Summary
Dimostriamo come implementare un metodo di farmacologia comportamentale in un paradigma di condizionamento appetitivo olfattivo nelle api (Apis mellifera) mediante l'applicazione sistemica di farmaci. Questo metodo permette di indagine del processo di apprendimento dei meccanismi di base e formazione della memoria in modo semplice e affidabile.
Abstract
Le api (Apis mellifera) sono ben noti per la loro abilità di comunicazione e orientamento e per i loro 1,2 impressionante capacità di apprendimento. Perché la sopravvivenza di una colonia di api dipende sullo sfruttamento delle fonti di cibo, le api raccoglitore apprendere e memorizzare siti fiori variabile nonché la loro redditività. Forager api possono essere facilmente addestrati in ambienti naturali dove foraggio in un sito di alimentazione e imparare i segnali correlati, come l'odore o colore. Appetitivo apprendimento associativo può anche essere studiato in condizioni controllate in laboratorio dal condizionamento della risposta estensione proboscide (PER) del individualmente imbrigliato api 3,4. Questo paradigma di apprendimento consente lo studio dei meccanismi neuronali e molecolari che sono alla base dell'apprendimento e la formazione della memoria in modo semplice ed estremamente affidabile 5-12. Un approccio farmacologia comportamentale è usato per studiare i meccanismi molecolari. I farmaci vengono iniettati per via sistemica di interferire con la funzione di molecole specifiche, durante o dopo l'apprendimento e la formazione della memoria 13-16.
Qui mostriamo come addestrare le api sfruttate condizionata PER e come applicare i farmaci per via sistemica per iniezione nel muscolo di volo delle api.
Protocol
1. Le api cattura dal Hive
- Un giorno prima l'esperimento comincia, tra 2 e 4 del pomeriggio, lasciando l'alveare api sono catturati. Per fare questo, una luce UV-permeabile piramide in plexiglass (altezza = 30 cm, apice 3,5 x 3, 5 cm, base 18 x 18 cm), che è richiudibile al vertice e la base, è tenuto ad un 20 - distanza di 30 cm di fronte all'ingresso dell'alveare con la base aperta e l'apice chiuso in modo che le api di lasciare l'alveare entrare nella base della piramide. La base è quindi chiuso e le api catturate vengono portati in laboratorio per ulteriori manipolazioni.
2. Trasferimento di api dalla Piramide in flaconi di vetro
- Nel laboratorio, la piramide è posato sulla sua base. Le pareti della piramide sono oscurati (per esempio con un asciugamano), ma l'apice è lasciato scoperto. A causa della loro fototassi positivo, api lascerà la piramide con l'apice quando aperto. Uno dopo l'altro, le api vengono trasferite dalla piramide in flaconi di vetro tenendo le fiale sopra l'apice aperto. Un flaconcino viene utilizzato per ape. Pertanto, l'apice è chiuso quando si un'ape entra nel flaconcino.
3. Le api, ricevano Tubi
- Le api sono immobilizzati da un raffreddamento in fiale di vetro in ghiaccio per 2,5-3,5 min. Si consiglia di guardare l'ape e rimuoverlo dal ghiaccio non appena si smette di muoversi.
- Un'ape singolo immobilizzato è imbrigliato in un piccolo tubo di plastica con del nastro adesivo, in modo che sia in grado di muoversi liberamente la sua proboscide, ma non la sua testa, torace e gambe. E 'importante che il collo non è compresso.
- Ogni ape fissato in un tubo di plastica viene messo in un pozzo numerati su una rastrelliera per una migliore maneggevolezza e l'identificazione. Dopo che è stata rimossa per il recupero di condizionamento o la memoria del tubo è sempre restituito al pozzo esattamente lo stesso.
4. Api di alimentazione
- La prima sera (4-6 pm), dopo la cattura, le api sono alimentati a sazietà con la soluzione di saccarosio (0,88 M, lo zucchero bianco raffinato casa sciolto in acqua di rubinetto). Per alimentare un ape, il suo PER è suscitato toccando le sue antenne con una soluzione di saccarosio e l'animale è consentito di consumare una goccia (4 mL) di soluzione di saccarosio. Le api sono alimentati uno dopo l'altro finché non hanno più mostrano una veloce e affidabile PER quando le loro antenne sono toccati con la soluzione di saccarosio.
