النحل عن طريق التبريد لهم في قارورة زجاجية على الجليد ل2،5-3،5 دقيقة. فمن المستحسن لمشاهدة النحل وإزالته من الجليد حالما تتوقف عن التحرك.
- هو تسخير نحلة واحدة ثبتوا في أنبوب بلاستيكي صغير مع شريط لاصق ، بحيث أنها قادرة على التحرك بحرية في خرطوم ولكن ليس في الرأس ، الصدر أو الساقين. من المهم أن لا يتم ضغطها الرقبة.
- يتم وضع كل نحلة ثابتة في أنبوب بلاستيكي في حفرة البئر مرقمة على رف من أجل تحسين المناولة وتحديد الهوية. بعد أن تم إزالته من أجل استردادها أو تكييف الذاكرة دائما يتم إرجاع أنبوب إلى بئر نفسه بالضبط.
4. تغذية النحل
- في الليلة الأولى (4-6 مساء) ، بعد أن اشتعلت ، ويتم تغذية النحل على محلول السكروز مع شبع (0،88 م ، والسكر الأبيض المكرر المنزلية الذائبة في مياه الصنبور). لتغذية النحل ، يتم استخلاصها من خلال لمس PER هوائيات مع حل السكروز ويسمح هذا الحيوان للاستهلاك one الحبرية (4 ميكرولتر) من محلول السكروز. ويتم تغذية النحل واحدا تلو الآخر بشكل متكرر حتى أنها لم تعد تظهر PER سريعة وموثوق بها عندما يتم لمسها هوائيات مع حل السكروز.
- في كل مساء لاحقة (4-6 مساء) من التجربة ويتم تغذية النحل واحدا تلو الآخر أربع مرات مع 1 قطرة من محلول السكروز (4 ميكرولتر ، 0،88 م ، والسكر الأبيض المكرر حلها في مياه الصنبور). من المهم أن لا يشوش على هوائيات حل السكروز النحلة أو خرطوم في أثناء الرضاعة ، وأنه ليست ملوثة أنابيب بمحلول السكروز. لا ينبغي أن يكون الطعام النحل في أو بالقرب من موقع لتكييف يستبعد إمكانية ربط سياق التدريب مع التحفيز السكروز.
5. حفظ النحل مسخر ليلة وضحاها
- يتم الاحتفاظ النحل بين عشية وضحاها في وعاء بلاستيكي في درجة حرارة الغرفة. يتم تعبئة مياه الصنبور في وعاء (حوالي 0،5-1 سم). رفوف توضع مع النحل تسخيرها في وعاء فوق سطح الماء باستخدام لوحات ELISA كمنبر. أخيرا ، يتم تغطية وعاء مع الكرتون.
6. شمي هواء
في صباح الأول (10:00) من التجربة ويتم تكييف الشمية بها. الحافز مكيفة (CS) هو رائحة ، ودون شروط التحفيز (الولايات المتحدة) هو الحل السكروز.
- وpipetted 4 ميكرولتر من رائحة (زيت القرنفل على سبيل المثال) على الورق مرشح الجولة (1،3 سم القطر) التي يتم إدراجها بعد ذلك في 20 مل حقنة. هو pipetted رائحة تحت غطاء محرك السيارة وتستخدم تصفية نصائح لمنع التلوث من ماصة.
- وضعت على الرف مع النحل بالقرب من تسخيرها 30 دقيقة تكييف الموقع قبل إجراء تكييف يبدأ ، ولكن على مسافة من مكان في الجبهة من ماسورة العادم حيث يتم تكييف النحل واحدة
- تكييف يتكون من ثلاثة أزواج من رائحة (الحافز مكيفة ، CS) والحل السكروز (الحافز دون شروط ، الولايات المتحدة ، 1،25 م) مع فاصل بين المحاكمة (ITI) من 10 دقيقة. إشارة صوتية تسليمها الى المجرب عبر لاعب السمعية يضمن التوقيت الدقيق لبدء التحفيز ، يقابلها التحفيز ، ووضع مدة التحفيز. محاكمة اقتناء يبدأ طرح 10 ثانية من هذا الحيوان في الجبهة من العادم. قبل وقت قصير من نهاية 10 ثانية يتم وضع الحقنة التي تحتوي على رائحة 3 سم امام النحل تستهدف هوائيات النحلة. بعد ذلك ، يتم تقديم الرائحة لمدة 5 ثانية ، عن طريق دفع الهواء 20 مليلتر من خلال حقنة. بعد 3 ثوانى الأولى هي لمست سياط البعيدة كل من هوائيات مع السكروز حل رطب مسموح مسواك والحيوانات للعق مسواك moistend لمدة 4 ثوانى. 13 ثانية بعد النحل التحفيز CS ، وينتهي تؤخذ خارج السياق والتدريب ووضع مرة أخرى في الرف. تماما تجربة واحدة للتدريب يدوم 28 ثانية.
