Summary
We laten zien hoe je een gedrags-farmacologie methode te implementeren in een appetitief olfactorische conditionering paradigma in de honingbijen (Apis mellifera) door systemische toediening van drugs. Deze methode maakt het mogelijk onderzoek naar de mechanismen die ten grondslag liggen aan leren en geheugen vorming in een eenvoudige en betrouwbare manier.
Abstract
Honingbijen (Apis mellifera) staan bekend om hun communicatieve vaardigheden en oriëntatie en voor hun indrukwekkende leercapaciteit 1,2. Omdat het voortbestaan van een bijenvolk is afhankelijk van de exploitatie van voedselbronnen, hakselaar bijen te leren en te onthouden variabele bloem sites en hun winstgevendheid. Forager bijen kunnen gemakkelijk worden getraind in een natuurlijke omgeving, waar ze foerageren op een voederplaats en leer de daarmee verband houdende signalen, zoals geur of kleur. Appetitieve associatief leren kan ook worden bestudeerd onder gecontroleerde omstandigheden in het laboratorium door conditionering van de proboscis extensie respons (PER) van individueel benut honingbijen 3,4. Dit leerproces paradigma kan de studie van de neuronale en moleculaire mechanismen die het leren en geheugen vorming ten grondslag liggen op een eenvoudige en uiterst betrouwbare manier 5-12. Een gedragsmatige aanpak farmacologie wordt gebruikt om de moleculaire mechanismen te bestuderen. Drugs zijn systemisch geïnjecteerd met de functie van specifieke moleculen verstoren tijdens of na het leren en het geheugen vorming van 13-16.
Hier laten we zien hoe benut honingbijen trainen in PER conditioning en hoe je drugs toe te passen systematisch door middel van injectie in de spier bij vlucht.
Protocol
1. Het vangen van bijen uit de Hive
- Een dag voor het experiment begint, tussen de 2 en 4 uur, zijn bijen laten de bijenkorf gevangen. Om dit te doen, een UV-licht-doorlatend plexiglas piramide (hoogte = 30 cm, top 3,5 x 3, 5 cm, voet 18 x 18 cm), die afsluitbare aan de top en de basis, wordt gehouden op een 20 - 30 cm afstand in de voorkant van de korf ingang met de voet open en de apex gesloten, zodat de bijen het verlaten van de korf de basis van de piramide in te voeren. De basis is dan gesloten en de gevangen bijen worden gebracht in het laboratorium voor verdere afhandeling.
2. De overdracht van bijen uit de Piramide Into glazen flacons
- In het lab wordt de piramide op zijn basis. De muren van de piramide zijn verduisterd (bijvoorbeeld met een handdoek), maar de top is onbedekt gelaten. Door hun positieve phototaxis, bijen de piramide verlaten via de apex bij het openen. Een voor een zijn bijen overgebracht van de piramide in glazen flesjes door houden de flesjes over de open apex. Een flacon wordt gebruikt per bij. Daarom is de apex gesloten wanneer een bij het flesje komt.
3. Aanwenden Bijen in Tubes
- Bijen worden geïmmobiliseerd door het koelen van hen in de glazen flacons op ijs 2.5-3.5 minuten. Het is raadzaam om de bijen te kijken en te verwijderen van het ijs zodra het stopt met bewegen.
- Een enkele geïmmobiliseerd bij is benut in een klein plastic buisje met plakband, zodat het in staat is om haar proboscis vrij bewegen, maar niet zijn hoofd, borstkas en benen. Het is belangrijk dat de nek niet is gecomprimeerd.
- Elke bee vast in een plastic buisje wordt in een genummerde boorgat op een rek voor een betere behandeling en identificatie. Nadat deze is verwijderd voor het conditioneren of geheugenontsluiting de buis is altijd teruggestuurd naar de exact dezelfde boorgat.
4. Feeding Bijen
- Op de eerste avond (4-6 uur), na te zijn gevangen, zijn bijen gevoerd aan verzadiging met sucrose-oplossing (0,88 M, geraffineerde witte suiker huishouden opgelost in leidingwater). Te voeden een bij, is zijn PER opgewekt door het aanraken van de antenne met sucrose-oplossing en het dier is toegestaan om een druppel (4 pi) van sucrose-oplossing te consumeren. Bijen worden gevoed een na de andere totdat ze niet langer laten een snelle en betrouwbare PER wanneer hun antennes worden aangeraakt met sucrose-oplossing.
