Summary
מבנה 3-D של מולקולה מספק הבנה ייחודית של כמה פונקציות מולקולה. השיטה העיקרית לקביעת המבנה ברזולוציה כמעט אטומי הוא רנטגן קריסטלוגרפיה. כאן, אנו להדגים את השיטות הקיימות לקבלת גבישים תלת ממדי של מקרומולקולה נתון זה מתאים לקביעת מבנה על ידי קריסטלוגרפיה בקרני רנטגן.
Abstract
באמצעות מבנה תלת ממדי של מקרומולקולות ביולוגיות להסיק כיצד הם פועלים היא אחד התחומים החשובים ביותר של הביולוגיה המודרנית. הזמינות של מבנים ברזולוציה אטומית מספק הבנה עמוקה וייחודית של תפקוד החלבון, ומסייע לפענח את אופן פעולתו של התא החי. נכון להיום, 86% חלבון נתוני הבנק (rcsb-PDB) הערכים הם מבנים macromolecular שנקבעו באמצעות קרני רנטגן קריסטלוגרפיה.
כדי לקבל גבישים מתאימים ללימודי קריסטלוגרפיים, מקרומולקולה (למשל חלבון, חומצות גרעין, חלבונים מורכבים או חלבונים מורכבים חומצת גרעין) חייבים להיות מטוהרים הומוגניות, או קרוב ככל האפשר אל ההומוגניות. ההומוגניות של התכשיר הוא גורם מפתח בהשגת גבישים כי diffract ל ברזולוציה גבוהה (Bergfors, 1999; מקפרסון, 1999).
התגבשות דורש להביא את מקרומולקולה כדי רוויה. המדגם ולכן צריך להיות מרוכזים כדי הריכוז הגבוהה ביותר האפשרית מבלי לגרום להצטברות משקעים או של מקרומולקולה (בדרך כלל 2-50 מ"ג / מ"ל). הצגת המדגם לסוכן מזרז יכול לקדם את נוקלאציה של גבישי חלבון בתמיסה, אשר עלולה לגרום תלת ממדי גבישים גדולים גדל מפתרון. ישנן שתי שיטות עיקריות להשיג גבישים: דיפוזיה אדי התגבשות אצווה. ב אדי דיפוזיה, ירידה המכיל תערובת של פתרונות נמהר וחלבון אטום בתא עם נמהר טהור. אדי מים ואז מפזרת את הירידה עד osmolarity הירידה ואת נמהר שווים (איור 1 א). התייבשות גורמת לירידה של ריכוז של חלבון איטי וגם מזרז עד שיווי המשקל מושגת, אידיאלי באזור נוקלאציה קריסטל של הדיאגרמה שלב. השיטה מסתמכת על אצווה להביא את החלבון ישירות לתוך אזור נוקלאציה על ידי ערבוב חלבון עם כמות מתאימה של נמהר (איור 1B). שיטה זו מבוצעת בדרך כלל תחת פרפין / שמן תערובת מינרלים כדי למנוע דיפוזיה של מים מתוך הירידה.
להלן נדגים שני סוגים של התקנה ניסיונית דיפוזיה אדי, תלוי ירידה ושחרר ישיבה, בנוסף התגבשות אצווה תחת שמן.
