Summary
Vi visar hur man ska genomföra ett beteende farmakologisk metod i en appetitive lukt luftkonditionering paradigm på honungsbin (Apis mellifera) genom systemisk tillförsel av läkemedel. Denna metod möjliggör undersökning av mekanismerna bakom inlärning och minne formation på ett enkelt och tillförlitligt sätt.
Abstract
Honungsbin (Apis mellifera) är välkända för sin kommunikation och färdigheter orientering och för deras imponerande inlärning 1,2. Eftersom överlevnaden av en honungsbinas koloni beror på exploatering av födokällor, fälthackar bin lära och memorera variabel blomma platser samt deras lönsamhet. Forager bin kan lätt tränas i naturliga miljöer där de grovfoder på en utfodring webbplats och läs tillhörande signaler som t ex lukt eller färg. Appetitive associativ inlärning kan också studeras under kontrollerade förhållanden i laboratoriet genom konditionering av snabel förlängningen respons (PER) av individuellt utnyttjas honungsbin 3,4. Detta lärande gör det möjligt att studera neuronala och molekylära mekanismer som ligger bakom inlärning och minne formation på ett enkelt och mycket tillförlitligt sätt 5-12. Ett beteende farmakologi metod används för att studera molekylära mekanismer. Droger är injiceras systemiskt att störa funktionen av specifika molekyler under eller efter inlärning och minne bildning 13-16.
Här visar vi hur man tränar tillvara honungsbin i Per konditionering och hur man ansöker droger systematiskt genom injektion i binas flygning muskeln.
Protocol
1. Fånga Bin från bikupan
- En dag innan försöket startar, mellan 2 och 4 pm, är bin lämnar bikupan fast. För att göra det ett UV-ljus-permeabla plexiglas pyramid (höjd = 30 cm, Apex 3,5 x 3, 5 cm, botten 18 x 18 cm), vilket är förslutbar vid spetsen och basen, hålls på en 20 - 30 cm avstånd framför bikupa entré med basen öppna och spetsen stängda så att bin lämnar bikupan in i botten av pyramiden. Basen är då stängd och fångade bin förs in i labbet för vidare hantering.
2. Överföra Bin från pyramiden Into glasflaskor
- I labbet är pyramiden placeras på sin bas. Väggarna av pyramiden är mörklagt (t.ex. med en handduk) men spetsen är inte täckas. På grund av deras positiva phototaxis kommer bina lämna pyramiden genom spetsen när de öppnas. En efter en, är bina flyttas från pyramiden i glasflaskor genom att hålla flaskorna över den öppna spetsen. En injektionsflaska används per bi. Därför är toppen stängd när ett bi kommer in i flaskan.
3. Utnyttja Bin i rör
- Bin är immobiliserade genom att kyla dem i glasflaskor på is 2,5-3,5 min. Det är lämpligt att titta på biet och ta bort den från isen så fort det är stilla.
- En enda immobiliserade bi tas tillvara i ett litet plaströr med tejp, så att det kan röra sin snabel sig fritt, men inte huvudet, bröstkorgen eller ben. Det är viktigt att halsen inte är komprimerad.
- Varje bee fast i ett plaströr sätts i en numrerad borrhål på ett galler för bättre hantering och identifiering. Efter det har tagits bort för konditionering eller minnet hämtning röret är alltid tillbaka till exakt samma borrhål.
4. Utfodring Bin
- På den första kvällen (4-6 pm), efter att ha fångats, är bina matas till mättnadskänsla med sackaros lösning (0,88 M, vitt raffinerat hushåll socker upplöst i kranvatten). Att mata ett bi, är dess PER framkallas genom att röra sina antenner med sackaroslösning och djuret är tillåtet att konsumera en droppe (4 mikroliter) av sackaros lösning. Bina matas en efter en tills de inte längre visar en snabb och pålitlig PER när deras antenner är vidröras med sackaroslösning.
