Summary
稳定同位素分析气相色谱质谱中介代谢通量的质谱分析中所述的线虫，
Abstract
稳定同位素分析早已允许在细胞和哺乳动物模型中的基因突变和/或药物疗法的代谢后果的敏感调查。在这里，我们描述了详细的方法来执行的线虫 ，线虫的中间代谢及代谢通量的稳定同位素分析。全虫，氨基酸，标记的二氧化碳，有机酸标记，标记的氨基酸分析中的稳定同位素线虫生长培养基琼脂板或青壮年开始从早期的发展，而暴露在各种药物治疗的动物的描述方法在液体培养。游离氨基酸是由高性能液相色谱法（HPLC）在整个蠕虫分装在4％高氯酸提取量化。通用标记13的C -葡萄糖或1,6 - 13彗星2 -葡萄糖利用稳定同位素前体，其标示碳质谱（大气和溶解二氧化碳）以及在代谢物通量的指示通过糖酵解追溯到丙酮酸代谢，三羧酸循环。代表结果证明野生型线虫同位素照射时间的影响，各种细菌的结算协议，并替代的蠕虫病毒破坏方法，以及同位素掺入在线粒体复合物III突变蠕虫的相对程度（ISP - 1 （qm150） ）相对于野生型蠕虫。生活线虫的稳定同位素分析中的应用提供了一种新颖的能力，以调查在整体动物水平的实时代谢是由个人的遗传性疾病和/或药物治疗引起的改建。
Protocol
协议答：中间代谢的稳定同位素分析在C 。 线虫 NGM板的发展。
*注：稳定同位素富集，可以成功地在年轻的成年线虫种群测量同位素曝光（或者普遍标记的 13 C葡萄糖或1,6 - 13 C 2葡萄糖）处于早期开发阶段，或在成年早期开始。该协议有利于动物健康，发展，标准线虫生长介质（NGM）板，这是不容易在液体培养基中实现增长的同时监测。
- 准备与线虫的生长介质的10毫升（NGM）100毫米的培养皿中，每标准技术。
- OP50 大肠杆菌蔓延NGM板大肠杆菌 1和干通宵。
- 加入500μl200毫米1,6 - 13 C 2葡萄糖（NGM板终浓度达到10毫米）均匀板。允许干通宵。
- 死神妊娠成虫1。板回收NGM板鸡蛋没有细菌或1,6 - 13 C 2葡萄糖。孵育在20 ° C过夜。
- 第二天，转移孵化，到先前与1,6传播NGM板L1被捕的幼虫- 13 C 2葡萄糖和大肠杆菌OP50 大肠杆菌 （第2步，每）。增长年轻的成年阶段（48-72小时，对应变而定）的蠕虫，照顾蠕虫不挨饿。
- 从3-4毫升S的基底板收集同步，第一天的年轻的成虫。
- 在50毫升50毫升猎鹰管基底的S.清洗的蠕虫病毒。允许5分钟的严重性颗粒蠕虫。去除上清液〜5毫升。重复洗两次。
- 估计蠕虫数量计数三个100微升2等份。调整蠕虫病毒浓度1000蠕虫毫升/ S的基础。
- 到1.5 mL塑料离心管移液器1毫升（1000蠕虫）。
- 加入69μL60％PCA的含内部标准（ε-氨基己酸）到终浓度为4％的PCA和200μmol内部标准。
- 让蠕虫比重× 5分钟解决。取出并保存在另一个管的上清液。