Protocol
חומרים:
- מדגם חלבון - ליזוזים (50 מ"ג / מ"ל)
- תליית 24 גם מגש ירידה
- ישיבה ירידה של 24 היטב מגש
- Microbatch התגבשות 96 מגש טוב
- התגבשות פתרונות (או מסחרי זמין או תוצרת בית)
- סיליקון גריז
- 5 מ"ל במזרק ללא Luer נעילת
- לכסות שקופיות Siliconized
- איטום אופטי קלטת
- פרפין
- 0.1-2 micropipette μL עם השמירה נמוכה טיפים
- מלקטת
- Professional מגבונים
1. תלוי / יושב נוהל Drop:
- עבור מסך ראשוני אפשר להשתמש מסכי זמין מסחרית כי לנצל את מטריצה דלילה שלם שיטה העצרת של תנאי הניסוי. מטריצה דלילה שלם שיטה עצרת מוטה על ידי נבחרים מן התנאים התגבשות ידוע מקרומולקולות (קרטר קרטר, 1979; Cudney et al, 1994;. Jancarik וקים, 1991;. Jancarik et al, 1991). אם התנאי התגבשות כבר ידוע, מסך צר ניתן להרכיב, משנים את ריכוז ה-pH נמהר סביב פגע המקורי. נמהר הכי מוצלח הוא בדרך כלל פוליאתילן גליקול (PEG), ואחריו אמוניום סולפט. ביחד, שני אלה מזרזים להסביר כ -60% מכלל מזרזים macromolecular רשמה המשמש התגבשות (Gilliland et al, 1994;. Kimber et al, 2003;.. Page et al, 2003).
- הכינו פתרונות התגבשות שלך. בדרך כלל בתנאים אלה משולבים של סוכן מזרז, מלח מסוג כלשהו ו חיץ כדי להגדיר את ה-pH. במקרים מסוימים ניתן להוסיף תוספי במיוחד עבור החלבון של עניין. פתרון כל המניות צריך להיות מסונן באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר. חלק מהפתרון המניה עשוי להיות צמיגה מאוד (50% יתדות, גליצרול, PEG-MME, וכו ').
- הכן 1.5 מ"ל של 0.6, 0.8, 1.0, 1.2, 1.4, 1.6 M NaCl כל אחד 0.1 M NaOAc pH 4.0, 4.3, 4.6 ו - 4.9 (סך של 24 פתרונות)
- הפשירי מדגם חלבון שלך ולשמור על הקרח. מניות חלבון צריך להיות מאוחסן ב -80 ° C, אלא אם כן חלבון עניין רגיש להקפיא / מחזורי ההפשרה (ואם כן, בחנות ב 4 ° C). ריכוז החלבון אופייניות הן בטווח של 5-50 מ"ג / מ"ל, עם ריכוזים גבוהים יותר בדרך כלל נותן תוצאות טובות יותר.
- ספין המדגם 15min/18, 000xg / 4 ° C - חלבונים מסוימים נוטים לצבור חלקית לזרז צעד אחרי ההפשרה. אגרגטים אלה יכולים לקדם משקעים אמורפי של שאר מולקולות חלבון ולכן ספין מטה יסודית יבטיחו לך רק מולקולות מסיסים במדגם שלך. שמור חלבון על הקרח עד הקמת מגש.
- קביעת ריכוז חלבון מן ספיגת שלה ב 280 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר UV. ריכוז החלבון ניתן לחשב מקריאת ספיגת מקדם הכחדה של החלבון. מקדם הכחדה יכול להיות מחושב באמצעות כלי ProtParam באתר Expasy: http://ca.expasy.org/tools/protparam.html
- מלאו בארות של 24 גם תלוי / יושב מגש עם ירידה של 500 μL פתרון נמהר על פי התוכנית מגש ההתקנה (תרשים 2B). צור גריז סיליקון טבעת מסביב לקצה של הבאר. הטבעת צריכה להיות פער קטן כדי למנוע הצטברות לחץ אוויר כמו כן נחרץ. בשנת טיפות ישיבה, אין צורך לשמן היטב מאז הוא חתום עם הקלטת (איור 2 א).
- קח שקופיות מכסים לנקות אותו עם תרסיס אוויר מרוכז, או מקצועי לנגב - אבק הימנעות יקל את הפרשנות של ירידה התגבשות ולמנוע זיהומים. עבור ישיבה טיפות, שקופיות לכסות לא רגילים. במקום זאת, גם מכיל מדף שעליו חלבון מזרז מעורבבים.