- Vid varje efterföljande kväll (4-6 pm) av experimentet bina matas efter varandra fyra gånger med en droppe sackaroslösning (4 mikroliter, 0,88 M, vitt raffinerat socker löst i kranvatten). Det är viktigt att sackaroslösning inte smetat på biets antenner eller snabel under matning och att rören inte är förorenade med sackaroslösning. Bin ska inte matas på eller nära konditionering webbplats för att utesluta möjligheten att knyta utbildningen sammanhang med sackaros stimulans.
5. Hålla utnyttjas Bin Övernattning
- Bina hålls över natten i en plast skål i rumstemperatur. Kranvatten fylls i skålen (ca 0,5-1 cm hög). Rack med den utnyttjas bin placeras i skålen ovanför vattenlinjen med hjälp av ELISA-plattorna som plattform. Slutligen är skålen täckt med papp.
6. Olfactory Conditioning
På den första morgonen (10 am) av experimentet luktsinnet konditioneringen utförs. Den betingade stimulus (CS) är en lukt, är obetingat stimulus (US) sackaroslösning.
- 4 mikroliter av lukt (t ex kryddnejlika olja) är pipetteras på ett runt filtrerpapper (1,3 cm i diameter) som sedan sätts in i en 20 ml spruta. Lukten är pipetteras under en huva och filter tips används för att förhindra kontaminering av pipetten.
- Racket med utnyttjas bin placeras nära conditioning platsen 30 min före konditionering inleds, men på avstånd till den plats framför en avgasröret, där enstaka bin är villkorade.
- Konditionering består av tre Lottning för lukt (den betingade stimulus, CS) och sackaros lösning (obetingat stimulus, USA, 1,25 m) med en internationell rättegång intervallet (ITI) på 10 min. En akustisk signal levereras till försöksledaren via en ljudspelare gör den exakta tidpunkten för stimulans debut, stimulans offset, stimulans längd och placering. Ett förvärv rättegången börjar med en 10 sek placering av djur framför ett avgassystem. Strax före slutet av 10 sek sprutan innehåller den lukt är placerad 3 cm framför biets riktade till biets antenner. Därefter är den lukt som presenteras i 5 sekunder, genom att trycka 20 ml luft genom sprutan. Efter de första 3 sek distala flageller båda antenner är vidröras med en sackaroslösning-fuktade tandpetare och djur får slicka moistend tandpetare i 4 sek. 13 sek efter CS stimulering ändarna, bin tas ur utbildningen sammanhang och sätts tillbaka i racket. Sammanlagt en utbildning rättegången varar 28 sek.
Det är viktigt att varken biets antenner eller snabel är täckta med sackaros efter konditionering. Därför måste det säkerställas att tandpetare bara fuktas med sackaroslösning och att inga droppar av sackaroslösning form på tandpetare. - Efter konditionering av rack placeras tillbaka i skålen.
- Djurens beteende under experimentet, dvs förekomsten av PER under placeringen och CS och US presentation, övervakas och noteras av försöksledaren.
7. Minne Lagring
- Retention tester kan utföras när som helst intervall (min till dagar). Hyllan med bin är placerad nära den konditionering platsen 30 min före minnestest startar.
- Ett minne Provet består av 5 sek CS presentation utan USA: s presentation. Testet börjar med en 10 sek placering av djuret framför avgasröret. Därefter är den lukt som presenteras i 5 sek enligt ovan. Den djurets beteende, det vill säga förekomsten av PER under placeringen och CS presentationen är antecknade under experimentet.
- I slutet av experimentet snabel extention svar igen framkallas genom att trycka på antenner med sackaros lösning för att säkerställa att djuret fortfarande möjlighet att utvidga sin snabel.
8. Systemisk Injection
Den tidpunkt på systemisk injektion beror på experimentell design.
- Ett litet hål görs i cuticula den bakre delen av scutum bredvid scutal spricka ovanför flygningen muskeln 17 med hjälp av en disponibel injektionsnål (21 G).
- Använda ett glas kapillärrör är en mikroliter lösning injiceras genom hålet i cuticula in flygningen muskeln. Utbildade praktiker kan injicera ett bi var 30 sekund, vilket möjliggör en exakt tidpunkt för injektion och konditionering.