- Op elke volgende avond (4-6 uur) van het experiment bijen worden gevoed na elkaar vier keer met een druppel van sucrose-oplossing (4 pi, 0,88 M, witte geraffineerde suiker opgelost in leidingwater). Het is belangrijk dat sucrose oplossing niet wordt uitgesmeerd over antennes van de bijen of de proboscis tijdens het voeden en dat de buizen zijn niet verontreinigd zijn met sucrose-oplossing. Bijen moet niet gevoerd worden op of bij de conditionering website de mogelijkheid te associëren de training context met de sucrose stimulus uit te sluiten.
5. Het houden van bijen ingezet Overnachting
- Bijen worden 's nachts bewaard in een plastic bakje bij kamertemperatuur. Kraanwater is gevuld in de kom (ongeveer 0,5-1 cm hoog). Rekken met de bijen ingezet worden geplaatst in de kom boven de waterlijn met behulp van ELISA-platen als een platform. Tot slot wordt de kom afgedekt met karton.
6. Olfactorische Conditioning
Op de eerste ochtend (10 uur) van het experiment olfactorische conditionering wordt uitgevoerd. De geconditioneerde stimulus (CS) is een geur, de ongeconditioneerde stimulus (US) is sucrose oplossing.
- 4 pi van de geur (bijv. kruidnagel olie) worden gepipetteerd op een ronde papieren filter (1,3 cm diameter), die vervolgens wordt ingebracht in een 20 ml spuit. De geur is gepipetteerd onder een kap en filter tips worden gebruikt om verontreiniging van de pipet te voorkomen.
- Het rek met spande bijen is geplaatst in de buurt de conditionering plaats 30 minuten voor de conditionering procedure start, maar op een afstand naar de plaats voor een uitlaat waar enkele bijen zijn geconditioneerd.
- Conditionering bestaat uit drie paringen van geur (de geconditioneerde stimulus, CS) en sucrose oplossing (de ongeconditioneerde stimulus, de VS, 1,25 M) met een inter-trial interval (ITI) van 10 minuten. Een akoestisch signaal geleverd aan de onderzoeker via een audio-speler zorgt voor de precieze timing van de stimulus onset, stimulus offset, stimulus duur en de plaatsing. Een overname proef begint met een 10 sec plaatsing van het dier in de voorkant van een uitlaat. Kort voor het einde van de 10 sec de spuit met de geur wordt geplaatst 3 cm in de voorkant van de honingbij gericht op antennes van de bij. Vervolgens wordt de geur gepresenteerd voor 5 sec, door op 20 ml lucht door de spuit. Na de eerste 3 sec de distale flagella van beide antennes zijn geraakt met een sucrose oplossing bevochtigd tandenstoker en dieren mogen de moistend tandenstoker voor de 4 sec te likken. 13 sec na de CS stimulatie eindigt, bijen worden uit de opleiding context en teruggeplaatst in het rek. Al met al een training proef duurt 28 sec.
Het is belangrijk dat noch de bij de antenne, noch de proboscis zijn bedekt met sucrose na conditionering. Daarom moet ervoor worden gezorgd dat de tandenstoker alleen bevochtigd met sucrose-oplossing en dat er geen druppels van sucrose oplossing te vormen op de tandenstoker. - Na het conditioneren van de rekken zijn terug geplaatst in de kom.
- De dieren gedrag tijdens het experiment, dat wil zeggen het ontstaan van de PER tijdens de plaatsing en CS en US presentatie, wordt gecontroleerd en genoteerd door de experimentator.
7. Memory Retention
- Behoud tests kunnen worden uitgevoerd op elk interval (min tot dagen). Het rek met bijen is geplaatst in de buurt de conditionering plaats 30 minuten voordat het geheugen test begint.
- Een memory test bestaat uit 5 sec CS presentatie zonder Amerikaanse presentatie. De test begint met een 10 sec plaatsing van het dier in de voorkant van de uitlaat. Vervolgens wordt de geur gepresenteerd voor 5 sec zoals hierboven beschreven. Het gedrag van het dier, dat wil zeggen het ontstaan van de PER tijdens de plaatsing en het CS-presentatie is genoteerd tijdens het experiment.
- Aan het eind van het experiment de proboscis extentie reactie wordt weer opgewekt door het aanraken van de antennes met sucrose oplossing om ervoor te zorgen dat het dier nog steeds in staat is om zijn slurf uit te breiden.
8. Systemische injectie
Het tijdstip van de systemische injectie hangt af van het experimenteel ontwerp.
