Summary
Demonstramos como implementar um método de farmacologia comportamental em um paradigma de condicionamento apetitivo olfativa de abelhas (Apis mellifera) por aplicação sistêmica de medicamentos. Este método permite investigação dos mecanismos subjacentes à aprendizagem e formação da memória de uma forma simples e confiável.
Abstract
Abelhas (Apis mellifera) são bem conhecidos por suas habilidades de comunicação e orientação e para os seus 1,2 impressionante capacidade de aprendizagem. Porque a sobrevivência de uma colônia de abelhas depende da exploração de fontes de alimentos, as abelhas forrageiras aprender e memorizar os sites flor variável, bem como a sua rentabilidade. Abelhas forrageiras podem ser facilmente treinados em ambientes naturais onde forragem em um local de alimentação e aprender os sinais relacionados, tais como odor ou cor. Aprendizagem associativa apetitivo também pode ser estudado sob condições controladas em laboratório pelo condicionamento da resposta de extensão probóscide (PER) de abelhas individualmente aproveitado 3,4. Este paradigma de aprendizagem permite o estudo dos mecanismos neuronais e moleculares subjacentes à aprendizagem e formação da memória de uma forma simples e altamente confiável 5-12. Uma abordagem a farmacologia comportamental é usado para estudar os mecanismos moleculares. Medicamentos são injetados sistemicamente a interferir com a função de moléculas específicas durante ou depois da aprendizagem e formação da memória 13-16.
Aqui demonstramos como treinar abelhas aproveitado no condicionamento PER e como aplicá-drogas sistemicamente por injecção no músculo de vôo de abelhas.
Protocol
1. Abelhas captura da Hive
- Um dia antes do experimento começa, entre 2 e 4 horas, deixando as abelhas da colméia são capturados. Para isso, uma pirâmide de luz UV plexiglass-permeável (altura = 30 cm, ápice de 3,5 x 3, 5 cm, base 18 x 18 cm), o que é que pode ser fechado no ápice e na base, é realizada em um 20 - 30 cm de distância na frente da entrada colmeia com a base aberta e fechada para o ápice que as abelhas saindo da colméia entrar na base da pirâmide. A base é fechada e as abelhas capturados são levados para o laboratório para manuseio.
2. Transferência Bees da pirâmide em frascos de vidro
- No laboratório, a pirâmide é colocado sobre sua base. As paredes da pirâmide estão escurecidos (por exemplo, com uma toalha), mas o ápice fica descoberto. Por causa de sua fototaxia positiva, as abelhas deixarão a pirâmide por meio do ápice quando aberto. Uma por uma, as abelhas são transferidas da pirâmide em frascos de vidro, mantendo os frascos sobre o ápice aberto. Um frasco é usado por abelha. Portanto, o ápice é fechado quando uma abelha entra no frasco.
3. Abelhas mobilização Tubes
- As abelhas são imobilizadas por refrigeração-los na frascos de vidro em gelo por 2,5-3,5 min. Aconselha-se a assistir a abelha e removê-lo do gelo, assim que pára de se mover.
- A única abelha imobilizado é aproveitada em um pequeno tubo de plástico com fita adesiva, de modo que é capaz de se mover livremente sua tromba, mas não a sua cabeça, tórax e pernas. É importante que o pescoço não é comprimido.
- Cada abelha fixo em um tubo de plástico é colocado em um furo numeradas em um rack para melhor manuseio e identificação. Depois de ter sido removido para a recuperação de condicionamento ou de memória do tubo é sempre retornado ao poço exatamente o mesmo.
4. Abelhas alimentação
- Na primeira noite (06/04 horas), depois de ser pego, as abelhas são alimentadas até a saciedade com solução de sacarose (0,88 M, o açúcar branco refinado doméstico dissolvido em água da torneira). Para alimentar uma abelha, seu PER é eliciada tocando suas antenas com a solução de sacarose e que o animal é permitido consumir uma gota (4 mL) da solução de sacarose. As abelhas são alimentadas uma após a outra repetidamente até que eles já não apresentam um PER rápido e confiável quando suas antenas são tocados com solução de sacarose.