من المهم أن لا يتم تغطية النحلة هوائيات للخرطوم ولا مع السكروز بعد تكييف. ولذلك لابد من التأكد من أن ليست سوى مسواك مبلل بمحلول سكروز وأنه لا يوجد شكل قطرات من محلول السكروز على المسواك. - بعد تكييف رفوف توضع في وعاء مرة أخرى.
- سلوك الحيوانات خلال التجربة ، أي وقوع الواحد خلال التنسيب وCS الولايات المتحدة وعرضها ، وأشار إلى رصد وبنسبة المجرب.
7. ذاكرة الاستبقاء
- يمكن إجراء الاختبارات في أي الاحتفاظ الفاصل الزمني (دقيقة إلى أيام). وضعت على الرف مع النحل بالقرب من تكييف 30 دقيقة الموقع قبل بدء اختبار الذاكرة.
- اختبار الذاكرة يتكون من 5 ثوانى CS العرض التقديمي دون الولايات المتحدة. الاختبار يبدأ طرح 10 ثانية من هذا الحيوان في الجبهة من العادم. بعد ذلك ، يتم تقديم الرائحة لمدة 5 ثوانى على النحو المبين أعلاه. سلوك الحيوان ، أي وقوع الواحد خلال التنسيب ويلاحظ العرض CS أسفل أثناء التجربة.
- في نهاية التجربة مرة أخرى استجابة داخلي خرطوم التي تسببها هوائيات لمس بمحلول سكروز للتأكد من أن الحيوان لا يزال قادرا على مد خرطوم به.
8. حقن النظامية
النقطة النظامية وقت الحقن يعتمد على التصميم التجريبي.
- يتم إجراء ثقب صغير في جليدة للجزء الخلفي من الترس بجانب الشق scutal فوق 17 رحلة العضلات باستخدام إبرة تحت الجلد القابل للتصرف (21 م).
- باستخدام أنبوب زجاجي الشعري ، يتم حقن محلول 1 ميكرولتر من خلال ثقب في جليدة في عضلة الرحلة. المجربون مدربة قادرة على ضخ كل نحلة 30 ثانية ، مما يسمح للتوقيت الدقيق للحقن وتكييف.
9. تغذية النحل خلال التجربة
- في مساء يوم (4-6 مساء) بعد تكييف ، ويتم تغذية النحل واحدا تلو الآخر أربع مرات مع 1 قطرة من محلول السكروز (4 ميكرولتر ، 0،88 م ، والسكر الأبيض المكرر الذائبة في مياه الصنبور). من المهم أن لا يشوش على هوائيات حل السكروز النحلة أو خرطوم في أثناء الرضاعة ، وأنه ليست ملوثة أنابيب بمحلول السكروز. لا ينبغي أن يكون الطعام النحل في أو بالقرب من موقع لتكييف يستبعد إمكانية ربط سياق التدريب مع التحفيز السكروز.
10. جمع البيانات وتحليل البيانات
- ويتم رصد حدوث استجابة ملحق خرطوم خلال التجربة. وسجل نحلة إيجابية إذا كان خرطوم يمتد في الفترة ما بين بداية CS وعرض في الولايات المتحدة (أثناء التدريب) أو أثناء العرض CS (خلال مرحلة الاختبار) ، عبور خط الظاهري بين mandibles مفتوحا.
- يجب أن تكون مدرجة في تحليل الحيوانات الوفاء معيارين : يجب أن تنجو من التجربة بأكملها ويجب أن تظهر على تمديد خرطوم دون شروط الاستجابة (PER) السكروز إلى حل في نهاية التجربة. يتم رسم النسبة المئوية من النحل تبين الواحد خلال اقتناء واختبارات الاحتفاظ لكل عرض CS.
