Summary
Stabile Isotope Profilierung mittels Gaschromatographie-Massenspektrometrie des Vermittlers Stoffwechselflusses ist in dem Fadenwurm beschrieben,
Abstract
Stabile Isotope Profiling ist seit langem sensitive Untersuchungen des metabolischen Konsequenzen der genetischen Mutationen und / oder pharmakologische Therapien in der Zell-und Säugetier-Modellen erlaubt. Hier beschreiben wir ausführlich Methoden zur stabilen Isotopen Profilierung der intermediären Stoffwechsel und Stoffwechselflusses in dem Fadenwurm Caenorhabditis elegans ausführen. Es werden Methoden zur Profilierung ganze Wurm freien Aminosäuren, markierte Kohlendioxid, markierten organischen Säuren und markierten Aminosäuren in Tiere ausgesetzt stabilen Isotopen entweder von der frühen Entwicklung von Nematoden Nährmedien Agarplatten oder Anfang als junge Erwachsene, während verschiedene pharmakologische Behandlungen ausgesetzt beschrieben in flüssiger Kultur. Freie Aminosäuren werden durch Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) in ganzen Wurm Aliquots in 4% iger Perchlorsäure extrahiert quantifiziert. Universell gekennzeichnet 13 C-Glucose-oder 1,6 - 13 C 2-Glucose als stabile Isotopen-Vorläufer, deren Bezeichnung Kohlenstoff wird durch Massenspektrometrie in Kohlendioxid (sowohl atmosphärisch und gelöst) sowie in Metaboliten bezeichnend für Fluss durch die Glykolyse zurückzuführen genutzt , Pyruvatstoffwechsels und die Tricarbonsäurezyklus. Repräsentative Ergebnisse sind enthalten, um Auswirkungen von Isotop Belichtungszeit, verschiedene bakterielle Clearing-Protokolle und alternative Wurm Aufschlussverfahren in Wildtyp-Nematoden zu demonstrieren, wie auch das relative Ausmaß der Isotopen-Aufnahme in der mitochondrialen Komplex III-Mutante Würmer (isp-1 (qm150) ) bezogen auf Wildtyp-Würmer. Anwendung von stabilen Isotopen Profilierung in lebenden Nematoden stellt eine neuartige Fähigkeit, auf das ganze Tier-Ebene in Echtzeit Stoffwechselveränderungen, die von einzelnen genetisch bedingten Erkrankungen und / oder pharmakologische Therapien verursacht wurden, sind zu untersuchen.
Protocol
Protokoll A: Stabile Isotope Profilierung der intermediären Stoffwechsel während C. elegans Entwicklung auf NGM-Platten.
* Hinweis: Stabile Isotope Anreicherung kann erfolgreich in jungen erwachsenen Nematoden Populationen werden folgende Isotop Exposition (entweder mit universell-markierten 13 C Glucose oder 1,6 - 13 C 2-Glukose) gemessen Beginn entweder in der frühen Entwicklung oder im frühen Erwachsenenalter. Dieses Protokoll ermöglicht die gleichzeitige Überwachung von Tiergesundheit, Entwicklung und Wachstum auf Standard-Nematoden Nährmedien (NGM)-Platten, die nicht so leicht ist in flüssiger Kultur erreicht.
- Bereiten Sie 100 mm Petrischalen mit 10 ml Nematoden Nährmedien (NGM), per Standard-Technik. 1
- Verbreiten Sie NGM-Platten mit OP50 E. coli 1 und damit über Nacht trocknen.
- Add 500 ul 200 mM 1,6 - 13 C 2 Glucose (bis zu einer Endkonzentration von 10 mM auf NGM Platte zu erreichen) gleichmäßig auf den Teller. Lassen Sie über Nacht trocknen.
- Bleach gravid erwachsenen Würmer 1. Platte wieder Eier auf NGM Platten ohne Bakterien oder 1,6 - 13 C 2 Glukose. Inkubation bei 20 ° C über Nacht.
- Am nächsten Tag, Transfer geschlüpft, L1-Larven verhaftet auf NGM-Platten zuvor mit 1,6 verbreitet - 13 C 2-Glukose und OP50 E. coli (pro Schritt # 2, oben). Wachsen Würmer jungen erwachsenen Stadium (48-72 Stunden, je nach Stamm), nicht kümmern Würmer nicht verhungern.
- Sammeln Sie synchron, den ersten Tag jungen erwachsenen Würmer aus Platten mit 3-4 ml S. Basal.
- Wash Würmer in 50 ml S. Basal in 50 mL Falcon-Röhrchen. Lassen Würmer Pellets durch die Schwerkraft für 5 Minuten. Überstand entfernen zu ~ 5 mL. Wiederholen Sie waschen zweimal.
- Estimate Wurm Anzahl durch Zählen drei 100 ul Aliquots 2. Passen Wurm Konzentration zu 1000 Würmern / ml S. basal.
- Je 1 mL (1000 Würmer) in ein 1,5 ml Kunststoff-Zentrifugenröhrchen.
- Add 69 ul von 60% PCA mit internem Standard (ε-Aminocapronsäure) bis zu einer Endkonzentration von 4% PCA und 200 pmol des internen Standards.
- Lassen Würmer durch die Schwerkraft x 5 Minuten absetzen. Entfernen Sie und speichern Sie den Überstand in ein anderes Rohr.