9. Utfodring Bin Under experimentet
- På kvällen (4-6 pm) efter konditionering, är bina matas efter varandra fyra gånger med en droppe sackaroslösning (4 mikroliter, 0,88 M, vitt raffinerat socker upplöst i kranvatten). Det är viktigt att sackaroslösning inte smetat på biets antenner eller snabel under matning och att rören inte är förorenade med sackaroslösning. Bin ska inte matas på eller nära konditionering webbplats för att utesluta möjligheten att knyta utbildningen sammanhang med sackaros stimulans.
10. Datainsamling och dataanalys
- Förekomst av snabel förlängningen svar under försöket övervakas. Ett bi görs positivt om det utvidgar sin snabel mellan uppkomsten av CS och presentationen av den amerikanska (under utbildning) eller under CS presentationen (under testfasen), passerar en virtuell linje mellan den öppna mandibles.
- För att ingå i analysen djur måste uppfylla två kriterier: De måste överleva hela försöket och de måste visa det obetingade snabel förlängningen svar (PER) till sackaroslösning i slutet av experimentet. Andelen av bin som visar PER vid förvärv och tester vätskeretention är plottas för varje CS presentation.
11. Representativa resultat:
Två experiment presenteras här.
I det första experimentet vi tittar på effekterna av systemisk injektion av fosfatbuffrad-saltlösning (PBS, i mm: 137 NaCl, 2,7 KCl, 10,1 Na 2 HPO 4, 1,8 KH 2 PO 4, pH 7, 2) om inlärning och långtidsminne formation. Tre grupper av bin tränades med tre CS-amerikanska ihopkopplingar med en inter-rättegång intervall om 10 min: en icke-behandlade gruppen, en grupp som injicerades med 1 mikroliter PBS 30 min före träning, och en bluff-injicerade gruppen behandlade samma sätt som PBS-injicerade gruppen men utan injicera PBS. 24 h efter träning minne testades med en CS presentation i alla tre grupperna. Andelen djur som visar betingad respons under konditioneringen ökar betydligt över de tre utbildnings studier (figur 1, ANOVA för upprepade mätningar för faktorn tid F 2378 = 340.456, p <0,05). Ingen skillnad i PER kunde observeras mellan de tre grupperna under konditionering (för upprepad mätning för faktorn grupper F2, 189 = 1299, p> 0,05 ANOVA). Detta gäller för en 24 h retention test (F2, 187 = 0752, p> 0,05) när man jämför icke-behandlade djur med PBS-injicerade och simulerad injektion-injiceras djur.
I det andra experimentet vi visar hämning av minne retention tre och fyra dagar efter träning då proteinsyntesen hämmare anisomycin (10 mm) systemiskt injicerades 30 minuter efter tre CS-USA pairings. Jämförelse av en anisomycin-injicerade koncern med ett PBS-injicerade grupp visar en signifikant skillnad mellan grupperna under djurhållningsperioden test (Fig.2, ANOVA för upprepade mätningar för faktorn gruppen F1, 94 = 8,86, p <0,05). En stor skillnad kan observeras vid minnestest på dag 3 och dag 4. Detta liknar resultaten från Wüstenberg et al. 18, som också betingade bin med tre CS-USA parningar, om än med ett annat protokoll.
Figur 1. Cuticula lesion eller injektion av PBS ändrar inte förvärv och minne lagring. Djuren var tränade med tre CS-USA ihopkopplingar (förvärv). Efter 24 timmar var minne testades (Memory Retention). Trettio minuter innan träning, var ett hål i cuticula av två grupper (lesion, PBS) och en av dessa grupper var injicerades med en mikroliter PBS (PBS). En tredje grupp som var kvar intakt (ingen behandling). Presenteras är andelen djur för varje grupp svarar på lukt presentation med en PER. En ANOVA avslöjar inte några signifikanta skillnader mellan grupperna i förvärvet fas (F2, 189 = 1,299, p> 0,05) eller i minnet retention (F2, 187 = 0,752, p> 0,05).