11. ممثل النتائج :
يتم تقديم تجربتين هنا.
في التجربة الأولى أن ننظر في أثر حقن النظامية من الفوسفات مخزنة في برنامج تلفزيوني (المالحة ، وفي ملي : 137 كلوريد الصوديوم ، 2،7 بوكل ، 10،1 نا 2 هبو 4 ، 1،8 KH 2 PO 4 ، ودرجة الحموضة 7 ، 2) على التعلم وعلى المدى الطويل تكوين الذاكرة. تعامل مجموعة غير المعالجة ، وهي المجموعة التي تم حقنه مع 1 ميكرولتر 30 دقيقة برنامج تلفزيوني قبل التدريب ، ومجموعة الشام حقن : تم تدريب ثلاث مجموعات من النحل مع الأزواج CS - الامريكية الثلاثة مع فاصل بين محاكمة 10 دقيقة بنفس طريقة حقن مجموعة PBS ولكن من دون حقن PBS. تم اختبار الذاكرة بعد 24 ساعة تدريبية مع تقديم خدمات العملاء واحد في جميع الفئات الثلاث. النسبة المئوية للحيوانات التي تبين استجابة مشروطة خلال تكييف يزيد بشكل كبير عبر محاكمات تدريبية لمدة ثلاثة (Fig.1 ، ANOVA لقياس المتكرر للمرة عامل F 2378 = 340456 ، ف <0،05). ويمكن ملاحظة أي اختلاف في PER بين المجموعات الثلاث خلال تكييف (ANOVA لقياس المتكررة لعامل الجماعات F2 ، 189 = 1299 ، P> 0،05). هذا ينطبق على 24 اختبارا الاحتفاظ ح (F2 ، 187 = 0752 ، P> 0،05) عند المقارنة بين الحيوانات غير المعالجة مع PBS حقن حقن الحيوانات وزائفة.
في التجربة الثانية نبدي تثبيط للاحتفاظ الذاكرة الثلاثة وبعد أربعة أيام من التدريب عندما تم حقن مجموعيا المانع التوليف anisomycin البروتين (10 ملم) و 30 دقيقة بعد التزاوج CS - الامريكية الثلاثة. المقارنة بين جماعة anisomycin حقن مع مجموعة PBS حقن يكشف عن فارق كبير بين المجموعات خلال الاحتفاظ ربتوقيت شرق الولايات المتحدة (Fig.2 ، ANOVA لقياس المتكرر للعامل المجموعة F1 ، 94 = 8،86 ، ف <0،05). ويمكن ملاحظة اختلاف كبير في اختبار الذاكرة في يوم 3 و 4 ايام. هذا يشبه نتائج Wüstenberg آخرون 18 ، الذي اشترط أيضا النحل مع الأزواج CS - الامريكية الثلاثة ، ولكن مع بروتوكول آخر.
الشكل 1. آفة جليدة أو حقن PBS لا يغير اقتناء والاحتفاظ الذاكرة. تم تدريب الحيوانات مع الأزواج CS - الامريكية الثلاثة (اكتساب). بعد 24 ساعة ، واختبار الذاكرة (الاحتفاظ الذاكرة). ثلاثين دقيقة قبل التدريب ، وأدلى حفرة في جليدة للمجموعتين (الآفة ، PBS) وحقن واحدة من هذه المجموعات مع 1 ميكرولتر PBS (PBS). وقد غادرت المجموعة الثالثة سليمة (أي علاج). قدم هو النسبة المئوية للحيوانات لكل مجموعة الاستجابة للعرض مع رائحة PER. وANOVA لا يكشف عن أية فروق ذات دلالة إحصائية بين المجموعتين في مرحلة اكتساب (F2 ، 189 = 1.299 ، P> 0.05) أو في الاحتفاظ الذاكرة (F2 ، 187 = 0.752 ، P> 0.05)
الشكل 2. حقن 40 دقيقة anisomycin بعد الاقتران CS - الولايات المتحدة مشاركة يقلل الاحتفاظ الذاكرة ثلاثة ايام وبعد أربعة أيام من التدريب. الحيوانات وتدرب مع الأزواج CS - الامريكية الثلاثة (شراء) وحقنه مع 1 ميكرولتر anisomycin 10 ملم (التفاوت) أو 1 PBS ميكرولتر 1 ح بعد المحاكمة التدريبية الأولى. وكان اختبار الذاكرة (ذاكرة للاحتفاظ) 24 ساعة ، 48 ساعة و 72 ساعة و 96 ساعة في وقت لاحق. قدم هو النسبة المئوية لكل مجموعة من الحيوانات الاستجابة للعرض مع رائحة PER. حقن anisomycin يؤدي إلى خفض كبير في الذاكرة 72 ح ح 96 استبقاء وبعد التدريب (F1 ، 94 = 8.86 ، P <0.05) كما كشفت من قبل ANOVA.