- שים כרכים שווה המדגם חלבון פתרון מאגר בשקופית לכסות. כמויות שונות של חלבון נמהר אולי ניסה כחלק מתהליך הייעול. שימוש יותר חלבון מאשר תוצאות נמהר בריכוז נטו של החלבון לירידה לאחר איזון, אשר יכול להיות רצוי לדלל דגימות חלבון, ו להאט נוקלאציה קריסטל או צמיחה. כל חומר נדיף אחר פתרון הירידה יהיה גם מרוכז בידי גורם אחד. כאשר pipetting החלבון פתרונות מאגר לשקופית לכסות, להיות זהיר מאוד כדי למנוע היווצרות בועה. זה בדרך כלל מתרחשת כאשר האוויר פוצצו מתוך פיפטה.
- תליית ירידה: 2 טען μL של 50 מ"ג / מ"ל ליזוזים ב-pH 0.02 NaOAc M 4.9 למרכז והחלק את הכיסוי ולהוסיף לו 2 μL הפתרון המאגר.
- יושב טיפה: טען 2 μL של פתרון ליזוזים 50 מ"ג / מ"ל למרכז המדף ולהוסיף לו 2 μL של פתרון המאגר.
- תהפכו את השקופית לכסות בעדינות ולהניח אותה על הטבעת גריז על גבי הבאר. לחץ כלפי מטה בעדינות כך שהאוויר יכול להימלט מן הבאר דרך החריץ של שומן כדי יח"צהאירוע אוויר בלחץ הצטברות היטב ולשמור אטום היטב. הצטברות לחץ האוויר בתוך הבאר יכול להעלות את השקופית לכסות, להתפשר על החותם היטב. בשיטה ירידה ישיבה, סרט שקוף ברור אופטית משמש כדי לכסות את הבארות. לפיכך, איטום בשיטה זו תתקיים כל שורה / עמודה.
- עבור אל היטב הבא עד מגש שלם.
- בדוק את המגש על ההתקנה - ביטול חלקיקי אבק זיהומים אחרים יכולים להפחית את זיהוי חיובי כוזב של גבישי חלבון.
- השתמש גיליון הניקוד לתעד את הניסוי שלך.
- מניחים את המגש בטמפרטורת הדגירה הרצויה, בדרך כלל בין 4 טמפרטורת החדר C ו-מעלות. 20 ° C הוא הכי מוצלח כלל. תשמרי על עצמך כדי להתמודד עם מגש בעדינות למנוע לרעוד. היזהר בעת פתיחת וסגירת הדלת חממה. תנודות או שינויי טמפרטורה במהלך ההעברה או הדגירה יכול למנוע הצמיחה קריסטל או להשפיע לרעה על איכות קריסטל. הלם קליטת החומר (קצף אריזה למשל) יכול לשמש ריפוד תחת מגשי קריסטל.
- בדוק את מגש עבור גבישים למחרת, ואחר כך כל כמה ימים, תמיד הטיפול מגשים עם טיפול. כל מסמך הממצאים מורפולוגיות ירידה גיליון ניקוד מסוים מגש. קריסטלים בדרך כלל לוקח 2-5 ימים להופיע, אם כי לעתים גבישים מופיעים הרבה יותר מהר (כמעט מיד) או מאוחר יותר (עד כמה חודשים!). לאחר התגבשות התנאים זוהו קצב הגידול של הגבישים ידוע, עדיף להשאיר את המגשים באין מפריע עד גבישים הופיעו גדל לפחות מחצית גודלו הסופי. השארת מגשי באין מפריע יכול להפחית את מספר האירועים נוקלאציה גביש, ומכאן לייצר מספר קטן של גבישים גדולים יותר.
2. Microbatch נוהל:
- מדגם חלבון והכנת נמהר הם כפי שתואר לעיל.