- 研磨蠕虫样本，使用塑料匀浆（Kontes颗粒杵）和机动演练（Kontes颗粒杵无绳汽车）15秒。通过光镜，目视确认蠕虫的破坏。如果有必要重复。
- 从步骤＃11＃12步匀浆结合转移上清。
- 离心5分钟的转速为2250（1300 XG）的样品。
- 转移上清至7毫升新鲜玻璃管。除蛋白浓度测定颗粒，在步骤＃20中进行了详细描述，在下面的。
- pH值的样本，以7-8（中性）范围内使用4N氢氧化钾。
- 在2250转速为5分钟，以去除盐类（1300 XG）7毫升玻璃管在离心机瓦解样本。
- 转移上清至7毫升新鲜玻璃管。
- 准备代谢物的定量瓦解样本：
- 高效液相色谱法（HPLC）：独立50μL样品直接注射到高效液相色谱法瓦解。游离氨基酸的定量是通过使用邻苯二甲醛和荧光检测柱前衍生高效液相色谱仪（瓦里安），如前面所述3-4。
- 气相色谱/质谱（GC / MS）：继续提取余下的瓦解使用离子交换树脂（BIO - RAD）的样品，氨基酸和有机酸的GC / MS测定同位素富集议定书D.详细
- 加入1毫升1N氢氧化钠剩余的蛋白质颗粒（步骤＃15）在7毫升玻璃管。
- 孵育氢氧化钠处理蛋白质样品在室温下旋转时（Labnet * LabRoller肩）过夜，直到溶解。
- 使用75-100μL的氢氧化钠处理过的蛋白质，以确定的标准方法（DC蛋白测定，BIO - RAD）的蛋白浓度。
协议B.稳定同位素分析在 C的中间代谢线虫液体培养的年轻人。
*注：以下的NGM板铺设鸡蛋第一天的同位素曝光开始，在成年线虫的中介代谢通量的药理作用，可研究（见协议的，上面）或液体培养。我们倾向于后一种方法，稳定同位素和药物剂的利用率，最大限度地提高成本效率。
- 稀释同步，鸡蛋第一天铺设在南基底含0.0005％胆固醇（南基底1L加入0.5 mL的1％胆固醇（溶于95％乙醇）获得）至2000年，每500μL动物青壮年。
- 成立于25 mL锥形瓶〜4毫升总量文化（S），如下：
待遇： 无 “ 药物” 南基底与胆固醇 3020微升 3020 UL - “药品”量 稳定同位素（1,6 - 13 C 2葡萄糖） 80微升 80微升 K12的大肠杆菌大肠杆菌 （外径660 2.5〜3） 400μL 400μL 年轻成虫（2000） 500μL， 500μL， 药物A（所需浓度） - 根据需要 - 盖上铝箔瓶。在20 ° C孵育平台的振动筛，摇匀，在220 RPM为24小时烧瓶。
- 确保烧瓶不完全密封，氧气是中介代谢通量和产生的内源性线虫代谢物的标签要求。
- 洗净加入4 ml培养体积46毫升的S.在50 mL锥形塑料管的基础蠕虫。允许5分钟的严重性颗粒蠕虫。真空吸上清〜5毫升仍然。重复洗注墨管与S基底两倍以上至50 mL。
- 集中洗涤蠕虫1000蠕虫/毫升1.5毫升塑料离心管。
- 加入69μL的60％高氯酸（PCA）和2μL10微米内部标准（ε-氨基己酸）实现了200μmol内部标准终浓度为4％PCA的。
- 按步骤准备样品＃11-22议定书“A.