- Een klein gaatje is gemaakt in de cuticula van het achterste deel van de scutum naast de scutal spleet boven de spier vlucht 17 met behulp van een disposable injectienaald (21 G).
- Met behulp van een glazen capillaire buis, is een pi-oplossing geïnjecteerd door het gat in de cuticula in de vlucht spier. Getrainde onderzoekers zijn in staat om een bij injecteren elke 30 seconden, waardoor een precieze timing van de injectie en conditionering.
9. Bijen voeden tijdens het experiment
- Op de avond (4-6 uur) na deze behandeling, zijn bijen gevoed na elkaar vier keer met een druppel van sucrose-oplossing (4 pi, 0,88 M, witte geraffineerde suiker opgelost in leidingwater). Het is belangrijk dat sucrose oplossing niet wordt uitgesmeerd over antennes van de bijen of de proboscis tijdens het voeden en dat de buizen zijn niet verontreinigd zijn met sucrose-oplossing. Bijen moet niet gevoerd worden op of bij de conditionering website de mogelijkheid te associëren de training context met de sucrose stimulus uit te sluiten.
10. Het verzamelen van gegevens en data-analyse
- Optreden van de proboscis uitbreiding respons tijdens het experiment wordt gecontroleerd. Een bij is gescoord positief indien het strekt zich uit zijn slurf tussen het begin van de CS en de presentatie van de VS (tijdens de training) of tijdens de CS-presentatie (tijdens test fase), het oversteken van een denkbeeldige lijn tussen de geopende kaken.
- Te worden opgenomen in de analyse dieren moet aan twee criteria voldoen: ze moeten het hele experiment te overleven en zij moeten het ongeconditioneerde proboscis extensie respons (PER) te tonen aan sucrose-oplossing aan het einde van het experiment. Het percentage van de bijen met de PER tijdens de verwerving en het behoud tests uitgezet voor elke CS presentatie.
11. Representatieve resultaten:
Twee experimenten worden hier gepresenteerd.
In het eerste experiment kijken we naar de impact van de systemische injectie van fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS; in mm: 137 NaCl, KCl 2,7, 10,1 Na 2 HPO 4, 1,8 KH 2 PO 4, pH 7, 2) op het leren en de lange-termijn geheugen formatie. Drie groepen van bijen werden opgeleid met drie CS-US paringen met een inter-trial interval van 10 min: een niet-behandelde groep, een groep die werd geïnjecteerd met een pL PBS 30 min voor de training, en een nep-geïnjecteerde groep behandelde de op dezelfde manier als de PBS-geïnjecteerde groep, maar zonder het injecteren van PBS. 24 uur na de training het geheugen werd getest met een CS-presentatie in alle drie de groepen. Het percentage van de dieren die de geconditioneerde respons tijdens het conditioneren verhoogt over de drie training trials (Fig.1, ANOVA voor herhaalde metingen voor de factor tijd F 2.378 = 340.456, p <0,05). Geen verschil in PER kon worden waargenomen tussen de drie groepen tijdens het conditioneren (ANOVA voor herhaalde metingen voor de factor groepen F2, 189 = 1.299, p> 0,05). Dit geldt voor een 24 uur retentie-test (F2, 187 = 0.752, p> 0,05) bij het vergelijken van niet-behandelde dieren met PBS-geïnjecteerde en sham-geïnjecteerde dieren.
In het tweede experiment tonen we de remming van het geheugen retentie drie en vier dagen na de training als de eiwitsynthese remmer anisomycin (10 mM) systemisch was 30 minuten geïnjecteerd na drie CS-US paringen. Vergelijking van een anisomycin-geïnjecteerde groep met een PBS-geïnjecteerde groep blijkt dat er een significant verschil tussen de groepen tijdens de retentie test (Fig.2, ANOVA voor herhaalde metingen voor de factor groep F1, 94 = 8,86, p <0,05). Een belangrijk verschil kan worden waargenomen op de memory test op dag 3 en dag 4. Dit lijkt op de resultaten van Wüstenberg et al.. 18, die ook bijen met drie CS-US paringen airconditioning, zij het met een ander protocol.