- תרסיס האוויר מגש microbatch חדש כדי למנוע אבק וחלקיקים גדולים אחרים.
- במגש microbatch, למלא שמן פרפין עד 3 מ"מ גבוה (מספיק כדי לכסות את הבארות). הסר גישה של שמן.
- טען 1 μL של פתרון חלבון (50 מ"ג / מ"ל ליזוזים) לתוך השמן מראש מילא היטב - לוודא פיפטה את הפתרון ישירות לתחתית הבאר (איור 2 א).
- טען 1 μL של פתרון נמהר לבאר על פי התוכנית מגש ההתקנה (תרשים 2B) - לוודא טיפה שוקעת לתחתית הבאר נתיכים עם טיפה את החלבון.
- העבר היטב הבא עד מגש שלם.
- בצע את שלבים 11-14 של התלייה / יושב הליך ירידה.
3. נציג תוצאות:
התגבשות נקרא בדרך כלל כמו צוואר הבקבוק של קריסטלוגרפיה בקרני רנטגן. מטריצה דלילה שלמה מסך העצרת של התנאים מזרז בדרך כלל מייצרת סוגים שונים של צבירת משקעים של חלבונים, ביניהם אחד גבישים גדולים. אם חלבון או בריכוזים גבוהים מדי נמהר אפשר לראות חומר חום עם צורה וגודל לא ברורים (משקעים אמורפי). כאשר הפתרון הוא undersaturated, הירידה לעתים קרובות יהיה ברור לחלוטין ונטול כל סוג של משקעים. איור 3 מציג מספר דוגמאות לתופעות משקעים וקריסטלים (דסאו et al. 2006). תופעות המשקעים יותר עם פרשנות מפורטת יותר ניתן למצוא בכתובת http://xray.bmc.uu.se/terese/tutorials.html .
באיור 1. עקרון התגבשות החלבון.
עקרון התגבשות החלבון. בניסוי דיפוזיה אדי (א) כמויות שוות של נמהר וחלבונים נמצאים הירידה. מים יהיה מפוזר החוצה הן נמהר ריכוז חלבון יוכפל עד שיווי משקל יושג בין ירידה לבין פתרון המאגר. ב התגבשות אצווה (ב) נמהר ריכוז החלבון אינם משנים במהלך הניסוי. פוינט - חלבון נשאר undersaturated לא יכול להיווצר גבישים, B Point - נוקלאציה חלבון להתרחש, קריסטלים החלה להיווצר ואת הריכוז של חלבון בתמיסה טיפות הרוויה. C פוינט - חלבון משקעים, אבל עדיין עשוי לצמוח גבישים. (ג) התגבשות דיאליזה באמצעות ג'ל פקוק נימי. קריסטלים להופיע מפזרת מלח מתוך המדגם חלבון (ו / או מפזרת נמהר לתוך המדגם חלבון) על פני תקע את הג'ל.
איור 2. תמציתי של ניסויים התגבשות טיפוסי חלבון.
(א) נוהלי תלוי דיפוזיה אדי ירידה, יושב דיפוזיה אדי ירידה, וחלבון התגבשות microbatch. בכל מקרה, נפח קטן של מדגם חלבון מרוכז מעורב עם נפח שווה או קטן יותר של precipitanלא פתרון מותר לאזן. (ב) התגבשות של עוף ליזוזים, מגש 24 גם מוגדר עם ריכוזים שונים של נתרן כלורי (נמהר) עם 0.1 נתרן אצטט M כמו למאגר ב PHS שונים (4.0-4.9).
איור 3. תוצאות אופייניות של ניסוי התגבשות החלבון.