协议的C - 1。监测跟踪标记在大气和溶解的二氧化碳的碳同位素利用在平板上的成虫。
*注：鉴于协议和B详细的方法来监视进入自由代谢物同位素掺入内蠕虫的发展或1天的成年生活2-3天，分别，在很短的时间当然的同位素掺入的成功和动力学的总确认（即，几分钟到几小时），可实现通过监控标签在大气中的二氧化碳（CO2）释放蠕虫或蠕虫提取内溶解的二氧化碳中。活猪或死亡的细菌生长板（协议的C - 1）时，可喂蠕虫。短期蠕虫同位素曝光（协议的C - 2）液体培养菌是没有必要的的。
- 准备10毫升NGM琼脂100毫米的培养皿。传播NGM的板块，无论是居住或紫外线杀死大肠杆菌OP50 大肠杆菌 （如图1所示）。使板干通宵。
- 加入500μL200毫米1,6 -标记- 13 C 2 -葡萄糖OP50传播NGM板（NGM板10毫米的最后同位素浓度） 。使板干通宵。
- 获得同步的，第一天产蛋，NGM的琼脂平板上生长的年轻成人蠕虫传播与OP50 E. 大肠杆菌 。
- 1000年轻成虫转移到实验NGM的琼脂，含有稳定同位素和 E 大肠杆菌 （每步骤＃1-2，上面编制）。
- 将实验NGM板（无盖）定制玻璃具有良好的密封3路阀室安装，以便精确的大气采样和更换。立即密封光学透明玻璃盘商会。玻璃光盘坐在板与高真空润滑脂密封，盖缝。记录时间为“0时间”。
- 样品10 mL的玻璃室的气氛，3路，20毫升注射器活塞，30，60，90和120分钟。每个大气样本转移到事先准备好的10毫升橡皮塞荣登含有1毫升0.1 N的氢氧化钠在1毫米碳酸氢钠3已真空密封的玻璃管。
- 每个玻璃容器，通过3路用20 mL注射器活塞注入10毫升空气倒流。采样/重新恢复后的气氛和恢复集合时间点之间的潜伏期之前关闭活塞室。
- 通过瓶塞成10毫升橡皮塞注入100μL20％磷酸荣登包含大气中的CO 2样品的玻璃管。
- 删除2毫升的气氛，注入12毫升的蓝顶自动取样管与大气中的CO 2测量氦预填充它。
- 天然气比质谱仪（ThermoQuest菲尼根三角洲加）分析“大气中的CO 2个样本”。
- 打开玻璃箱下面的两个小时的同位素潜伏期和收集大气样本。
- 洗净蠕虫NGM板使用3毫升S.的基础。
- 50毫升S.基础，在50毫升猎鹰管清洗的蠕虫病毒。重复洗两次。
- 集中蠕虫〜1000蠕虫/毫升7 ml圆底玻璃试管（S）。
- 真空密封橡胶塞的玻璃管。
- 添加100μL，20％磷酸释放溶解的CO 2用注射器通过橡胶塞。
- 删除2毫升的气氛，注入12毫升的蓝顶用氦气自动采样器预充溶解的CO 2测量管。
- 分析天然气比质谱仪（ThermoQuest菲尼根三角洲加）“溶解的CO 2个样品” 。
替代协议（C - 2）：监测跟踪标记在大气和溶解的二氧化碳的碳同位素利用液体培养的成虫。
- 获取同步，第一天产蛋，年轻的成年NGM琼脂扩散板与OP50 大肠杆菌生长的蠕虫大肠杆菌 。
- 洗净蠕虫在50毫升在50毫升猎鹰管S的基础。允许5分钟的严重性颗粒蠕虫。去除上清液〜5毫升。重复洗两次。
- 1000年轻成虫转移，在1毫升S.基础10 ml圆底玻璃管。加入10.1μL的1 M股票的普遍标记13的C -葡萄糖1毫升的蠕虫病毒，终浓度达到10毫米。
- 含氧圆底玻璃管含蠕虫和同位素交换与流动开管2分钟，100％的氧气气氛。立即关闭管与橡胶瓶塞。
- 在20℃孵育平台摇床摇220 RPM实验管。记录的起始时间为“时间0”。
- 样品5毫升的氛围，从10 ml圆底玻璃通过橡皮塞在30，60，90和120分钟的10 ml注射器和25号针头管。
- 每个大气样本转移到事先准备好的，橡皮塞超过10毫升含有1毫升0.1 N的氢氧化钠在1毫米碳酸氢钠3已真空密封的玻璃管。
- 每一个实验圆底玻璃蠕虫和同位素管通过橡胶瓶塞用10 ml注射器和25号针头注入5毫升空气倒流。
- 继续培养实验10毫升圆底玻璃晃动在220 RPM收集时间点之间的蠕虫和同位素管。
- 通过塞注入100μL20％磷酸含有橡胶瓶塞的气氛达到了10毫升玻璃管。
- 删除2毫升的气氛，注入12毫升蓝顶自动取样管与大气中的CO 2测量氦预填充。
- 天然气比质谱仪（ThermoQuest菲尼根三角洲加）分析“大气中的CO 2个样本”。
- 在试验期结束时，应在50毫升S.基础，在50毫升猎鹰管虫。允许蠕虫病毒颗粒形成重力。真空吸上清〜5毫升仍然。重复洗两次50毫升S.的基础。
- 集中蠕虫〜1000蠕虫/毫升7 ml圆底玻璃管。添加橡胶瓶塞和真空密封管。加入100μL20％磷酸酸，使用25号针头通过橡皮塞1 mL注射器释放的CO 2溶解蠕虫。
- 删除2毫升的气氛，注入12毫升的蓝顶用氦气自动采样器预充溶解的CO 2测量管。
