Agar-Block Mikrokosmen für Controlled Pflanzengewebekultur Zersetzung durch aerobe Pilze

Summary

Dieses Video zeigt eine kontrollierte Umgebung Ansatz, um den Abbau von Lignocellulose Pflanzengewebe durch aerobe Pilze zu studieren. Die Fähigkeit, Nährstoffquellen und Feuchtigkeit Kontrolle ist ein wesentlicher Vorteil der Agar-Block Mikrokosmen, aber der Ansatz führt oft gemischtem Erfolg. Wir wenden uns an kritischen Fallstricke, die reproduzierbare, Low-Variabilität Ergebnisse zu erzielen.

Abstract

Die beiden wichtigsten Methoden zur Untersuchung von Pilz-biologischer Abbau von Lignocellulose pflanzlichen Geweben wurden für Holzschutzmittel-Tests (; Agar-Block Boden-Block) entwickelt. Es ist gut angenommen, dass der Boden-Block Mikrokosmen höhere Abbauraten, weniger Feuchtigkeit Probleme, geringere Variabilität unter Studien und höhere Schwellenwerte Konservierungsmittel Toxizität ergeben. Soil-Block-Test ist damit der mehr genutzt Technik und standardisiert wurde von American Society for Testing and Materials (ASTM) (Methode D 1413-07). Der Boden-Block-Design hat jedoch Nachteile, mit lokal variable Boden Quellen und bei der Begrenzung der Kontrolle von Nährstoffen externe (exogene), um die verfallende Gewebe. Diese Nachteile haben als ein Problem bei der Anwendung dieser Methode auf andere, immer beliebter Forschungsziele entwickelt. Diese modernen Zielen gehören erniedrigender Lignocellulose für Bioenergie Forschungs-, Versuchs Sanierung von co-metabolisiert Giftstoffe, die Bewertung oxidative Mechanismen und Tracking transloziert Elemente entlang Hyphen Netzwerke. Soil-Blöcke nicht geeignet genug Kontrolle in diesen Anwendungen. Ein raffiniertes Agar-Block-Ansatz notwendig ist.

Hier verwenden wir die Braunfäule Holz abbauenden Pilz Serpula lacrymans, um Holz in Agar-Block Mikrokosmen degradieren, mit tiefen Petrischalen mit Low-Calcium-Agar. Wir testen die Rolle von exogenen Gips am Zerfall in eine Zeitreihe, um den Nutzen und die erwarteten Schwankungen zeigen. Die Blöcke aus dem Single-Board-rip (Längsschnitt) bedingt sind, gewogen, autoklaviert und aseptisch eingeführt Spitze Kunststoffgitter. Fungal Impfungen sind bei jedem Block Gesicht, mit exogenen Gips added at Interfaces. Ernten sind bis zur endgültigen zerstörerischen Ernte steril. Diese Mikrokosmen sind so konzipiert, blockieren Kontakt mit Agar oder Petrischale Wände zu vermeiden. Kondenswasser wird während der Platte gießt und während der Inkubation minimiert. Schließlich ist Inokulum / Gips / Holz Abstand, aber ohne dass Kontakt minimiert. Diese weniger technische Aspekte der Agar-Block-Design sind auch die häufigsten Ursachen des Scheiterns und die wichtigste Quelle der Variabilität zwischen den Studien. Video Veröffentlichung ist daher in diesem Fall sinnvoll, und wir zeigen Low-Variabilität, qualitativ hochwertige Ergebnisse.

Protocol

Dieses Protokoll gilt für holzig und nicht verholzte Substrate, wie skizziert, sowie im Ofen oder in der Luft-getrockneten Materials. Lesen Sie das Protokoll aber zunächst vor Set-up. Es gibt mehrere Punkte angehoben, die möglicherweise zu Ihrem Studienplatz bewerben, und diese Punkte (unterstrichen) Planung erfordern. Beachten Sie auch, dass es zwei veröffentlichte Agar-Block-Methoden, die gelegentlich benutzt werden, einer der British Standard 838 und eine andere nach einer International Research Group on Wood Protection (IRG-WP) Papier von Bravery (1978) vorgelegt. Unsere ähnelt Methode 838, mit Änderungen vor allem in den Mikrokosmos Design und die Kontrolle der Agar-Medium, aber wieder, beide Ansätze werden oft vermieden durch historische Feuchtigkeitsmanagement Fragen in Holzblöcke, wodurch Sauerstoffmangel und Variabilität. Einen guten Überblick über diese Testmethoden, die Diskussion von Agar-Block-Designs, einschließlich dem 838-Standard enthält, kann in Nicholas (1973) gefunden werden.