Figuur 1. Cuticula laesie of injectie van PBS neemt niet weg acquisitie en het geheugen vast te houden. Dieren werden getraind met drie CS-US paringen (overname). Na 24 uur werd het geheugen getest (Memory Retention). Dertig minuten voor de training, was een gat gemaakt in de cuticula van de twee groepen (laesie, PBS) en een van deze groepen werd geïnjecteerd met een pi PBS (PBS). Een derde groep bleef intact (geen behandeling). Gepresenteerd is het percentage dieren dat voor elke groep reageert op geur presentatie met een PER. Een ANOVA is niet gebleken dat er een significante verschillen tussen groepen in de acquisitie fase (F2, 189 = 1.299, p> 0,05) of in het geheugen vasthouden (F2, 187 = 0.752, p> 0,05).
Figuur 2. Injectie van anisomycin 40 minuten na de laatste CS-US koppeling vermindert het geheugen retentie drie dagen en vier dagen na de training. Dieren werden getraind met drie CS-US paringen (aankoop) en geïnjecteerd met een il 10 mM anisomycin (Aniso) of een pi PBS 1 uur na de eerste training proef. Geheugen werd getest (Memory Retention) 24 uur, 48 uur, 72 uur en 96 uur later. Gepresenteerd is het percentage van de dieren per groep reageert op geur presentatie met een PER. De injectie van anisomycin leidt tot een aanzienlijke vermindering van het geheugen retentie 72 uur en 96 uur na de training (F1, 94 = 8,86, p <0,05) zoals blijkt uit een ANOVA.
Discussion
- Catching bijen: Voor ervaren foeragerende bijen worden vergaard, zijn bijen gevangen, hetzij in de ochtend of in de namiddag, het vermijden van de tijd dat jonge bijen zijn op oriëntatie vluchten 19. Voedermachines verzamelen ofwel stuifmeel of nectar. Verschillen tussen stuifmeel en nectar voedermachines zijn waargenomen op basis van hun suiker responsiviteit en hun leervermogen 20. Om alleen nectar voedermachines te vangen, een kunstmatige voedselbron gevuld met een sucrose oplossing kan worden geïnstalleerd in de buurt van de korf en de dieren kan er worden verzameld. Pollen voedermachines terug te keren naar de korf kan worden geïdentificeerd door het stuifmeel manden op hun achterpoten 20.
- Vaststelling en behandeling: Uitgebreide koeling van bijen op het ijs moet worden vermeden omdat het misschien hun vermogen om te leren en om te overleven tot het einde van het experiment beïnvloeden. Tarsi moeten zorgvuldig worden vastgesteld binnen de buis per ongeluk stimulatie met sucrose oplossing te vermijden. Dit is belangrijk, omdat de bijen is aangetoond dat leren door tarsale stimulatie met succrose oplossing 3,21.
- Olfactorische conditioning: Het aantal van conditionering proeven, de inter-trial interval, en de test tijdstip kan worden gevarieerd, afhankelijk van de focus van de studie 3,22.
- Voeding: De verzadiging niveau van bijen is bekend dat hun leerprestaties en geheugen vasthouden 3,23 beïnvloeden. Dit moet rekening worden gehouden bij de planning van de experimenten.
- Injectie: luchtzakken bevinden zich in de honingbij thorax 17. Deze vitale delen van de luchtwegen zijn noodzakelijk om te overleven. Dus zorg ervoor dat u niet om de longblaasjes beschadigen tijdens de injectie. De release van luchtbellen geeft schade aan de longblaasjes.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een subsidie van het Duitse Federale Ministerie van Onderwijs en Onderzoek (BMBF) binnen de Bernstein Focus: neuronale basis van Learning (BFNL) naar DE We Randolf Menzel bedanken voor waardevolle commentaar op een eerdere versie van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Syringe Omnifix 20 ml | B. Braun Medical | 4616200 V | |
| White refined household sugar | Kaisers Supermarket, Berlin, Germany | ||
| Clove oil | Bombastus, Freital, Germany | ||
| Multipette plus | Eppendorf | 4981 000.019 | |
| Rack for 30 bee tubes | Home made | ||
| Plastic tubes | Home made | ||
| UV light-permeable plexiglass pyramid | Home made | height = 30cm,apex 3.5 x 3.5cm,base 18x18cm | |
| Sticky tape | Tesa, Hamburg, Germany | ||
| Capillator sticks 1-5μl | Selzer | ||
| Capillator tips 1-5μl | Selzer | ||
| Filter paper 0.16-0.2 mm thick | Macherey-Nagel | MN 616 or MN615 | Adjusted to circular pieces with a 1.3 cm diameter |
| Disposable hypodermic needle | B. Braun Medical | 4657683 | 0.45 mm diameter |
References
- Menzel, R., Giurfa, M. Cognitive architecture of a mini-brain: the honeybee. Trends Cogn Sci. 5, 62-71 (2001).