- 分析天然气比质谱仪（ThermoQuest菲尼根三角洲加）“溶解的CO 2个样品” 。
协议D.加工瓦解样品A和B，氨基酸和有机酸的气相色谱/质谱分析的协议。
- 珠的制备：
- 银1银50珠1L烧杯中分别加入1 N盐酸。
- 每个烧瓶中搅拌30分钟磁力搅拌器。
- 与去离子水清洗珠10次，直到洗舱水的pH，水的pH值是相等的。
- 柱的制备：
- 只是上面最窄巴斯德枪头插入一个棉塞。
- 收取珠两列每个样品添加，填充每个柱的高度大约三分之一。使用有机酸提取AG1珠。氨基酸提取使用AG50珠。
- 样品处理：
- 加入500μL的样品与带电AG1珠列。没有被添加到的样本（见协议的步骤＃19B）在提出申请前AG1列中提取有机酸，如果样品已经在中性pH。
- 加入1 mL的0.1 N的盐酸，其余样品之前将它应用到AG50列提取氨基酸。
- 允许样品完全贯穿列。
- 直到洗涤中性（7-8 pH值范围），用水10倍的列。
- 洗脱新鲜，标记玻璃4毫升样品瓶列：
- 有机酸提取，添加3 N HCl溶液3ml的AG1列。这允许总数标示碳同位素富集的分析，3碳物种（乳酸盐），4 - 碳物种（天门冬氨酸，琥珀酸，苹果酸）之间5碳物种（谷氨酸），6碳物种（柠檬酸）。
- 氨基酸的提取：添加4个N NH 4 OH 3ML AG50列。这允许在总数标示碳3碳物种（丙氨酸）和5碳物种（谷氨酰胺）的同位素富集的分析。
- 将样品瓶Reacti VAP三蒸发，待干通宵。
E.样品Derivitization和机器设置质谱
每个样品瓶中加入50μL乙腈和N -甲基- NT -丁基二甲基三氟乙酰胺（MTBSTFA）50μL。封面，混合，并在60 ° C孵育30分钟注入气相色谱/质谱仪（GC / MS）的1％至2μL样品。
F.结果分析
- 氨基酸峰的定量。高效液相色谱法分析每个氨基酸的定量计算每个峰的相对面积使用内部标准。
- 计算同位素富集。稳定同位素富集计算每个物种在Excel（微软）根据下列公式计算：原子％以上，纠正（APE）=（R SA - R ST）* 100 / [（R SA - R ST）100]其中，R SA -样品和R ST比-标准的比例。
- 评估样品富集的统计之间的差异。学生的t -检验用来评估相对的氨基酸和同位素标签样本之间的差异的意义。
代表性的成果：
稳定同位素纳入青年成虫，测量标记的碳在大气中的CO 2的CO 2溶解蠕虫证明。无论是居住或紫外线照射的蠕虫美联储杀害 OP50大肠杆菌大肠杆菌 ，13 CO 2至12的CO 2的比例溶解蠕虫的CO 2释放的大气CO 2（图1）分数相对更大。喂养蠕虫生活或死亡OP50 大肠杆菌大肠杆菌没有明显改变洗净蠕虫提取物中测得的 13 CO 2 至 12的CO 2的比例（见C1的议定书） 。
从早期幼虫时期的稳定同位素的长时间曝光，增加中间代谢产物的同位素富集。更正确定在年轻的成年野生型蠕虫的中介代谢产物的标记碳原子的超过百分之所有谷氨酸物种更大的蠕虫被喂食时普遍标记13的C -葡萄糖和相对同样对待 动物的整个开发过程中的活细菌美联储48标记的细菌小时后，才达到产蛋成年阶段（图2）。
同位素富集的结算时间的影响。不管曝光timecourse，所有平板上生长的动物“清除”的同位素标签之前，GC / MS分析下游的准备。结算协议的比较如图2所示，其中包括2小时喂上NGM琼脂板NGM的琼脂平板上无同位素或喂养的活鲜菌2小时，细菌传播的蠕虫，和饲养无细菌NGM琼脂平板2个或6个小时。不管同位素的接触过程中，没有中间代谢产物的同位素富集，从年轻的成年全虫提取物的显着性差异，当动物平板上没有2个或6个小时的细菌清除。相比之下，少同位素富集观察中间代谢产物，当动物被随后“清除”过剩的同位素两小时喂上未标记的细菌。然而，在3增加浓缩，4，5种明显暴露时，蠕虫早期幼虫期的同位素。因此，最佳的结算协议被确定为清除蠕虫他们的孵化与稳定同位素和随后的潜伏期为2个小时就收起NGM板的细菌传播的NGM板。值得注意的是，在液体培养基中生长的蠕虫洗净三卷南基底的同位素标签和细菌（见协议乙）的洗涤物的GC / MS分析表明没有显着的同位素富集的第三洗。
蜗杆磨床，取得最大的浓缩，中间代谢产物。要优化％以下类似的待遇条件的中介代谢产物的富集，比较了超声单独或超声加磨破坏的蠕虫病毒样本。图3表明，蠕虫扰乱超声以下同位素曝光，再加上磨了大于同位素富集的样品只有通过超声扰乱。这些数据表明，通过超声磨削比扰乱分有机体分数。随后的研究发现单独没有sonicatio磨N是足够的，以达到最大的同位素富集（数据未显示）。