1) Vorbereiten Mikrokosmen

Mikrokosmen für diese Versuche sind 1 cm höher (tiefer) als typische Petrischalen, zunehmende Kopfraum über Holzblöcke. Sie sind mit einem bescheidenen und exakte Menge Agar gefüllt, um absolute Mengen Nährstoffe kontrollieren, zusätzlich zu ihrer Konzentration und Holzblöcke weit weg (> 3 mm) aus dem Deckel zu halten. Der Agar in diesem Fall von Gips Tests verwendet ist ein Low-Calcium-Type A-Agar, jedoch zeigen wir repräsentative Ergebnisse über Blakeslee-Medium, das ATCC empfohlenen Medium für die Aufrechterhaltung der Test Serpula lacrymans Isolat (Wulfen: Fries) Schroeter Belastung EMPA 65 ( ATCC 32750).

Diese Konstruktion hält Pflanzengewebe entfernt von Agar, und weg von der Schüssel Deckel und Wände. Variable Benetzung von Lignocellulose-Substrate ist die zentrale Quelle für Variabilität in Agar-Block-Tests. Benetzung zu Feuchtigkeitsgehalt zu erhöhen schafft Anoxie und unterdrückt oder sogar stoppt aerobe Bioabbaubarkeit. Es schafft auch ein Problem für jeden, studieren oxidative Mechanismen von Braun-und Weißfäulepilzen verantwortlich für Holzabbau. Kondensation auf der Platte Deckel ist ein Problem, wenn der freie Wassertropfen bilden und nassen Untergrund. Ebenso werden Holz-und anderen Geweben "Docht" Wasser schnell aus Agar in Kontakt, was zu Feuchtigkeitsgehalt von über 80% (Trockengewicht. Basis) sowie die Unterbindung des aeroben Abbau. Gewebe muss aus diesen Wasser-Quellen werden distanzierte, so dass die filamentösen Pilz zu finden, verbinden und steuern Feuchtigkeit im Substrat.

1. Machen Sie genug Agar-Medien, um die gewünschte Anzahl von Petrischalen mit 20 ml Agar, jeden zu füllen. Wir verwenden fünf Wiederholungen (n = 5) pro Behandlung, bestimmt durch Power-Analyse mit früheren Ergebnissen.
2. Für Calcium-und Eisen-free Typ A-Agar, fügen wir 15 g Agar in einen 500-ml-Messkolben mit ungefähr 400 ml VE-Wasser mit 1,0 g NH ₄ NO _3, 1,0 g einbasigen KH ₂ PO _4, 0,25 g MgSO ₄ x geändert 7H ₂ O und 1,0 g Glucose. Zu der Mischung verwenden wir Stammlösungen zu Mikronährstoffen hinzuzufügen. Wir fügen 50 ul H ₃ BO ₄ (0,057 g / 100 ml) und ZnSO ₄ (0,031 g / 100 ml). Wir fügen 50 ul von MnCl ₂ (0.036 g / 100 ml), CuSO ₄ (0.039 g / 100 ml), und (NH _{4) 6} Mo ₇ O ₂₄ (0,018 g / 100 ml). Sobald Nährstoffe zugefügt, füllen Sie die Messkolben bis zur 500 ml Linie.
3. Ein typischer Calcium hinaus würde in diesem Fall 0,05 g CaCl ₂ x 2H ₂ O / 500 ml enthält. In unserem Fall verwenden wir Agar Calcium als eine Behandlung mit einer 5 mM Endkonzentration. Wir begegnen den Anstieg der Ionenstärke und Chlorid zusätzlich durch Zugabe von 5 mM NaCl zu den anderen Mikrokosmen. Ebenso nutzen wir Eisen-freien Medien für diese Demonstration, aber in Fällen, in denen Eisen enthalten ist, mischen wir 0,112 g FeSO ₄ mit 2 ml entionisiertem Wasser und 50 l dieser frische Lösung (nicht lieferbar) unmittelbar nach dem Vortexen. In allen Medien, wo Sie die Kontrolle Ergänzungen von Nährstoffen, ist es ratsam, pH vor dem Autoklavieren zu testen. Saure oder basische Zusätze (zB FeCl ₃₎ beeinflusst Erstarrung.
4. Übertragen von Medien in einen Kolben und Autoklaven das Medium bei 121 ° C und 16 bar für 20 Minuten. Wir haben nicht mehr als 500 ml Volumen (pro 1000 ml Flasche), um zu vermeiden, Agar erstarren, bevor wir alle von ihm auf die Testplatten verwalten können.
   