- Su ogni sera successiva (4-6 pm) delle api esperimento vengono alimentati uno dopo l'altro quattro volte con 1 goccia di soluzione di saccarosio (4 microlitri, 0,88 M, lo zucchero bianco raffinato risolto in acqua di rubinetto). E 'importante che la soluzione di saccarosio non è spalmato sulle antenne delle api o la proboscide durante l'allattamento e che i tubi non sono contaminati con soluzione di saccarosio. Le api non dovrebbero essere alimentati in corrispondenza o in prossimità del sito di condizionamento per escludere la possibilità di associare il contesto di formazione con lo stimolo di saccarosio.
5. Mantenere Api Sfruttati Pernottamento
- Le api sono tenuti durante la notte in una ciotola di plastica a temperatura ambiente. L'acqua del rubinetto è piena nella ciotola (circa 0,5-1 cm di altezza). Rack con le api sfruttata vengono inseriti nella ciotola sopra la linea di galleggiamento con le piastre ELISA come piattaforma. Infine, la tazza è ricoperto di cartone.
6. Condizionamento olfattivo
La prima mattina (ore 10) l'esperimento di condizionamento olfattivo viene effettuata. Lo stimolo condizionato (CS) è un odore, lo stimolo incondizionato (US) è la soluzione di saccarosio.
- 4 l di dell'odore (es. olio di chiodi di garofano) vengono aggiunti su un tondo di carta filtro (1,3 cm di diametro) che viene poi inserito in una siringa da 20 ml. L'odore è pipettato sotto una cappa filtrante e suggerimenti sono utilizzati per prevenire la contaminazione della pipetta.
- Il rack con le api sfruttata è posizionato in prossimità del sito di condizionamento 30 minuti prima della procedura di condizionamento inizia, ma ad una distanza dal luogo di fronte a un tubo di scarico in cui le api sono condizionati singolo.
- Condizionamento è composto da tre coppie di odore (lo stimolo condizionato, CS) e la soluzione di saccarosio (lo stimolo incondizionato, USA, 1,25 M) con un inter-trial intervallo (ITI) di 10 min. Un segnale acustico consegnato allo sperimentatore attraverso un lettore audio permette la tempistica precisa di insorgenza stimolo, stimolo offset, durata stimolo e di collocamento. Un processo di acquisizione inizia con un collocamento di 10 secondi l'animale di fronte a uno scarico. Poco prima della fine dei 10 sec la siringa contenente l'odore è posizionato 3 cm fronte delle api destinati a antenne dell'ape. Successivamente, l'odore è presentato per 5 secondi, premendo 20 ml d'aria attraverso la siringa. Dopo i primi 3 secondi i flagelli distale di entrambe le antenne sono toccati con una soluzione di saccarosio-stuzzicadenti inumidito e gli animali sono autorizzati a leccare lo stuzzicadenti moistend per 4 sec. 13 secondi dopo la stimolazione è finita CS, le api vengono prese fuori del contesto formativo e rimesso nel rack. Complessivamente una prova di formazione dura 28 secondi.
E 'importante che né antenne delle api né la proboscide, sono ricoperte di saccarosio dopo il condizionamento. Quindi deve essere garantito che lo stuzzicadenti è solo inumidito con soluzione di saccarosio e che nessuna forma gocce di soluzione di saccarosio sul stuzzicadenti. - Dopo il condizionamento i rack sono posti di nuovo nella ciotola.
- Comportamento degli animali 'durante l'esperimento, ovvero il verificarsi del PER durante il posizionamento e CS e presentazione degli Stati Uniti, è monitorato e annotato dallo sperimentatore.
7. Conservazione della memoria
- Test di ritenzione può essere eseguita in qualsiasi intervallo (min a giorni). Il rack con le api è posizionato in prossimità del sito di condizionamento 30 minuti prima del test di memoria inizia.
- Un test della memoria è costituita da 5 sec presentazione CS senza presentazione degli Stati Uniti. La prova inizia con un collocamento di 10 secondi l'animale di fronte al gas di scarico. Successivamente, l'odore è presentato per 5 secondi come descritto sopra. Il comportamento dell'animale, ovvero il verificarsi del PER durante il posizionamento e la presentazione CS è annotato durante l'esperimento.
- Alla fine dell'esperimento la risposta estensione proboscide è di nuovo suscitato toccando le antenne con una soluzione di saccarosio per garantire che l'animale è ancora in grado di estendere la sua proboscide.
8. Iniezione sistemica
Il punto di tempo di iniezione sistemica dipende dal disegno sperimentale.