全虫同位素曝光许可证的中介代谢途径通量分析。在开发过程中（图4A）协议的，或在成年阶段动物的开始喂养与稳定同位素前体的蠕虫（议定书“b，图4B）允许通量的指示通过糖酵解代谢物之间的同位素富集的敏感性分析（乳酸，丙氨酸），丙酮酸新陈代谢（丙氨酸），三羧酸循环（柠檬酸，苹果酸，琥珀酸，天门冬氨酸，谷氨酸和谷氨酰胺）。普遍标记13的C -葡萄糖提供了强大的标签的所有碳物种，而利用1,6 - 13 C 2 -葡萄糖只允许每个代谢产物在1种强大的标签。这种技术可以灵敏地辨别复杂III线粒体呼吸链亚基突变ISP - 1（qm150），线粒体呼吸链的突变株，如从野生型蠕虫的中间代谢通量的差异。图5显示了绝对标签观察ISP - 1（qm150）和N2的蠕虫每24小时暴露在1,6之间的差异- 13级C的液体培养 2 -葡萄糖与K12 的大肠杆菌从第一天的大肠杆菌细菌蛋铺设年轻的成年阶段议定书“（乙） 。线粒体突变蠕虫额外的稳定同位素研究也正在进行中。
图1。普遍标记的13 C -葡萄糖稳 定同位素年轻成虫注册的CO 2 13：12的CO 2比野生型（N2）的蠕虫病毒，下面的两个小时喂养（原子％以上（APE）更正）普遍标有 13的C -葡萄糖要么紫外线灭活或活板（协议C1）OP50细菌。13彗星纳入到蠕虫的代谢产物是强大的后两个小时同位素照射。蓝色和红色长条指示（“大气中的CO 2）同位素相对富集在气相和液相（”蠕虫病毒的CO 2“），分别。
图2。从早期幼虫时期的长时间同位素曝光，随后“清除”无细菌NGM琼脂平板蠕虫增加年轻成虫谷氨酸同位素富集 。谷氨酸种同位素富集NGM琼脂平板上美联储与蠕虫普遍标记13 C -葡萄糖和OP50整个L1幼虫阶段的发展，通过年轻的成年阶段的959细胞中的细菌（“L1”，见一个议定书），或四十八个小时，刚开始的时候蠕虫达成的第一天蛋，铺设年轻成年阶段（“雅”）。 X轴表示在每个谷氨酸种标记的碳原子的总数。 Y轴表示％的浓缩铀（每超过纠正原子（APE））。绿条表示蠕虫清除喂养OP50 大肠杆菌以下同位素曝光大肠杆菌没有PCA提取前两小时，NGM的板的同位素。蓝色和灰色的酒吧表明蠕虫病毒清除NGM板下面的同位素曝光无细菌或同位素的两个或六个小时，分别为前，PCA提取。
图3。扰乱磨产量中介蠕虫的代谢产物的最大的同位素富集的蠕虫病毒。在液体培养24小时处理1,6与野生型蠕虫柠檬酸1种测量碳富集细菌（议定书二） - 13 C 2葡萄糖的百分比。黑色和灰色的酒吧表明，仅通过超声或超声破坏和研磨，分别蠕虫。同位素富集，暴露在1,6 - 13 C 2 -葡萄糖是最好的一个碳上标示的代谢产物进行评估。相比之下，标签在每个代谢产物的所有物种丰富时普遍标记 - 13 C -葡萄糖利用。
图4。代表结果表明蠕虫中介代谢物通量的指示通过糖酵解，丙酮酸代谢，三羧酸循环的同位素富集程度。校正原子％以上（APE）的决定，在年轻的成年野生型蠕虫（氮气布里斯托尔）1 6 - 13 C 2 -葡萄糖曝光是（A）从L1阶段的发展过程中板（协议），或（B）开始的第一天蛋，铺设在液体培养24小时（议定书二）青壮年。误差线表示标准偏差从三个生物复制的可靠的同位素数据是。
图5。绝对的氨基酸代谢产物，在野生型和线粒体突变蠕虫病毒株种氨基酸定量。在四个氨基酸的每个品种的绝对标签乘以高效液相色谱法确定的游离氨基酸浓度纠正原子％以上（APE）（nmol /毫克的蠕虫病毒蛋白）为每个物种。灰色和黑色的横道（氮气布里斯托尔）和线粒体复合体III亚基突变株，野生型（ISP - 1（qm150）），分别。酒吧表明，平均每株生物三个重复实验。
Discussion
应用质谱测量同位素丰度的中间代谢产物，提供了一次关键的生化改变5奇妙的详细图片。在这里，我们提供详细的协议，利用这个高度敏感和特异的方法，以评估中介代谢通量基因通用的模型动物，C. 线虫 。事实上，饲养动物活体与稳定同位素标记的代谢前体（ 如 13 C -葡萄糖）允许将中介代谢途径流量新颖的见解，测量时在下游代谢产物的同位素富集。我们已经开发出可靠的方法，获得通过糖酵解，丙酮酸代谢，三羧酸循环强大的分析通量。要做到这一点无论是在美联储稳定同位素幼体早期发育阶段的动物，或在有丝分裂后的成年期开始。可以结合全虫游离氨基酸分析研究代谢产物在不同物种的同位素富集高效液相色谱法，如前面所述4，确定在不同物种免费蠕虫丙氨酸，天门冬氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺绝对同位素富集。事实上，一贯的同位素富集，是获得在1,000至2,000个年轻的成年同步蠕虫等分测量时，氨基酸和有机酸分析物。此种方法能灵敏地歧视中介通量异常核基因为基础的线粒体突变株与野生型蠕虫。