   (Hinweis:.. Es ist ratsam, wenn Sie alternative Medien, insbesondere minimal-Nähragar mit Zusatz von basalen Salze, zunächst sicherstellen, dass Ihre Test-Pilz wird auf ihr wachsen hohen Ionenstärken kann das Wachstum hemmen oder sogar töten Test zu isolieren)
5. Verwenden Sie ein tragbares Pipette-Hilfe und 10 ml sterile Polystyrol Pipetten auf Agar aseptisch Transfer in einem Biosicherheitswerkbank einmal Flaschen zu kühlen. Letting Medien kühl anfühlen Wichtig ist hier, um Kondensation zu minimieren. Auch Stapel Teller hoch, wie sie gegossen werden, um freies Wasser auf dem Deckel zu minimieren. Während Kondensation ist ein Ärgernis in normaler Züchtung, hier stellt ein großes Problem, wenn droplets Form und nass das Holz. Feuchtigkeitsgehalt (MC) über 80% (Trockengewicht) wird Sauerstoffmangel in den Geweben zu erstellen, zu begrenzen Zerfall durch aerobe Pilze und erhöhen die Variabilität. Berechnen Sie MC wie folgt:
   
   MC * = [(Frischgewicht x Trockengewicht) / Trockengewicht] x 100
   
   * (MC kann über 100% - dies kann eine ungerade Weg zum MC berechnen scheinen, ist aber Standard)
   1. Alternative Mikrokosmen: Wenn pflanzlichen Geweben getestet werden, die müssen vorgefräste und gesiebt werden (zB Maisstroh Stängel und Blätter zusammen) gibt es zwei Teller Optionen, die wir verwenden. Divided Petrischalen werden mit 2 oder 4 Sektionen zur Verfügung, und Agar aus Fächern mit Pulver ausgeschlossen werden. Erstarrte Agar kann auch geschnitten werden und ein Teil entfernt, um Platz für Pulver zu verlassen, aber darauf zu achten, gleich Agar Bände übrigen, wenn die Verfügbarkeit von Nährstoffen gesteuert werden soll beibehalten werden.
6. Fügen Sie großzügig geschnittenen Kunststoff Maschengitter zur Plattenoberfläche mit gründlich gewaschen und autoklaviert Gitter aseptisch zugesetzt. Wir verwenden ein Produkt, Gutter Wache (35 x 50 mm, 2 mm dick), für unsere Masche, und benutzt haben Rasterelektronenmikroskopie, um eine saubere Oberfläche nach Wasser und Seife waschen zu zeigen und zu einem Mangel an Pilz-Penetration zu zeigen. Wir hatten gemischte Erfolg mit Glasfaserfilter und mit über Blöcke direkt an entwickelte Mycel, sowohl durch Feuchtigkeitsregulierung Fragen. Sie erhalten Verfall, aber Ihr Variationskoeffizient (CV) wird hoch sein, so dass die Behandlung Vergleiche statistisch schwach. Wir verwendeten Glasstäbe zuvor, aber blockiert sind anfällig für ein Abrutschen Stangen, wenn angerempelt, so dass Blöcke in Kontakt mit Agar. Eine gute Alternative ist die komplette Kreise geschnitten, um die Platten passen, Schneiden einer Kante ab, um Inokulum unterzubringen. Im Allgemeinen schneiden Grids eine eigene fit Set-up, aber stellen Sie sicher, sie lagen ganz flach in den Petrischalen.

2) Vorbereitung 'Block' Substrate

Diese Protokolle sind für Massivholz entwickelt worden, sind aber für andere pflanzliche Gewebe anpassungsfähig. Masseverlust ist das Standardmaß für Verfall Fortschritte im Holz abgebaut Fadenpilze. So nutzt unser Ansatz otro Gewichte Pre-und Post-Zerfall zu Masseverlust zu bestimmen. Doch für jeden Bioenergieforschung, wo der Fokus auf das Pflanzengewebe Chemie ist, finden viele, dass Lufttrocknung Gewebe vorzuziehen ist. Wir zeigen hier, Protokolle für die Vorbereitung Ihres Agar-Block Kulturen im Ofen getrocknet Ausgangsmaterial zu verwenden, aber geben die alternative Informationen an der Luft trocknen und auch zu Pulver anstelle von festen Substraten verarbeiten.