Figur 2. Injektion av anisomycin 40 min efter den sista CS-US para minskar minne lagring tre dagar och fyra dagar efter träning. Tränades med tre CS-USA ihopkopplingar (förvärv) och injiceras med 1 mikroliter 10 mM anisomycin (Aniso) eller 1 mikroliter PBS Djur 1 h efter den första utbildningen rättegången. Minnet testades (Memory Retention) 24 h, 48 h, 72 h och 96 h senare. Presenteras är andelen djur per grupp svara på lukt presentation med en PER. Injektion av anisomycin leder till en betydande minskning av minne retention 72 h och 96 h efter träning (F1, 94 = 8,86, p <0,05) vilket framgår av en ANOVA.
Discussion
- Fånga bin: Att samla erfarenhet bin som söker föda, är bin fångas antingen på morgonen eller på eftermiddagen, för att undvika den tid då unga bina på orienteringen flygningar 19. Fälthackar antingen samla pollen eller nektar. Skillnader mellan pollen och nektar fälthackar har observerats enligt deras socker lyhördhet och deras inlärningsförmåga 20. För att fånga bara nektar fälthackar, kan en konstgjord mat källa fylld med en sackaroslösning finnas nära bikupor och djuren kan samlas där. Pollen fälthackar återvänder till kupan kan identifieras av pollen korgar på bakbenen 20.
- Fastställande och hantering: Utökad kylning av bin på is bör undvikas eftersom det kan påverka deras förmåga att lära och för att överleva fram till slutet av försöket. Tarsi måste fastställas noggrant i röret för att undvika oavsiktlig stimulering med sackaroslösning. Detta är viktigt, eftersom bin har visat sig att lära genom böjd stimulering med succrose lösning 3,21.
- Olfactory luftkonditionering: Antalet conditioning prövningar, kan inter-rättegången intervallet och testet tidpunkt kan varieras beroende på fokus för studien 3,22.
- Föda: Den mättnadskänsla nivån av bin är känt för att påverka deras inlärning prestanda och minne retention 3,23. Detta måste beaktas vid planeringen av experiment.
- Injektion: luftblåsor finns i honungsbiet bröstkorgen 17. Dessa vitala delar av andningsorganen är nödvändiga för överlevnad. Således bör försiktighet iakttas så att inte luftblåsor under injektion. Frisläppandet av luftbubblor visar på skador i luftblåsor.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av ett bidrag från det tyska federala ministeriet för utbildning och forskning (BMBF) inom Bernstein Fokus: neurala grunden för inlärning (BFNL) till DE Vi tackar Randolf Menzel för värdefulla kommentarer på en tidigare version av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Syringe Omnifix 20 ml | B. Braun Medical | 4616200 V | |
| White refined household sugar | Kaisers Supermarket, Berlin, Germany | ||
| Clove oil | Bombastus, Freital, Germany | ||
| Multipette plus | Eppendorf | 4981 000.019 | |
| Rack for 30 bee tubes | Home made | ||
| Plastic tubes | Home made | ||
| UV light-permeable plexiglass pyramid | Home made | height = 30cm,apex 3.5 x 3.5cm,base 18x18cm | |
| Sticky tape | Tesa, Hamburg, Germany | ||
| Capillator sticks 1-5μl | Selzer | ||
| Capillator tips 1-5μl | Selzer | ||
| Filter paper 0.16-0.2 mm thick | Macherey-Nagel | MN 616 or MN615 | Adjusted to circular pieces with a 1.3 cm diameter |
| Disposable hypodermic needle | B. Braun Medical | 4657683 | 0.45 mm diameter |
References
- Menzel, R., Giurfa, M. Cognitive architecture of a mini-brain: the honeybee. Trends Cogn Sci. 5, 62-71 (2001).
- Menzel, R., Leboulle, G., Eisenhardt, D. Small brains, bright minds. Cell. 124, 237-239 (2006).
- Menzel, R. Neurobiology of comparative cognition. Kesner, R. P., Olton, D. S. , Lawrence Erlbaum Associates Publishers. Hillsday, New Jersey, Hove, London. (1990).