Discussion
- اصطياد النحل : النحل لجمع العلف ذوي الخبرة ، ويتم القبض النحل إما في الصباح أو في فترة بعد الظهر ، وتجنب وقت النحل الشباب على الطيران التوجه 19. العلافون جمع حبوب اللقاح إما أو الرحيق. وقد لوحظت اختلافات بين حبوب اللقاح والرحيق العلافون وفقا لاستجابة السكر وقدراتهم على التعلم 20. يمكن جمعها من أجل اللحاق العلافون الرحيق فقط ، يمكن تثبيت مصدر الغذاء الاصطناعي مليئة بمحلول سكروز بالقرب من خلية والحيوانات هناك. ويمكن تحديد العلافون اللقاح يعود الى خلية من سلال الطلع على أرجلها الخلفية 20.
- تحديد ومعالجة : يجب تجنب التبريد الممتدة من النحل على الجليد لأنها قد تؤثر على قدرتهم على التعلم والبقاء على قيد الحياة حتى نهاية التجربة. الرصغي يجب أن تكون ثابتة بعناية داخل أنبوب لتفادي التحفيز عرضي بمحلول السكروز. هذا هو المهم ، لأن النحل وقد ثبت أن التعلم عن طريق تحفيز الرصغي مع الحل succrose 3،21.
- تكييف الشمية : عدد المحاكمات هواء ، ويمكن تغيير الفاصل الزمني بين المحاكمة ، ونقطة اختبار الوقت اعتمادا على التركيز في الدراسة 3،22.
- التغذية : من المعروف أن مستوى شبع من النحل يؤثر على أدائها التعلم والذاكرة الاحتفاظ 3،23. هذا يجب أن يؤخذ في الاعتبار عند التخطيط للتجارب.
- الحقن : توجد الحويصلات الهوائية في الصدر 17 النحل. هذه الأجزاء الحيوية في الجهاز التنفسي ضرورية للبقاء على قيد الحياة. وبالتالي يجب أن الحرص على عدم الاضرار الحويصلات الهوائية خلال الحقن. الافراج عن فقاعات الهواء إلى الأضرار التي لحقت الحويصلات الهوائية.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من خلال منحة من الوزارة الاتحادية الألمانية للتعليم والبحوث (BMBF) داخل التركيز بيرنشتاين : أسس التعلم الخلايا العصبية (BFNL) لDE نشكر راندولف منزل للتعليق على قيمة إصدار سابق من المخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Syringe Omnifix 20 ml | B. Braun Medical | 4616200 V | |
| White refined household sugar | Kaisers Supermarket, Berlin, Germany | ||
| Clove oil | Bombastus, Freital, Germany | ||
| Multipette plus | Eppendorf | 4981 000.019 | |
| Rack for 30 bee tubes | Home made | ||
| Plastic tubes | Home made | ||
| UV light-permeable plexiglass pyramid | Home made | height = 30cm,apex 3.5 x 3.5cm,base 18x18cm | |
| Sticky tape | Tesa, Hamburg, Germany | ||
| Capillator sticks 1-5μl | Selzer | ||
| Capillator tips 1-5μl | Selzer | ||
| Filter paper 0.16-0.2 mm thick | Macherey-Nagel | MN 616 or MN615 | Adjusted to circular pieces with a 1.3 cm diameter |
| Disposable hypodermic needle | B. Braun Medical | 4657683 | 0.45 mm diameter |
References
- Menzel, R., Giurfa, M. Cognitive architecture of a mini-brain: the honeybee. Trends Cogn Sci. 5, 62-71 (2001).
- Menzel, R., Leboulle, G., Eisenhardt, D. Small brains, bright minds. Cell. 124, 237-239 (2006).