1. Für diese Demonstration verwenden wir Southern Yellow Pine (SYP). SYP ist ein im Handel erhältliches Holz repräsentiert die überwiegende Mehrheit von Holz im Wohnungsbau in den USA verwendet wird, kann eines von vier Pinus-Arten werden. Non-behandeltes Holz verwendet wird und astfrei Blöcke sind aus einem einzigen rip (Längsschnitt) Schnitt entlang der Korn (19 x 19 mm). Dies minimiert chemische Variabilität in den Wald. Diese Länge ist in 19 mm ³ Blöcke geschnitten. Wir verwenden diese Größe für Boden-Block-Studien, und schneiden viele Blöcke in einer einzigen Sitzung auf dem Tisch sah.
2. Die 19 mm ³ Blöcke in Agar-Block Mikrokosmen verwendet werden sind weitere längs der Maserung gespalten, mit einem Meißel und Hammer, nicht sah. Dies macht einen rohen Block Kante nach unten auf das Kunststoffnetz, und eine glatte Oberkante zu beschriften. Label-Blöcke mit Bleistift. Wenn Sie keine Beschriftung Ihrer Substrate, sicher sein, ein System zu halten mit Proben zu entwickeln. Cut genug Blöcke zu Ihren Behandlungen zu befriedigen (wieder verwenden wir n = 5 pro Behandlung), sowie nicht-geimpften Kontrollen, die sowohl als Verunreinigung beobachtet und als Basisdaten Proben parallel bedingt dienen.
3. Für ofengetrockneten Material, Ort Proben in einem Umluftofen bei 100 ° C für 48 Stunden. Wenn an der Luft getrocknet Material erforderlich ist, Zustand der Proben in einer Kammer oder Raum mit konstanter Luftfeuchtigkeit und Temperatur. Wir verwenden 65% RH und 20 ° C, und wir in der Regel auf 10-14 Tage Konditionierung zählen, je nach Material.
4. Pre-wiegen Sie Ihre Proben anfänglichen otro oder Frischgewicht bestimmen. Mit Proben aus dem Ofen, einfach übertragen Proben in einen Exsikkator abkühlen und wägen.
   1. Alternative Lufttrocknung: Mit luftgetrocknetem Material, nehmen Sie fünf Proben (n = 5; Opfer diese nicht in Mikrokosmen verwendet werden), wiegen sie frisch, otro sie wie oben, und nach dem Trocknen erneut wiegen. Berechnen Sie einen Feuchtigkeitsgehalt Korrekturfaktor für jeden der beiden Blöcke wie folgt:
      
      MC Korrekturfaktor = Trockengewicht / Frischgewicht
      
      Beispiel: 2,46 g (trocken) / 2.68 g (frisch) = 0,918; so wird eine 3,0 g frische Block 2,75 g otro
      
      Durchschnittliche die fünf Proben an das durchschnittliche Korrekturfaktor zu erhalten. Dann wiegen alle Ihre luftgetrocknet Blöcke. Multiplizieren jeder Gewichtsklasse durch die durchschnittliche MC Korrekturfaktor ersten otro Gewichte zu bestimmen.
5. Autoclave markierten Proben bei 121 ° C und 16 psi für 1 Stunde oder länger mit größeren Proben. Dicht Folie, um die Benetzung zu minimieren.
   1. Einer Abwanderungve Sterilisation: Gamma-Strahlung kann verwendet werden, um zu sterilisieren, sofern verfügbar. Wir haben Fichten-und Buchenholz zuvor für Wirkung der Temperatur auf die Hemizellulose Verlust getestet, und fand keine, zusammen mit keine Kraft Verlust oder Farbe zu ändern. Dies kann jedoch unter Substraten und Ihre Präferenzen / Anforderungen unterscheiden und Gamma-Strahlung ist eine bewährte Alternative.
6. Für diese Demonstration, testen wir die Rolle von festen Gips (reine versus 1% FeSO ₄₎ auf den Abbau unserer Kiefer (SYP) Proben. Diese sind als Scheiben mit exakten Flächen-und Volumenberechnung gemacht, wieder auf ihre Verfügbarkeit zusätzlich zu ihrer Konzentration zu kontrollieren. Diese werden separat autoklaviert aufgenommen während der Impfung Schritt. Wir brauchen eine Scheibe für jeden Block, und wir sind um zwei Blöcke pro Petrischale zwei Ernten zu ermöglichen.

3) Beimpfen & Labeling

Impfen Agar-Block Mikrokosmen ist zeitaufwendiger als Impfen Boden-Block Gläser. Für uns, wir auf jeder Impfung unter 3 min zu zählen. Um Petrischalen mit Agar, das ist der Punkt der Zugabe für Mesh-, Holz-, eine exogene Nährstoffquellen (hier, Gips Pellets), und der Pilz. Es ist Chance für Kontamination wegen der Höhe der Zeit den Deckel geöffnet ist und die Anzahl der Besuche innerhalb gestiegen. Es gibt auch mehrere Schlüssel Fehler, die häufig in dieser Phase gemacht werden, und diese sind am besten durch die Kopplung Video mit Text bedeckt. Sehen Sie das Video.