- Em cada noite subseqüente (4-6 pm) das abelhas são alimentadas experimento uma após a outra quatro vezes com uma gota de solução de sacarose (4 mL, 0,88 M, açúcar branco refinado resolvido em água da torneira). É importante que a solução de sacarose não é espalhado em antenas da abelha ou da tromba durante a alimentação e que os tubos não estão contaminados com solução de sacarose. As abelhas não devem ser alimentados em ou perto do local condicionado para excluir a possibilidade de associar o contexto de formação com o estímulo de sacarose.
5. Mantendo abelhas Harnessed Overnight
- Abelhas são mantidas durante a noite em uma bacia de plástico em temperatura ambiente. Água da torneira é cheia na bacia (cerca de 0,5-1 cm de altura). Racks com as abelhas são colocadas aproveitado na bacia acima da linha d'água usando placas de ELISA como uma plataforma. Finalmente, a bacia é coberta com papelão.
6. Condicionado olfativa
Na primeira manhã (10:00) do experimento de condicionamento olfativo é realizada. O estímulo condicionado (CS) é um odor, o estímulo não condicionado (EUA) é solução de sacarose.
- 4 mL do odor (óleo de cravo, por exemplo) são pipetados em um papel filtro rodada (1,3 cm de diâmetro) que é então inserido em uma seringa de 20 mL. O odor é pipetado sob um capuz e dicas de filtro são usados para evitar a contaminação da pipeta.
- O rack com abelhas aproveitado é colocado próximo ao local 30 min condicionado antes do procedimento de condicionamento começa, mas a uma distância para o lugar na frente de um tubo de escape onde as abelhas só são condicionadas.
- Condicionamento consiste em três pares de odor (o estímulo condicionado, CS) e solução de sacarose (o estímulo incondicionado, EUA, 1,25 M) com um intervalo inter-ensaio (ITI), de 10 min. Um sinal acústico entregue ao pesquisador através de um leitor de áudio garante a data precisa de início do estímulo, estímulo offset, duração do estímulo e colocando. Um ensaio de aquisição começa com uma colocação de 10 segundos do animal na frente de um escape. Pouco antes do final do sec 10 a seringa contendo o odor é colocado 3 centímetros na frente da abelha orientadas para antenas da abelha. Posteriormente, o odor é apresentado durante 5 segundos, empurrando 20 mL de ar através da seringa. Após os primeiros 3 segundos do flagelos distal de ambas as antenas são tocados com uma solução de sacarose-umedecidos palito e animais estão autorizados a lamber o palito moistend por 4 seg. 13 seg após o término da estimulação CS, as abelhas são tomadas fora do contexto de formação e colocado de volta na prateleira. No total, um ensaio de treinamento dura 28 seg.
É importante que nem antenas da abelha nem a tromba são cobertos com sacarose, após condicionamento. Por isso, tem que ser assegurado que o palito é apenas umedecido com solução de sacarose e que nenhuma gota de forma sacarose solução no palito. - Após o condicionamento dos racks são colocados de volta na tigela.
- Comportamento dos animais durante o experimento, ou seja, a ocorrência do PER durante a colocação e CS e apresentação dos EUA, é monitorado e anotadas pelo experimentador.
7. Retenção de memória
- Testes de retenção pode ser realizada em qualquer intervalo de tempo (min até dias). O rack com abelhas é colocado perto do local condicionado min 30 antes do teste de memória começa.
- Um teste de memória consiste em 5 segundos sem apresentação CS apresentação EUA. O teste começa com uma colocação de 10 segundos do animal na frente dos gases de escape. Posteriormente, o odor é apresentado durante 5 segundos, como descrito acima. O comportamento do animal, ou seja, a ocorrência do PER durante a colocação ea apresentação CS é anotado durante o experimento.
- No final do experimento a resposta extention proboscis é novamente provocado tocando as antenas com solução de sacarose para garantir que o animal ainda é capaz de estender a sua tromba.
8. Injeção sistêmica
O ponto de tempo de injeção sistêmica depende do delineamento experimental.