- Menzel, R. Neurobiology of comparative cognition. Kesner, R. P., Olton, D. S. , Lawrence Erlbaum Associates Publishers. Hillsday, New Jersey, Hove, London. (1990).
- Bitterman, M. E., Menzel, R., Fietz, A., Schafer, S. Classical-Conditioning of Proboscis Extension in Honeybees (Apis-Mellifera). J. Comp. Psyc. 97, 107-119 (1983).
- Menzel, R., Muller, U. Learning and memory in honeybees: from behavior to neural substrates. Annu. Rev. Neurosci. 19, 379-404 (1996).
- Menzel, R. Memory dynamics in the honeybee. Journal of Comparative Physiology A-Neuroethology Sensory Neural and Behavioral Physiology. 185, 323-340 (1999).
- Menzel, R. Searching for the memory trace in a mini-brain, the honeybee. Learn. Mem. 8, 53-62 (2001).
- Eisenhardt, D. Learning and memory formation in the honeybee (Apis mellifera) and its dependency on the cAMP-protein kinase A pathway. Animal Biology. 56, 259-278 (2006).
- Hourcade, B., Muenz, T. S., Sandoz, J. C., Rossler, W., Devaud, J. M. Long-term memory leads to synaptic reorganization in the mushroom bodies: a memory trace in the insect brain. J. Neurosci. 30, 6461-6465 (2010).
- Denker, M., Finke, R., Schaupp, F., Grun, S., Menzel, R. Neural correlates of odor learning in the honeybee antennal lobe. Eur. J. Neurosci. 31, 119-133 (2010).
- Szyszka, P., Galkin, A., Menzel, R. Associative and non-associative plasticity in kenyon cells of the honeybee mushroom body. Front Syst. Neurosci. 2, 3-3 (2008).
- Okada, R., Rybak, J., Manz, G., Menzel, R. Learning-related plasticity in PE1 and other mushroom body-extrinsic neurons in the honeybee brain. J. Neurosci. 27, 11736-11747 (2007).
- Muller, U. Prolonged activation of cAMP-dependent protein kinase during conditioning induces long-term memory in honeybees. Neuron. 27, 159-168 (2000).
- Locatelli, F., Bundrock, G., Muller, U. Focal and temporal release of glutamate in the mushroom bodies improves olfactory memory in Apis mellifera. J. Neurosci. 25, 11614-11618 (2005).
- Stollhoff, N., Menzel, R., Eisenhardt, D. Spontaneous recovery from extinction depends on the reconsolidation of the acquisition memory in an appetitive learning paradigm in the honeybee (Apis mellifera. J. Neurosci. 25, 4485-4492 (2005).
- Stollhoff, N., Eisenhardt, D. Consolidation of an extinction memory depends on the unconditioned stimulus magnitude previously experienced during training. J. Neurosci. 29, 9644-9650 (2009).
- Snodgrass, R. E. Anatomy of the honeybee. , Comstock Publishing Associates. New York. (1956).
- Wustenberg, D., Gerber, B., Menzel, R. Short communication: long- but not medium-term retention of olfactory memories in honeybees is impaired by actinomycin D and anisomycin. Eur. J. Neurosci. 10, 2742-2745 (1998).
- Vollbehr, J. Zur Orientierung junger Honigbienen bei ihrem 1. Orientierungsflug. Zool. Jb. Physiol. 79, 33-69 (1975).
- Scheiner, R., Erber, J., Page, R. E. Tactile learning and the individual evaluation of the reward in honey bees (Apis mellifera L.). J. Comp Physiol [A]. 185, 1-10 (1999).
- Sanchez, B. rito, G, M. Behavioral studies on tarsal gustation in honeybees: sucrose responsiveness and sucrose-mediated olfactory conditioning. J. Comp Physiol A Neuroethol. Sens. Neural Behav. Physiol. 194, 861-869 (2008).
- Menzel, R., Manz, G., Menzel, R., Greggers, U. Massed and spaced learning in honeybees: the role of CS, US, the intertrial interval, and the test interval. Learn. Mem. , 198-208 (2001).
- Friedrich, A., Thomas, U., Muller, U. Learning at different satiation levels reveals parallel functions for the cAMP-protein kinase A cascade in formation of long-term memory. J. Neurosci. 24, 4460-4468 (2004).