这项技术拥有价值调查相关的具体生化途径的通量变化常见的代谢与生俱来的错误。与稳定同位素标记的葡萄糖的利用率，特别是通过线粒体疾病相关的中央的代谢途径通知碳通量。事实上，我们的数据表明，应用此种方法能灵敏地歧视中介通量异常核基因为基础的线粒体复合三亚基突变株（ISP - 1（qm150））相对于野生型蠕虫。
重要的是要认识到，由于同位素曝光超过数天完成了一个周期，量化同位素富集代表超过规定的时间内可能是在细胞模型确定的“稳定状态”浓缩的价值，而不是量化通量暴露的同位素几分钟到几小时内。另一个潜在的局限性，对线虫的发展过程中询问途径通量与幼体发育的不同长度，在发生特定的突变株。例如，许多严重的线粒体基因突变是已知的导致第三（L3）的幼虫期 6逮捕。因此，只在动物体内存活到成年的同位素掺入的分析可能无法代表整个突变人口。然而，这种方法可以适用于评估中介代谢产物在一个特定的幼虫阶段（如二级），而不是等待的动物，以达到成年阶段的同位素掺入。同样，进入另一种幼虫阶段可能作为的dauer已知的动物有明显改变（可能降低）代谢通量相对动物进行直接通过四个幼虫。未来的研究也可以进行直接评估在不同遗传背景的dauer阶段动物的同位素掺入。动物暴露到一个固定时间段开始，一旦动物达到年轻的成年阶段（在这里，24至48小时）的稳定同位素（详见协议乙）删除变量发育时期的影响。虽然只询问13的C -葡萄糖糖酵解，丙酮酸代谢和三羧酸循环的通量，其他同位素示踪剂可能被评定为通过其他途径线虫利益的生化途径通量询问。例如，15的N -甘氨酸可能被用来评估线虫氨基酸周转。
这种方法的另一个潜在的局限性代谢物检测的灵敏度水平。我们的经验表明，至少500名年轻的成年线虫需要，这里的HPLC和GC / MS方法，成功地量化同位素掺入。使用仪器具有更大的敏感性，如超高效液相色谱（UPLC），，可能会允许研究的动物数量进一步减少，尽管我们预期这是不可能的，允许可靠的定量的代谢物和同位素掺入的代谢产物种类从单一的蠕虫的。我们研究了蠕虫人口1,000元实验动物，我们发现，可靠地检测每一株低丰度代谢物。然而，如GABA的一些代谢物，只能是可靠的量化线虫更大的人口，秩序1 × 10 6动物4。
总之，稳定同位素分析提供了一种非侵入性和安全（非放射性）的方法，早已被用来研究先天性代谢缺陷。这种方法应用到 C 线虫提供了一种新的在体内，实时，发生在整体动物水平的代谢改变，这可能会导致从个人的遗传性疾病和/或药物剂风险能力进行调查。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由美国国立卫生研究院（K08 - DK073545和赞助NICHD的智力和发育残疾研究中心新研究者奖），费城基金会，宾夕法尼亚大学麦凯布奖（MJF），以及特里斯坦部分经费马伦基金（MJF和MY）。内容完全是作者的责任，并不一定代表美国国立卫生研究院的官方意见。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| S. basal | 1 - page 59 | Protocols A and B | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C-8503 | Protocol B |
| OP50 E. coli | Caenorhabditis Genetics Center | Protocols A and C | |
| K12 E. coli | Caenorhabditis Genetics Center | Protocol B | |
| NGM agar | Research Products International Corp. | N81800-1000.0 | Protocols A, B, and C |
| 13C glucose (universally labeled) | Cambridge Isotope Laboratories | CLM-1396 | Protocol A and C |
| 13C glucose (1,6 labeled) | Cambridge Isotope Laboratories | CLM-2717 | Protocol B |
| 60% Perchloric acid (PCA) | Fisher Scientific | MK2766500 | Protocols A and B |
| ε-aminocaproic acid (Internal Standard) | Sigma-Aldrich | A-2504 | Protocols A and B |
| MTBSTFA | Regis | 270243 | Protocol E |
| Acetonitrile | Regis | 270010 | Protocol E |