(א) כמות המשקעים אמורפיים. כאשר חלבון או נמהר (או שניהם) נמצאים בריכוז גבוה. (ב) הפרדת פאזות. חלבון או אבקת רשאי להפריד לשלב שונה כאשר מעורבב עם מזרזים מסוימים בריכוז גבוה. (ג) גבישים רוד חלבון בצורת AtCSN7 שהושגו פוליאתילן גליקול 8000 ו אצטט מגנזיום (דסאו et al. 2006). (ד) גבישים ליזוזים שהושגו 1.0 M NaCl נתרן אצטט ו pH 4.9. (ה) תחת טיפות רווי בדרך כלל נשארים ברורים. צילום של משה דסאו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במאמר זה אנו מתארים ולהפגין פרוטוקולים הנוכחי כללית התגבשות החלבון. מאז אותו הליך רב שלבי יש כמה שיקולים אחד צריך להיות מודע. כאשר עובדים עם כמויות קטנות מאוד (0.5-2 μL), ייבוש הירידה עקב התאדות הוא החשש העיקרי. לפיכך, מומלץ לעבוד בסביבה מבוקר היטב (עם זרימת אוויר נמוכה, לחות גבוהה בקרת טמפרטורה הדוקה) ו לאמץ טכניקה אשר ממזער את החשיפה של ירידה אל האוויר הפתוח. מסיבה זו, חשוב לפעול בסביבה מאורגן היטב בעבודה. ריאגנטים הכל צריך להיות מוכן לקראת הקמת מגש וציוד מעבדה צריך להיות בהישג יד (pipetors, טיפים, צינורות, מגבונים וכו ').
ככלל, לקחת חלבון שלך מתוך אחסון קרוב ככל האפשר לזמן אתה תהיה הגדרת את המגש. בדרך זו, יש פחות השפעות סביבתיות על מדגם שלך. חשוב מאוד להחזיק את שפופרת חלבון בצווארו של הצינור ולא בתחתית שבו החלבון הוא, ולכן המדגם לא תקבל מחומם בטמפרטורה של הגוף שלך. עם אמצעי הזהירות לעיל, השוליים ניסיוני של שגיאה ניתן למזער, ובכך להגדיל את שחזור של התוצאות.
ישנם שינויים אפשריים רבים של פרוטוקולים המתואר כאן. אפשר לשנות את ריכוז החלבון, חלבון / יחס נמהר, טמפרטורה (4 ° C - 37 ° C), pH ותוספים שונים ניתן להוסיף. שיטה נוספת בשימוש נפוץ יחסית של התגבשות חלבון דיאליזה. בשיטה זו, הפתרון הוא חלבון dialyzed נגד פתרון נמהר דרך קרום חדיר למחצה. ניסויים דיאליזה הם מסורבלים יותר להגדיר, אבל יתרון אחד של דיאליזה היא תנאי precipitations כוח יוניים נמוך יכול בקלות להיבדק. זה רצוי אם החלבון הוא מסיס היטב מלח בריכוזים נמוכים, שכן החלבון עשויה להתגבש אז כמו מלח dialyzed הרחק למאגר חלבון. שלב מוצק (ג) ניתן להשתמש כדי לשלוט על קצב של דיאליזה. לדוגמה, ג'ל agarose בתוך נימי יכול לשמש ממשק דיפוזיה בין החלבון ופתרונות נמהר (תרשים 1C).
הגדלת הריכוז של סוכן מזרז לנקודת רוויה ממש מתחת ואז לכוון את ה-pH או טמפרטורה כדי להפחית את מסיסות של החלבון יכול לשמש כדי לגבש דגימות עם ריכוז חלבון נמוכה. שינוי של pH ניתן להשיג טוב מאוד עם טכניקה דיפוזיה אדי, כאשר חומצות ובסיסים נדיפים כגון חומצה אצטית, אמוניום הידרוקסיד או אמוניום אצטט משמשים (מקפרסון, 2004).
בטכניקה מיקרו אצווה את מערך שלם של תערובות שמן יכול להיבדק על מנת לכסות את הבארות. שמנים שונים יש permeabilities אידוי שונה, ומכאן לייצר תעריפים שונים של שינויים בריכוז של תערובת חלבונים / נמהר תחת שמן.