- Menzel, R., Leboulle, G., Eisenhardt, D. Small brains, bright minds. Cell. 124, 237-239 (2006).
- Menzel, R. Neurobiology of comparative cognition. Kesner, R. P., Olton, D. S. , Lawrence Erlbaum Associates Publishers. Hillsday, New Jersey, Hove, London. (1990).
- Bitterman, M. E., Menzel, R., Fietz, A., Schafer, S. Classical-Conditioning of Proboscis Extension in Honeybees (Apis-Mellifera). J. Comp. Psyc. 97, 107-119 (1983).
- Menzel, R., Muller, U. Learning and memory in honeybees: from behavior to neural substrates. Annu. Rev. Neurosci. 19, 379-404 (1996).
- Menzel, R. Memory dynamics in the honeybee. Journal of Comparative Physiology A-Neuroethology Sensory Neural and Behavioral Physiology. 185, 323-340 (1999).
- Menzel, R. Searching for the memory trace in a mini-brain, the honeybee. Learn. Mem. 8, 53-62 (2001).
- Eisenhardt, D. Learning and memory formation in the honeybee (Apis mellifera) and its dependency on the cAMP-protein kinase A pathway. Animal Biology. 56, 259-278 (2006).
- Hourcade, B., Muenz, T. S., Sandoz, J. C., Rossler, W., Devaud, J. M. Long-term memory leads to synaptic reorganization in the mushroom bodies: a memory trace in the insect brain. J. Neurosci. 30, 6461-6465 (2010).
- Denker, M., Finke, R., Schaupp, F., Grun, S., Menzel, R. Neural correlates of odor learning in the honeybee antennal lobe. Eur. J. Neurosci. 31, 119-133 (2010).
- Szyszka, P., Galkin, A., Menzel, R. Associative and non-associative plasticity in kenyon cells of the honeybee mushroom body. Front Syst. Neurosci. 2, 3-3 (2008).
- Okada, R., Rybak, J., Manz, G., Menzel, R. Learning-related plasticity in PE1 and other mushroom body-extrinsic neurons in the honeybee brain. J. Neurosci. 27, 11736-11747 (2007).
- Muller, U. Prolonged activation of cAMP-dependent protein kinase during conditioning induces long-term memory in honeybees. Neuron. 27, 159-168 (2000).
- Locatelli, F., Bundrock, G., Muller, U. Focal and temporal release of glutamate in the mushroom bodies improves olfactory memory in Apis mellifera. J. Neurosci. 25, 11614-11618 (2005).
- Stollhoff, N., Menzel, R., Eisenhardt, D. Spontaneous recovery from extinction depends on the reconsolidation of the acquisition memory in an appetitive learning paradigm in the honeybee (Apis mellifera. J. Neurosci. 25, 4485-4492 (2005).
- Stollhoff, N., Eisenhardt, D. Consolidation of an extinction memory depends on the unconditioned stimulus magnitude previously experienced during training. J. Neurosci. 29, 9644-9650 (2009).
- Snodgrass, R. E. Anatomy of the honeybee. , Comstock Publishing Associates. New York. (1956).
- Wustenberg, D., Gerber, B., Menzel, R. Short communication: long- but not medium-term retention of olfactory memories in honeybees is impaired by actinomycin D and anisomycin. Eur. J. Neurosci. 10, 2742-2745 (1998).
- Vollbehr, J. Zur Orientierung junger Honigbienen bei ihrem 1. Orientierungsflug. Zool. Jb. Physiol. 79, 33-69 (1975).
- Scheiner, R., Erber, J., Page, R. E. Tactile learning and the individual evaluation of the reward in honey bees (Apis mellifera L.). J. Comp Physiol [A]. 185, 1-10 (1999).
- Sanchez, B. rito, G, M. Behavioral studies on tarsal gustation in honeybees: sucrose responsiveness and sucrose-mediated olfactory conditioning. J. Comp Physiol A Neuroethol. Sens. Neural Behav. Physiol. 194, 861-869 (2008).
- Menzel, R., Manz, G., Menzel, R., Greggers, U. Massed and spaced learning in honeybees: the role of CS, US, the intertrial interval, and the test interval. Learn. Mem. , 198-208 (2001).
- Friedrich, A., Thomas, U., Muller, U. Learning at different satiation levels reveals parallel functions for the cAMP-protein kinase A cascade in formation of long-term memory. J. Neurosci. 24, 4460-4468 (2004).