- Un piccolo foro è fatto nella cuticola della parte posteriore della scutum vicino alla fessura di sopra dei 17 scutal volo muscolare utilizzando un ago ipodermico monouso (21 G).
- Utilizzando un tubo di vetro capillare, 1 ul di soluzione viene iniettata attraverso il foro nella cuticola nel muscolo volo. Sperimentatori addestrati sono in grado di iniettare un ape ogni 30 secondi, consentendo un momento preciso di iniezione e di condizionamento.
9. Le api di alimentazione durante l'esperimento
- La sera (4-6 pm) dopo il condizionamento, le api sono alimentati uno dopo l'altro quattro volte con 1 goccia di soluzione di saccarosio (4 microlitri, 0,88 M, lo zucchero bianco raffinato sciolto in acqua di rubinetto). E 'importante che la soluzione di saccarosio non è spalmato sulle antenne delle api o la proboscide durante l'allattamento e che i tubi non sono contaminati con soluzione di saccarosio. Le api non dovrebbero essere alimentati in corrispondenza o in prossimità del sito di condizionamento per escludere la possibilità di associare il contesto di formazione con lo stimolo di saccarosio.
10. Raccolta dati e analisi dei dati
- Comparsa di risposta estensione proboscide durante l'esperimento è monitorato. Un'ape risulti positivo se si estende la sua proboscide tra l'inizio del CS e la presentazione degli Stati Uniti (durante l'allenamento) o durante la presentazione CS (in fase di test), che attraversano una linea virtuale tra le mandibole aperte.
- Per essere inclusi negli animali l'analisi deve soddisfare due criteri: devono sopravvivere l'intero esperimento e devono dimostrare l'incondizionato risposta estensione proboscide (PER) di soluzione di saccarosio al termine dell'esperimento. La percentuale di api che mostra il PER durante l'acquisizione e test di ritenzione è tracciata per ogni presentazione CS.
11. Rappresentante dei risultati:
Due esperimenti sono presentati qui.
Nel primo esperimento guardiamo l'impatto di iniezione sistemica di PBS (PBS; in mM: 137 NaCl, KCl 2,7, 10,1 Na 2 HPO 4, 1,8 KH 2 PO 4, pH 7, 2) sull'apprendimento e lungo termine formazione della memoria. Tre gruppi di api sono stati addestrati con tre CS-US abbinamenti con un inter-trial intervallo di 10 minuti: un non-gruppo trattato, un gruppo che è stato iniettato con 1 ml di PBS 30 minuti prima dell'allenamento, e una farsa-iniettato il gruppo trattato allo stesso modo del PBS a iniezione di gruppo, ma senza l'iniezione di PBS. 24 ore dopo la formazione della memoria è stata testata con una presentazione CS in tutti e tre i gruppi. La percentuale di animali che presentano la risposta condizionata durante il condizionamento aumenta significativamente nelle tre prove di formazione (Fig.1, ANOVA per misure ripetute per il fattore tempo F 2378 = 340.456, p <0,05). Nessuna differenza nella PER poteva essere osservata tra i tre gruppi durante il condizionamento (ANOVA per misure ripetute per il fattore F2 gruppi, 189 = 1.299, p> 0,05). Questo vale per un test di 24 ore di ritenzione (F2, 187 = 0.752, p> 0,05) nel confronto tra gli animali non trattati con PBS-iniettato animali e sham-iniettato.
Nel secondo esperimento abbiamo dimostrato l'inibizione di ritenzione della memoria tre o quattro giorni dopo l'allenamento quando l'inibitore della sintesi proteica anisomycin (10 mM) è stata iniettata per via sistemica 30 min dopo tre CS-US abbinamenti. Confronto di un anisomycin iniezione gruppo con un PBS a iniezione gruppo rivela una differenza significativa tra i gruppi durante la ritenzione test (Fig.2, ANOVA per misure ripetute per il fattore di F1 del gruppo, 94 = 8,86, p <0,05). Una delle principali differenze possono essere osservate al test della memoria il giorno 3 e giorno 4. Questo assomiglia i risultati di Wüstenberg et al. 18, che ha anche condizionato le api con tre CS-US abbinamenti, anche se con un protocollo diverso.