| AG 1-X8, 100-200, Chloride form resin | Bio-Rad | 140-1441 | Protocols A and B (organic acid extraction) |
| AG 50W-X8, 100-200, Hydrogen form resin | Bio-Rad | 142-1441 | Protocols A and B (amino acid extraction) |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S-8875 | Protocol C |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | Protocol C |
| 3N HCl | Sigma-Aldrich | 320331 | Protocol D |
| 1N HCl | Sigma-Aldrich | 320331 | Protocol A |
| 0.1 N HCl | Sigma-Aldrich | 320331 | Protocol D |
| 4N NH4OH | Sigma-Aldrich | 30501 | Protocol D |
| 4N KOH | Sigma-Aldrich | 484016 | Protocols A and B |
| Deionized water | Milli Q Biocel | ZMQA60F01 | Protocol D |
| Helium | Airgas | 24001364 | Protocol C2 |
| SMZ-800 Zoom Stereo-Microscope | Nikon Instruments | NI MNA41000 | Protocols A, B, and C |
| pH meter | Fisher Scientific | S68167 | Protocols A and B |
| Table top centrifuge - 5804R | Eppendorf | 05-400-93 | Protocols A and B |
| Incubated platform shaker | New Brunswick Scientific | M1324-0004 | Protocol B |
| Mini LabRoller Rotator | Labnet International | H-5500 | Protocols A and B |
| Pestles | Kontes Corp | K749520-0090 | Protocols A and B |
| Drill | Kontes Corp | K749540-0000 | Protocols A and B |
| 1 L glass beaker | Fisher Scientific | 02-539P | |
| 1 L Erlenmeyer Flasks | VWR international | 89000-368 | |
| 25 mL Erlenmeyer Flasks | VWR international | 89000-356 | Protocol B |
| 7ml round-bottom glass tubes + rubber stopper | VWR international | VT6431 | Protocols A, B, and C1,C2 |
| 10 ml round-bottom glass tubes + rubber stopper | VWR international | VT6430 | Protocol C2 |
| Blue top tubes | Labco | 438B | |
| 50 ml conical plastic tubes | Falcon BD | 14-959-49A | All protocols |
| 1.5 ml microfuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | Protocols A and B |
| Syringes (1 mL, 10 mL, 20 mL) | BD Biosciences | 301025, 301029, 301031 | Protocols C1 and C2 |
| 25 gauge needles | Fisher Scientific | 22-253-131 | Protocols C1 and C2 |