- Um pequeno buraco é feito na cutícula da parte posterior da rótula próxima à fissura scutal acima dos 17 músculos de vôo usando uma agulha hipodérmica descartável (21 G).
- Usando um tubo de vidro capilar, uma solução mL é injetado através do buraco na cutícula no músculo de vôo. Experimentadores treinados são capazes de injetar uma abelha cada 30 segundos, permitindo um calendário preciso de injeção e condicionamento.
9. Abelhas alimentação durante o Experimento
- Na noite (4-6 pm), após condicionamento, as abelhas são alimentadas uma após a outra quatro vezes com uma gota de solução de sacarose (4 mL, 0,88 M, o açúcar refinado branco dissolvido em água da torneira). É importante que a solução de sacarose não é espalhado em antenas da abelha ou da tromba durante a alimentação e que os tubos não estão contaminados com solução de sacarose. As abelhas não devem ser alimentados em ou perto do local condicionado para excluir a possibilidade de associar o contexto de formação com o estímulo de sacarose.
10. Coleta de Dados e Análise de Dados
- Ocorrência da resposta de extensão tromba durante o experimento é monitorado. A abelha é marcado positivo se estende a sua tromba entre o início do CS ea apresentação de os EUA (durante o treinamento) ou durante a apresentação CS (durante a fase de teste), cruzando uma linha virtual entre as mandíbulas abertas.
- Para ser incluído na análise de animais deve cumprir dois critérios: devem sobreviver todo o experimento e eles devem mostrar a resposta de extensão incondicionada probóscide (PER) para solução de sacarose no final do experimento. A porcentagem de abelhas mostrando o PER durante a aquisição e testes de retenção é plotado para cada apresentação CS.
11. Resultados representativos:
Dois experimentos são apresentados aqui.
No primeiro experimento olhamos para o impacto da injeção sistêmica de tampão fosfato (PBS, em mM: NaCl 137, KCl 2,7, 10,1 Na 2 HPO 4, 1,8 KH 2 PO 4, pH 7, 2) na aprendizagem e no longo prazo a formação da memória. Três grupos de abelhas foram treinados com três CS-US pares, com um intervalo inter-teste de 10 min: um grupo não-tratado, um grupo que foi injetado com 1 mL PBS 30 min antes do treino, e um grupo sham-injetado tratados da mesma forma que o grupo PBS-injetada, mas sem injetar PBS. 24 h após a formação da memória foi testada com uma apresentação CS em todos os três grupos. A percentagem de animais que apresentem a resposta condicionada durante o condicionamento aumenta significativamente ao longo dos três ensaios de formação (Fig.1, ANOVA para medidas repetidas para o fator tempo F 2378 = 340,456, p <0,05). Nenhuma diferença no PER pode ser observada entre os três grupos durante o condicionamento (ANOVA para medidas repetidas para o fator de grupos F2, 189 = 1,299, p> 0,05). Isso vale para um teste de retenção de 24 h (F2, 187 = 0,752, p> 0,05) na comparação entre animais não tratados com PBS-injetado animais e sham-injetado.
No segundo experimento, demonstramos a inibição da retenção da memória de três e quatro dias depois do treinamento quando o inibidor da síntese protéica anisomicina (10 mM) foi injetado sistemicamente 30 min depois de três CS-US emparelhamentos. Comparação de um grupo anisomicina-injetados com um grupo PBS-injetado revela uma diferença significativa entre os grupos durante a retenção de test (Fig.2, ANOVA para medidas repetidas para o fator grupo F1, 94 = 8,86, p <0,05). A grande diferença pode ser observada no teste de memória no dia 3 e dia 4. Isto assemelha-se os resultados de Wüstenberg et al. 18 anos, que também condicionada abelhas com três CS-US emparelhamentos, embora com um protocolo diferente.
Figura 1. Lesão cutícula ou injeção de PBS não altera aquisição e retenção da memória. Animais foram treinados com três CS-US pares (aquisição). Após 24 h, a memória foi testada (Retenção da Memória). Trinta minutos antes do treino, um buraco foi feito na cutícula dos dois grupos (lesão, PBS) e um desses grupos foram injetados com 1 mL de PBS (PBS). Um terceiro grupo foi deixada intacta (sem tratamento). Apresentada é a percentagem de animais para cada grupo responder a apresentação com um odor PER. Uma ANOVA não revelou diferenças significativas entre os grupos na fase de aquisição (F2, 189 = 1,299, p> 0,05) ou na retenção da memória (F2, 187 = 0,752, p> 0,05).