- Bitterman, M. E., Menzel, R., Fietz, A., Schafer, S. Classical-Conditioning of Proboscis Extension in Honeybees (Apis-Mellifera). J. Comp. Psyc. 97, 107-119 (1983).
- Menzel, R., Muller, U. Learning and memory in honeybees: from behavior to neural substrates. Annu. Rev. Neurosci. 19, 379-404 (1996).
- Menzel, R. Memory dynamics in the honeybee. Journal of Comparative Physiology A-Neuroethology Sensory Neural and Behavioral Physiology. 185, 323-340 (1999).
- Menzel, R. Searching for the memory trace in a mini-brain, the honeybee. Learn. Mem. 8, 53-62 (2001).
- Eisenhardt, D. Learning and memory formation in the honeybee (Apis mellifera) and its dependency on the cAMP-protein kinase A pathway. Animal Biology. 56, 259-278 (2006).
- Hourcade, B., Muenz, T. S., Sandoz, J. C., Rossler, W., Devaud, J. M. Long-term memory leads to synaptic reorganization in the mushroom bodies: a memory trace in the insect brain. J. Neurosci. 30, 6461-6465 (2010).
- Denker, M., Finke, R., Schaupp, F., Grun, S., Menzel, R. Neural correlates of odor learning in the honeybee antennal lobe. Eur. J. Neurosci. 31, 119-133 (2010).
- Szyszka, P., Galkin, A., Menzel, R. Associative and non-associative plasticity in kenyon cells of the honeybee mushroom body. Front Syst. Neurosci. 2, 3-3 (2008).
- Okada, R., Rybak, J., Manz, G., Menzel, R. Learning-related plasticity in PE1 and other mushroom body-extrinsic neurons in the honeybee brain. J. Neurosci. 27, 11736-11747 (2007).
- Muller, U. Prolonged activation of cAMP-dependent protein kinase during conditioning induces long-term memory in honeybees. Neuron. 27, 159-168 (2000).
- Locatelli, F., Bundrock, G., Muller, U. Focal and temporal release of glutamate in the mushroom bodies improves olfactory memory in Apis mellifera. J. Neurosci. 25, 11614-11618 (2005).
- Stollhoff, N., Menzel, R., Eisenhardt, D. Spontaneous recovery from extinction depends on the reconsolidation of the acquisition memory in an appetitive learning paradigm in the honeybee (Apis mellifera. J. Neurosci. 25, 4485-4492 (2005).
- Stollhoff, N., Eisenhardt, D. Consolidation of an extinction memory depends on the unconditioned stimulus magnitude previously experienced during training. J. Neurosci. 29, 9644-9650 (2009).
- Snodgrass, R. E. Anatomy of the honeybee. , Comstock Publishing Associates. New York. (1956).
- Wustenberg, D., Gerber, B., Menzel, R. Short communication: long- but not medium-term retention of olfactory memories in honeybees is impaired by actinomycin D and anisomycin. Eur. J. Neurosci. 10, 2742-2745 (1998).
- Vollbehr, J. Zur Orientierung junger Honigbienen bei ihrem 1. Orientierungsflug. Zool. Jb. Physiol. 79, 33-69 (1975).
- Scheiner, R., Erber, J., Page, R. E. Tactile learning and the individual evaluation of the reward in honey bees (Apis mellifera L.). J. Comp Physiol [A]. 185, 1-10 (1999).
- Sanchez, B. rito, G, M. Behavioral studies on tarsal gustation in honeybees: sucrose responsiveness and sucrose-mediated olfactory conditioning. J. Comp Physiol A Neuroethol. Sens. Neural Behav. Physiol. 194, 861-869 (2008).
- Menzel, R., Manz, G., Menzel, R., Greggers, U. Massed and spaced learning in honeybees: the role of CS, US, the intertrial interval, and the test interval. Learn. Mem. , 198-208 (2001).
- Friedrich, A., Thomas, U., Muller, U. Learning at different satiation levels reveals parallel functions for the cAMP-protein kinase A cascade in formation of long-term memory. J. Neurosci. 24, 4460-4468 (2004).