1. In einem sterilen Biosicherheitswerkbank, montieren Ihre leeren Agarplatten, eine Quelle Platte für Ihre Pilzinokulum (wir verwenden 2-wöchigen Kulturen), Mesh-, Pflanzen-Substrat (Holz), exogene Materialien, Sharpie, Parafilm-Streifen, und Transfer-Tools. Wir Flamme sterilisieren mit 70% Ethanol, und wir nutzen einen Transfer Tool für Inokulum und Pinzetten für Blöcke und Mesh. Parafilm sollte mit einer Rasierklinge geschnitten werden, um alle Kerben an den Kanten zu vermeiden. Nicks in Parafilm zu Brüchen führen, wenn Dichtung, und dies wird Proben drängeln und erfordern re-entry.
2. Flamme Transfer-Tools oder einer Zange, bevor Sie die folgenden (in dieser Reihenfolge):
   1. Kunststoffgitter.
   2. Holz Substrat. Für unsere Demonstration werden wir zwei Holzblöcke entlang der Länge des Netzes hinzuzufügen, beide aus der gleichen ersten Block, aufgeteilt, so dass wir Daten aus der frühen und späten Ernten Paar kann war. Diese Blöcke werden Seite an Seite hinzugefügt, mit dem Korn Ende (Holz Querschnitt) mit Blick auf den Punkt der Quelle der Pilzinokulum.
   3. Exogene Materialien. Hier testen wir die Rolle der Gips am Zerfall von einem filamentösen Pilz. Deshalb wollen wir den Pilz auf diese Gips-Discs vor dem Erreichen des Holzes auftreten, und somit fügen Sie einen Gips Scheibe zwischen jedem Inokulum Punkt und Block auf der Oberseite des Gewebes. Dies bedeutet, mit 2 Scheiben pro Mikrokosmos. Nicht in Kontakt zwischen Scheiben und das Holz, sondern halten sie zu schließen.
   4. Pilzinokulum. Wir verwenden eine Nr. 4 Korkbohrer mit 7 mm Durchmesser Stecker aus 2-wk Kulturen in 20 ml Agar zu machen. Dies hilft, Inokulum Lautstärkeregelung. Für nicht-geimpften Kontrollen ist es am besten, einen Stecker aus einem sterilen Platte hinzuzufügen. Üblicherweise fügen wir diesen Stecker an den Agar, und nicht auf dem Netz. Nicht in Kontakt zwischen Inokulum und entweder die exogenen Substrate oder das Holz, aber auch hier legen sie nahe beieinander. Es gibt einen Impfstoff Plug pro Block.
      
      Hinweis: Es ist ratsam, diese Inhalte in einem Agar-Schüssel montieren, bevor Sie sicher, es wird mindestens 3 mm Kopf-Raum sein, dass es mindestens 3 mm Abstand zwischen Holzblöcke und der Deckel Wände werden, und dass Ihre Kunststoffnetz Dimensionen leicht unterbringen Ihrer Substrate.
3. Parafilm Gerichte zu versiegeln, hält ein Alkohol Flamme und mit einer Pinzette bereit. Halten Platten horizontal und wickeln Parafilm in eine glatte kontinuierliche Bewegung. Wenn Parafilm Pausen oder wenn der Inhalt drängeln, entfernen Parafilm, neu eingeben und montieren Inhalte und versuchen Sie es erneut.
4. Beschriften Sie die Schüssel Deckel mit einem Alkohol-resistenten Marker, die Kennzeichnung Blocknummern direkt über oben jeweiligen Substrate. Wir ziehen Kreise über den Gips-Discs. Da Holz zerfällt, werden Sie wahrscheinlich die Fähigkeit verlieren, die Kennzeichnung auf den Substraten zu lesen. Es ist wichtig, Schritt zu halten mit Geschirrspüler Position. Auch unterschätzen Sie nicht die Möglichkeit für einen Pilz zu erniedrigen oder zu kolonisieren Vielzahl von anderen Materialien, einschließlich Metallen.
5. Wenn Sie empfindliche Assemblage auf Ihre Masche haben, Überfahrblechen SORGFÄLTIG in den Inkubator. Wir haben nur einmal, stieß den Mülleimer der Platten gegen eine Tür Marmelade und mussten neu montieren die Platten. Nehmen Sie sich Zeit und Handlung Ihrer Route. Es ist eine einmalige Sorge, so kümmern sich diese Zeit.

4) Inkubation und Ernte

Die Platten können inkubiert, um Ihren Pilz angepasst werden, sollte aber in einem biologischen Inkubator, wenn möglich gehalten werden, um Kondensation aufgrund von Temperaturschwankungen zu vermeiden. Zeitreihe Ernten sind aseptisch, mit Ausnahme der letzten Ernte durchgeführt. Wenn diese Zwischen-Ernten sind nach Wachstum auf getander Substrate ist bezeichnend, Handhabung der Platten ist einfacher, da Hyphen Querverbindung Substraten.