התגבשות היא צעד הנדרשים לצורך קבלת מידע מבניים של מקרומולקולות ברזולוציה כמעט אטום. השיטות שתוארו כאן הם אפוא היסוד ללימוד מנגנוני אנזימים או חלבונים, חומצות גרעין אינטראקציות חלבון, והם בסופו של דבר, אחד הכלים החשובים ביותר בעיצוב המבנה מבוסס התרופה פיתוח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי פרס בורוז החוקר ברוכים הבאים י"מ ועל ידי עמיתי בראון-Coxe דוקטורים מאוניברסיטת ייל MD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lysozyme | Sigma-aldrich | L6876-1G | |
| 24 well VDX Plate | Hampton research | HR3-142 | |
| 24 well Cryschem Plate | Hampton research | HR3-158 | |
| Dow Corning Vacuum Grease | Hampton research | HR3-510 | |
| Siliconized glass circle coverslides | Hampton research | HR3-231 | |
| 100% paraffin oil | Hampton research | HR3-411 | |
| 1.88 inch wide Crystal Clear Sealing Tape | Hampton research | HR3-511 | |
| 96 Well Imp@ct Plate (Microbatch plate) | Hampton research | HR3-098 |
References
- Bergfors, T. M. Protein crystallization : techniques, strategies, and tips : a laboratory manual. , International University Line. La Jolla, Calif. (1999).
- Carter, C. W., Carter, C. W. Protein crystallization using incomplete factorial experiments. J Biol Chem. 254, 12219-12223 (1979).
- Cudney, R., Patel, S., Weisgraber, K., Newhouse, Y., McPherson, A. Screening and optimization strategies for macromolecular crystal growth. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50, 414-423 (1994).
- Dessau, M., Chamovitz, D. A., Hirsch, J. A. Expression, purification and crystallization of a PCI domain from the COP9 signalosome subunit 7 (CSN7). Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 62, 1138-1140 (2006).
- Gilliland, G. L., Tung, M., Blakeslee, D. M., Ladner, J. E. Biological Macromolecule Crystallization Database, Version 3.0: new features, data and the NASA archive for protein crystal growth data. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50, 408-413 (1994).
- Jancarik, J., Kim, S. H. Sparse matrix sampling: a screening method for crystallization of proteins. J Appl Cryst. 23, 409-411 (1991).
- Jancarik, J., Scott, W. G., Milligan, D. L., Koshland, D. E., Kim, S. H. Crystallization and preliminary X-ray diffraction study of the ligand-binding domain of the bacterial chemotaxis-mediating aspartate receptor of Salmonella typhimurium. J Mol Biol. 221, 31-34 (1991).
- Kimber, M. S., Vallee, F., Houston, S., Necakov, A., Skarina, T., Evdokimova, E., Beasley, S., Christendat, D., Savchenko, A., Arrowsmith, C. H. Data mining crystallization databases: knowledge-based approaches to optimize protein crystal screens. Proteins. 51, 562-568 (2003).
- Lorber, B., Sauter, C., Theobald-Dietrich, A., Moreno, A., Schellenberger, P., Robert, M. C., Capelle, B., Sanglier, S., Potier, N., Giege, R. Crystal growth of proteins, nucleic acids, and viruses in gels. Prog Biophys Mol Biol. 101, 13-25 (2009).
- McPherson, A. Crystallization of biological macromolecules. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1999).
- McPherson, A. Introduction to protein crystallization. Methods. 34, 254-265 (2004).
- Page, R., Grzechnik, S. K., Canaves, J. M., Spraggon, G., Kreusch, A., Kuhn, P., Stevens, R. C., Lesley, S. A. Shotgun crystallization strategy for structural genomics: an optimized two-tiered crystallization screen against the Thermotoga maritima proteome. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59, 1028-1037 (2003).