| Poly-Prep Chromatography Columns | Bio-Rad | 731-1550 | Protocol D |
| Pasteur pipettes | VWR international | 14673-043 | Protocol D |
| 60mm Petri dishes | VWR international | 25373-085 | Protocol C |
| Glass chamber (cut bottom of 1 L flask) fitted with grease-sealed 3-way stopcock | Custom Made | Protocol C | |
| Optically transparent glass plate | Custom Made | Protocol C | |
| Reacti-Vap III Evaporator | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 18826 | Protocol D |
| Cotton | VWR international | 14224-516 | Protocol D |
| High Vacuum Grease | Dow Corning | 1597418 | Protocol C1 |
| Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-18 | Protocol B |
| Timer | ISC Bioexpress | T-2504-5 | Protocol C |
| Gas-Ratio Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Protocol D | |
| GC-MS | Hewlett-Packard | 5980/5971 | Protocol D |
| GC-MS | Agilent Technologies | 6980N/5973N | Protocol D |
| HPLC | Varian Inc., Agilent | 9010 | Protocol D |
References
- Hope, I. A. C. elegans: A practical approach. , University Press. Oxford. (1999).
- Dingley, S. Mitochondrial respiratory chain dysfunction variably increases oxidant stress in Caenorhabditis elegans. Mitochondrion. 10, 125-136 (2010).
- Jones, B. N., Gilligan, J. P. o-Phthaldialdehyde precolumn derivatization and reversed-phase high-performance liquid chromatography of polypeptide hydrolysates and physiological fluids. Journal of chromatography. 266, 471-482 (1983).
- Falk, M. J. Metabolic pathway profiling of mitochondrial respiratory chain mutants in C. elegans. Molecular genetics and metabolism. 93, 388-397 (2008).
- Yudkoff, M. Measuring in vivo ureagenesis with stable isotopes. Molecular genetics and metabolism. 100, Suppl 1. 37-41 (2010).
- Tsang, W. Y., Sayles, L. C., Grad, L. I., Pilgrim, D. B., Lemire, B. D. Mitochondrial respiratory chain deficiency in Caenorhabditis elegans results in developmental arrest and increased life span. J Biol Chem. 276, 32240-32246 (2001).