1. Für unsere Demonstration, inkubieren wir Platten bei 20 ° C und im Dunkeln. In einer Woche 5 Ernte Punkt, entfernen wir die gesamte Behandlung viel, Spray jedes oben und unten mit 70% Ethanol und verwenden geflammt Pinzette Material im Inneren des Biosicherheitswerkbank entfernen.
2. Nehmen Sie Bilder vor dem Zerstören Agarplatten, die sich auf jede Morphologie oder Melanisierung.
3. Entfernen Blöcken behandelt werden wie Ihre Bedürfnisse erfordern. Benutzen Sie Ihre Finger weg rollen über Hyphen (mit Nitril-Handschuhe), aber seien Sie vorsichtig, keine verfallenen Material zu verlieren. Wir in der Regel otro Blöcke aus Aluminium wiegt Pfannen Masseverlust zu bestimmen, mit Frisch-und Trockengewichte der Kontrollen an für übermäßige wicking überwachen. Wir haben auch Label und verfolgen jede dunkelbraunen Blöcke, die eindeutig vernässt, obwohl dies sollte minimal sein nach diesem Ansatz. Masseverlust Daten hilft gauge Zerfall Fortschritte, und es ist wichtig, Daten, wenn elementare Konzentrationen im Gramm-Gewicht berechnet werden, später sind. Denken Sie auch daran, dass Prozentangaben für Statistik muss normalisiert werden. Wir berechnen wie folgt:
   
   % Masseverlust = [(Einwaage Auswaage) / Einwaage] x 100
   1. Alternative Lufttrocknung: Wenn Sie Lufttrocknung, erfordern mit Ihrem Ziel, biologisch behandeln das Material weiter, sollten Sie die Klimaanlage Regime von Abschnitt 2.3 nutzen zu überholen. Wenn Sie Masseverlust muss entscheiden, es wird ein gewisses Maß an Feuchtigkeit benötigen, ist eine Lösung, um Blöcke (oder Pulver) in einen großen und kleinen Teil aufgeteilt. Wiegen Sie beide, aber nur otro die kleine Portion. Berechnen Feuchtigkeitsgehalt Umrechnungsfaktor, wie oben, und dann gilt es, die totale frische Gewicht der kleinen + große Portionen (insgesamt Block Frischgewicht). Vor allem, wenn die Vorbehandlung Material mit einem Pilz vor Verzuckerung oder andere Prozesse, Masseverlust wird Sie mit Massenbilanz Bestimmung später und Konten-Hilfe für Kohlenhydrate durch den Pilz verbraucht.
4. Zerstören Sie die Kulturen in autoklavierbar Taschen, sondern sparen Kunststoff Stützgewebe und alle anderen Komponenten, die für den Einsatz in zukünftigen Experimenten wiederverwertet werden können.

5) Interpretation der Ergebnisse

Lignocellulose-Gewebe wird in der Regel langsamer Zerfall in Agar-Block-Designs, aber an diesem Punkt sollten Sie relativ geringe Variabilität auch bei moderaten Zerfall Ebenen haben. Sie sollten auch moderate (20-50%), nicht hoher Feuchtigkeit unter Kontrolle Gewebe.

1. Feuchtigkeitsgehalt (auf Basis des Trockengewichts) in Holz nicht gegen Pilze ausgesetzt sind typischerweise moderate rund 40% in dieser Demonstration. Dies ist vor dem Fasersättigungspunkt (FSP) der Kiefer (in der Regel rund 24%), die gibt es einige freie Wasser im Überschuß des Wassers innerhalb des lignocellulosischen sekundären Zellwand gebunden ist. Dies bedeutet auch, dass einige wicking wahrscheinlich auftritt. Eine Luftfeuchtigkeit von 100% sollte noch nicht zulassen, dass Holz MC auf die FSP überschreiten. Ihr Entwurf kann zu unterschiedlichen Ergebnissen je nach Untergrund und Mesh-Auswahl. Der Schlüssel ist, Feuchtigkeitsgehalt unter 85% oder so zu halten, auf der Basis des Trockengewichts.
2. Die Masse-% Verlust in Holz abgebaut in diesen Agar-Block Mikrokosmen ist in der Regel rund 30% nach 16 Wochen für die meisten Pilze. Für ausgewählte Pilze, in diesem Fall Serpula lacrymans, wird Pilzen voll Abbau in dieser Zeit zu erreichen,> 60% Masseverlust. S. lacrymans ist eine Braunfäule Pilz, Entfernen von kleinen Lignin, bedeutet so 62% Massenverlust in dieser Studie Zerfall ist in der Nähe oder in der Vergangenheit abgeschlossen. Weißfäulepilze löscht Lignin und Masseverlust hängt von Arten sowie als Substrat.
3. Achten Sie darauf, Hyphen Morphologie aufzunehmen. In dieser Demonstration war Hyphen Morphologie nicht von Natur aus zeigen Erfolg oder Misserfolg in einem der Behandlung, aber die Melanisierung Farben waren wichtig. Es erlaubte uns, die Rolle von Eisen als Verunreinigung in Gips beziehen sich auf ältere Studien wie Low et al. (2000), wo einheimische Materialien getestet wurden und wo diese "Rost" Einfärbung beobachtet wurde. Die Rolle von Kalzium und Eisen wurden in Low et al. (2000) diskutiert, und hier sehen wir erweiterte Verfall mit Eisen, Kalzium nicht, und eben diese rostfarbenen Hyphen.
4. Wenn Sie auf Konzentrationen von irgendetwas in dieser abgebaut Holz messen wollen, ist es am besten für Masseverlust zu normalisieren. Wenn zum Beispiel Kalzium weder importiert oder exportiert aus Holz verfallen 50%, die Konzentration auf das Gewicht bezogen, erscheint von Zeit Null bis zur letzten Ernte verdoppeln. Das ist, weil 1 g Pulver stellt nun zweimal das Holz Volumen als es auf den Zeitpunkt Null hat. Der Pilz verbraucht 50% der Matrix, abnehmender Dichte. Normalisieren einer bestimmten Konzentration (zB mmol / g) für Masseverlust wie folgt kompensiert:
   