Figura 1. Lesione cuticola o iniezione di PBS non altera acquisizione e il mantenimento della memoria. Gli animali sono stati addestrati con tre CS-US abbinamenti (acquisizione). Dopo 24 ore, la memoria è stata testata (ritenzione della memoria). Trenta minuti prima di formazione, un buco è stato fatto nella cuticola di due gruppi (lesione, PBS) e uno di questi gruppi è stato iniettato con 1 ml di PBS (PBS). Un terzo gruppo è stato lasciato intatto (nessun trattamento). Presentato è la percentuale di animali per ogni gruppo rispondendo alla presentazione con un odore PER. Un'ANOVA non rivela differenze significative tra i gruppi nella fase di acquisizione (F2, 189 = 1,299, p> 0,05) o nella conservazione memoria (F2, 187 = 0,752, p> 0,05).
Figura 2. Iniezione di anisomycin 40 minuti dopo l'ultimo CS-USA accoppiamento riduce la ritenzione della memoria tre giorni e quattro giorni dopo l'allenamento. Gli animali sono stati addestrati con tre CS-US abbinamenti (acquisizione) e iniettato con 1 mM anisomycin microlitri 10 (formato ISO) o 1 ml di PBS 1 h dopo il processo di formazione prima. Memoria è stata testata (ritenzione della memoria) 24 ore, 48 ore, 72 ore e 96 ore più tardi. Presentato è la percentuale di animali per gruppo rispondendo alla presentazione con un odore PER. L'iniezione di anisomycin porta ad una riduzione significativa di memoria ritenzione 72 ore e 96 ore dopo l'allenamento (F1, 94 = 8.86, p <0,05), come rivelato da un ANOVA.
Discussion
- Facendo api: Per raccogliere esperienza api bottinatrici, le api vengono catturati o al mattino o al pomeriggio, evitando il momento in cui le api giovani sui voli orientamento 19. Raccoglitori raccolga polline o nettare. Le differenze tra polline e nettare raccoglitori sono stati osservati in base alla loro reattività zucchero e la loro capacità di apprendimento 20. Per raggiungere raccoglitori nettare unico, una fonte di cibo artificiale riempito con una soluzione di saccarosio può essere installata vicino l'alveare e gli animali possono essere raccolti lì. Raccoglitori polline ritorno all'alveare possono essere identificati dai cesti polline sulle zampe posteriori 20.
- Fissaggio e movimentazione: raffreddamento estesa delle api sul ghiaccio dovrebbe essere evitata in quanto potrebbe incidere sulla loro capacità di apprendere e di sopravvivere fino alla fine dell'esperimento. Tarsi devono essere fissati con cura all'interno del tubo per evitare la stimolazione accidentale con una soluzione di saccarosio. Questo è importante, perché le api hanno dimostrato di imparare attraverso la stimolazione del tarso con una soluzione succrose 3,21.
- Condizionamento olfattivo: Il numero di prove condizionata, l'inter-trial intervallo, e il punto di tempo di prova può essere variata a seconda del focus dello studio 3,22.
- Alimentazione: il livello di sazietà delle api è conosciuto per influenzare le prestazioni di apprendimento e la memorizzazione 3,23. Questo deve essere preso in considerazione durante la pianificazione degli esperimenti.
- Iniezione: sacche d'aria si trovano nei 17 torace api. Queste parti vitali del sistema respiratorio sono necessari per la sopravvivenza. Quindi si deve prestare attenzione a non danneggiare le sacche d'aria durante l'iniezione. Il rilascio di bolle d'aria indica un danno per le sacche d'aria.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione da parte del ministero federale tedesco dell'Istruzione e della Ricerca (BMBF) nell'ambito del Fuoco Bernstein: Base neuronale di apprendimento (BFNL) per DE Ringraziamo Randolf Menzel per preziosi commenti su una versione precedente del manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Syringe Omnifix 20 ml | B. Braun Medical | 4616200 V | |
| White refined household sugar | Kaisers Supermarket, Berlin, Germany | ||
| Clove oil | Bombastus, Freital, Germany | ||
| Multipette plus | Eppendorf | 4981 000.019 | |
| Rack for 30 bee tubes | Home made | ||
| Plastic tubes | Home made | ||
| UV light-permeable plexiglass pyramid | Home made | height = 30cm,apex 3.5 x 3.5cm,base 18x18cm | |
| Sticky tape | Tesa, Hamburg, Germany | ||
| Capillator sticks 1-5μl | Selzer | ||
| Capillator tips 1-5μl | Selzer | ||
| Filter paper 0.16-0.2 mm thick | Macherey-Nagel | MN 616 or MN615 | Adjusted to circular pieces with a 1.3 cm diameter |
| Disposable hypodermic needle | B. Braun Medical | 4657683 | 0.45 mm diameter |
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