Figura 2. Injeção de anisomicina 40 min após o emparelhamento CS-US última reduz a retenção de memória de três dias e quatro dias depois do treinamento. Animais foram treinados com três CS-US pares (aquisição) e injetados com 1 mL 10 mM anisomicina (Aniso) ou 1 mL de PBS 1 h após o julgamento primeira formação. Memória foi testada (Retenção da Memória) 24 h, 48 h, 72 he 96 h depois. Apresentada é a porcentagem de animais por grupo respondendo a apresentação com um odor PER. A injeção de anisomicina leva a uma redução significativa de memória de retenção de 72 h e 96 h após o treinamento (F1, 94 = 8,86, p <0,05), como revelado por uma ANOVA.
Discussion
- Captura das abelhas: Para coletar as abelhas obreiras experientes, as abelhas são capturados ou de manhã ou à tarde, evitando o tempo em que as abelhas jovens estão em vôos orientação 19. Forrageiras ou coletar pólen ou néctar. Diferenças entre o pólen e néctar forrageiras têm sido observadas de acordo com sua capacidade de resposta de açúcar e suas habilidades de aprendizagem 20. A fim de pegar forrageiras néctar apenas, uma fonte de alimento artificial preenchido com uma solução de sacarose pode ser instalado próximo à colméia e os animais podem ser recolhidos lá. Forrageiras pólen retornando à colméia pode ser identificado pelo cestas de pólen nas patas traseiras 20.
- Fixação e manipulação: Extended refrigeração de abelhas no gelo deve ser evitado, pois pode afetar sua capacidade de aprender e sobreviver até o final do experimento. Tarsi tem que ser fixado cuidadosamente dentro do tubo para evitar a estimulação acidental com solução de sacarose. Isto é importante, porque as abelhas têm sido mostrados para aprender pela estimulação do tarso com succrose solução 3,21.
- Condicionamento olfativo: O número de tentativas de condicionamento, o intervalo inter-julgamento, eo ponto de tempo de teste pode ser variado, dependendo do foco do estudo 3,22.
- Alimentação: O nível de saciedade de abelhas é conhecido por afetar seu desempenho de aprendizagem e retenção de memória 3,23. Isso tem de ser tida em conta no planejamento de experimentos.
- Injecção: sacos de ar estão localizados nos 17 tórax de abelhas. Estas partes vitais do sistema respiratório são necessários para a sobrevivência. Assim, cuidados devem ser tomados para não danificar os sacos de ar durante a injeção. A liberação de bolhas de ar indica danos ao sacos aéreos.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por uma doação do Ministério Federal Alemão de Educação e Pesquisa (BMBF) dentro do foco Bernstein: base neuronal da Aprendizagem (BFNL) para DE Agradecemos Randolf Menzel de valiosos comentários sobre uma versão anterior do manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Syringe Omnifix 20 ml | B. Braun Medical | 4616200 V | |
| White refined household sugar | Kaisers Supermarket, Berlin, Germany | ||
| Clove oil | Bombastus, Freital, Germany | ||
| Multipette plus | Eppendorf | 4981 000.019 | |
| Rack for 30 bee tubes | Home made | ||
| Plastic tubes | Home made | ||
| UV light-permeable plexiglass pyramid | Home made | height = 30cm,apex 3.5 x 3.5cm,base 18x18cm | |
| Sticky tape | Tesa, Hamburg, Germany | ||
| Capillator sticks 1-5μl | Selzer | ||
| Capillator tips 1-5μl | Selzer | ||
| Filter paper 0.16-0.2 mm thick | Macherey-Nagel | MN 616 or MN615 | Adjusted to circular pieces with a 1.3 cm diameter |
| Disposable hypodermic needle | B. Braun Medical | 4657683 | 0.45 mm diameter |
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