   Normierte Konzentration = mmol / gx [1 - (% Masseverlust / 100)]
   
   Beispiel: 10 mmol / g Ca in Holz abgebaut 20%, versus 7 mmol / g zum Zeitpunkt Null.
   
   Frage: Haben Ca-Gehalt zu erhöhen während des Zerfalls?
   
   10 mmol / g ist eine scheinbare 3 mmol / g zu erhöhen, um 43% zu erhöhen, aber one Gramm Pulver von abgebauten Holz mit geringer Dichte repräsentiert nun ein größeres Volumen. Normalisierung ist erforderlich, um erste und letzte Ca-Gehalt in gleicher Holz Volumina zu vergleichen.
   
   10 x [1 x (20% / 100)] = 8 mmol / g normalisiert
   
   Antwort: Ja, das habe Ca erhöhen, aber um 14%, nicht 43%.
   
   (Die Daten können auch per Holzvolumen, mmol / cm ^3, durch Multiplikation mit Dichte ausgedrückt werden.

Abbildung 1. Agar-Block-Mikrokosmos, als bis in diese Demonstration gesetzt, vor der Inkubation.

Abbildung 2. Serpula lacrymans besiedeln Kiefernholz Blöcken ruhen auf Kunststoffnetz zu Blöcken oben Agar-Kontakt zu erheben. Das Myzel stellt eine wichtige Verbindung zwischen Holz und exogenen Nährstoff / element Quellen und Kontrolle dieser körperfremde Material Quellen in der Agar oder als feste Materialien ist ein wesentlicher Vorteil der Agar-Block-Design, im Vergleich zu Boden-Block-Design.

Abbildung 3. Mittlere% Gewichtsverlust, als Maß für Maß von Holz Zerfall von Serpula lacrymans nach 5 und 15 Wochen Inkubation mit Kiefern in Agar-Block Mikrokosmen. Behandlung wurden keine (Ca-frei), 5 mM CaCl ₂ bis Agar (CaCl ₂₎ hinzu,> 99% reinem Gips (CaSO _4), oder 1% Eisen-Fassung Gips. Protected ANOVA bedeutet Vergleiche wurden mit Tukey-Tests mit α = 0,05. Für jede Ernte, Bars unter den gleichen Buchstaben nicht signifikant verschieden. Fehlerbalken = Standardabweichung. Veröffentlicht in Schilling (2010).

Abbildung 4. Overhead Bild (A) aller fünf Wiederholungen in Woche 15 der Zerfall durch die gleichen Braunfäule Prüfpilz, Serpula lacrymans, sowie die Blöcke (B) entfernt und im Ofen getrocknet. Beachten Sie das Fehlen von Melanisierung in Ca-freie Behandlung, die Vergilbung in reines Calcium-Behandlungen, und der Rost Auftritt in Eisen-Fassung Behandlung. Die Behandlungen werden, wie in Abbildung 3 bezeichnet, wobei die Steuerung in (B) nicht-geimpften Blöcke für den Vergleich.

Abbildung 5. Overhead Bild aus einer anderen Studie mit einer höheren Eisengehalt Medium, Blakeslee ist Malzagar. Beachten Sie den Verlust beobachtet Melanisierung, verglichen mit Abbildung 4. Blocks entfernt und gewogen zeigte keine Wirkung der Behandlung auf den Gewichtsverlust. Dies wird als eine Demonstration des Einflusses von exogenen Komponenten dieser Block Studien vorgestellt. Diese Effekte würden nicht in Boden-Block jar Designs überprüfbar, wo diese exogenen Eingänge zu schwer zu kontrollieren sind.

Discussion

Mit unserem Agar-Block Set-up (Abbildung 1) Serpula lacrymans wuchs in direkten Kontakt mit dem Gips Oberflächen und in hölzernen Blöcken (Abbildung 2), was zu mehr als 60% Gewichtsverlust in der Kontrollgruppe braun-verrottete Kiefer-Blöcke (Abbildung 3 ). Diese leicht erfüllt die ASTM-Standard Ziel von> 50% Verfall, und die durchschnittliche Variationskoeffizient (C _V) in Verfall an war 0,055 16 Wochen. Diese Daten können in Schilling ⁷ veröffentlicht. Auch hier wird anderen Pilzen erfordern längere Inkubation in Agar-Block als in Boden-Block. Zum Vergleich haben wir erfolgreich ausgeführt ähnliche Entwürfe in mehreren Vergangenheit Versuche mit einer Vielzahl von anderen Pilzarten, oft mit Hilfe der Rasterelektronenmikroskopie mit Elektronen-Spektroskopie (SEM-EDS) und induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-OES), um die Verbindung mit exogenen überprüfen Substrate und Translokation von Kalzium und anderen Elementen in Holz ^8,9.

Zusätzlich zu geringe Variabilität, gibt es zwei weitere Ergebnisse, dass unsere Agar-Block-Design enthüllt. Zunächst gab es eine Wirkung der Behandlung (Abbildung 3), wo unsere Kalzium Ergänzungen, ob die Agar als CaCl ₂ oder als reine Gips, gehemmt Zerfall durch diesen Pilz. Dies ist ein brauchbares Ergebnis, weil andere Theorie haben Kalzium verbessert Verfall basierend auf Studien mit realen Materialien wie Mörtel und Putz. Stattdessen sehen wir Zerfallsraten mit dem Zusatz von Eisen in den Gips Rebound, was darauf hindeutet Eisen, Kalzium nicht, ist der Schlüssel. Die zweite brauchbares Ergebnis ist jedoch nicht quantifiziert, aber stattdessen die Farbe der Myzelien (Abbildung 4). Es gibt deutliche und offensichtliche Melanisierung Unterschiede in externen Hyphen zwischen den Behandlungen, und Forscher haben bisher "Rost" Melanisierung beachten bei der Begegnung mit diesem Pilz auf Baustoffe (zB Low et al. 2000). In unseren neueren Untersuchungen haben wir festgestellt, dass diese Effekte verloren gehen mit einer hohen Eisen-Medium (Abbildung 5). Gemeinsam schlägt er vor, dieses Pilzes Eisen, Kalzium nicht nutzt, in diesen Materialien und dass frühere Studien, mit 'Rusty' Myzelien berichtete, beobachteten Eisen-Effekt, nicht Calcium-Effekt.

Insgesamt sind diese Ergebnisse und ein Mangel an Behandlung Effekte mit High-Eisen-Agar ein sehr starker Beweis für die Kontrolle, dass die Agar-Block-Design kann der Forscher bieten, insbesondere im Hinblick auf die alternative Boden-Block-Ansatz.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Petri dishes	Nalge Nunc international	4014	25 x 150 mm
Agar, Type A	Sigma-Aldrich	A4550
Ammonium nitrate, NH4NO3	Millinckrodt	3436-12
Potassium phosphate, KH2PO4	JT Baker	3246-01
Magnesium sulfate 7-hydrate, MgSO4•7H2O	Sigma-Aldrich	230391
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	Dextrose
Boric acid, H3BO4	Mallinckrodt Baker Inc.	2549-04
Zinc sulfate 7-hydrate, ZnSO4•7H2O	Mallinckrodt Baker Inc.	8880-12
Manganous chloride 4-hydrate, MnCl2•4H2O	JT Baker	2540-04
Copper(II) sulfate 5-hydrate, CuSO4•5H2O	Sigma-Aldrich	209198
Ammonium heptamolybdate 4-hydrate, (NH4)6Mo7O24•4H2O	Sigma-Aldrich	431346
Calcium chloride dihydrate, CaCl2•2H2O	Mallinckrodt Baker Inc.	4160-12
Sodium chloride, NaCl	Mallinckrodt Baker Inc.	7581-12
Ferrous sulfate 7-hydrate, FeSO4•7H2O	Mallinckrodt Baker Inc.	5056-12
Pipet-aid	Drummond Scientific	4-000-110	Cordless EtOH the surface
10 ml sterile polystyrene pipette	BD Biosciences	357551
Gutter Guard	Thermwell Products Co.	VX620	Pre-scrubbed with soap Hardware store
Calcium sulfate hemihydrate, CaSO4•0.5H2O	Acros Organics	385355000
#4 cork borer	Boekel Scientific	1601
Parafilm "M"	Pechiney Plastic Packaging	PM-996