- Grind-Wurm Proben unter Verwendung von Kunststoff-Homogenisator (Kontes Pellet Pestle) und motorisierte Bohrer (Kontes Pellet Pestle Cordless Motor) für 15 Sekunden. Optisch bestätigen Wurm Störungen durch Licht-Mikroskopie. Bei Bedarf wiederholen.
- Übertragen Sie den Überstand aus Schritt Nr. 11 mit Homogenat aus Schritt Nr. 12 zu kombinieren.
- Centrifuge Probe bei 2250 rpm (1300 xg) für 5 Minuten.
- Überstand in frische 7 mL Glasröhrchen. Speichern Pellet für Proteinkonzentration Assay, wie in Schritt # 20 detaillierte, unten.
- pH Proben 7-8 (neutral) Bereich mit 4N KOH.
- Centrifuge neutralisiert Proben in 7 mL Glasröhrchen bei 2250 rpm (1300 xg) für 5 Minuten, um Salze zu entfernen.
- Überstand in frische 7 mL Glasröhrchen.
- Bereiten Sie neutralisiert Proben für Metabolit Quantifizierung von:
- High Performance Liquid Chromatography (HPLC): Separate 50 ul neutralisierte Probe zur direkten Injektion in die HPLC. Freie Aminosäuren Quantifizierung wird durch HPLC (Varian) mit Vorsäulenderivatisierung mit o-Phthalaldehyd und Fluoreszenzdetektion, wie zuvor beschrieben 3-4 durchgeführt.
- Gaschromatographie / Massenspektrometrie (GC / MS): Fahren Sie mit Extraktion der verbleibenden neutralisiert Proben mittels Ionenaustauscher (Bio-Rad) für GC / MS Bestimmung von Isotopen-Anreicherung in Aminosäuren und organischen Säuren, wie im Protokoll D. detaillierte
- 1 ml 1 N NaOH, um die verbleibenden Proteinpellet (aus Schritt # 15) in 7 mL Glasröhrchen.
- Inkubieren Protein Probe bei Raumtemperatur NaOH-behandelten während der Rotation (Labnet * LabRoller Rotator) über Nacht bis zur Lösung.
- Verwenden 75-100 ul NaOH-behandelten Protein zu Protein-Konzentration nach üblichen Methoden (DC Protein Assay, Bio-rad) zu bestimmen.
Protokoll B. Stabile Isotope Profilierung der intermediären Stoffwechsel in C. elegans jungen Erwachsenen in flüssiger Kultur.
* HINWEIS: Pharmakologische Auswirkungen auf Vermittler Stoffwechselflusses bei erwachsenen Nematoden untersucht folgenden Isotopen Exposition ab dem ersten Tag der Eiablage entweder auf NGM-Platten werden (siehe Protokoll A, oben) oder in flüssiger Kultur. Wir bevorzugen die letztgenannte Ansatz, um die Kosteneffizienz von stabilen Isotopen und pharmakologische Agenten-Auslastung zu maximieren.
- Verdünnen Sie synchron, am ersten Tag der Eiablage jungen Erwachsenen in S. basalen enthält 0,0005% Cholesterin (erhalten durch Zugabe von 0,5 ml 1% Cholesterin (gelöst in 95% Ethanol) zu 1L S. Basal) bis 2000 Tieren pro 500 mL.
- Set up ~ 4 mL Gesamtvolumen Kultur (en) in 25 mL Erlenmeyerkolben, wie folgt:
BEHANDLUNG: NONE "Drug A" S. Basal mit Cholesterin 3020 ul 3020 UL - "Drug A" Volumen Stabile Isotope (1,6 - 13 C 2-Glukose) 80 ul 80 ul K12 E. coli (OD 660 von 2,5 bis 3) 400 ul 400 ul Young Adult Worms (2.000) 500 ul 500 ul Drug A (gewünschte Konzentration) - Je nach Wunsch - Cover-Kolben mit Folie. Schüttelkolben für 24 Stunden bei 220 rpm in 20 ° C inkubiert Plattform Schüttler.
- Stellen Sie sicher, Flaschen nicht vollständig abgedichtet, wie Sauerstoff für Vermittler Stoffwechselflusses und für daraus resultierende Kennzeichnung von endogenen Metaboliten Nematoden erforderlich ist.
- Wash Würmer durch Zugabe von 4 mL Kulturvolumen bis 46 ml S. basal in einem 50 ml konischen Kunststoffrohr. Lassen Würmer Pellets durch die Schwerkraft für 5 Minuten. Vakuum-Sauggreifer Überstand bis auf ca. 5 mL bleibt. Wiederholen Sie waschen durch Nachfüllen Rohr zweimal um 50 mL mit S. basal.
- Konzentrieren Sie sich gewaschen Würmer zu 1000 Würmern / mL in ein 1,5 ml Plastik-Zentrifugenröhrchen.
- Add 69 ul von 60% Perchlorsäure (PCA) und 2 ul 10 uM internen Standards (ε-Aminocapronsäure) bis zu einer Endkonzentration von 200 pmol internem Standard und 4% PCA zu erreichen.
- Proben nach Vorschrift vorbereiten pro Schritte # 11-22 in Protokoll A
PROTOKOLL C-1. Überwachung Isotopen-Auslastung bei erwachsenen Würmer auf Platten durch Verfolgung gekennzeichnet Kohlenstoff in der Atmosphäre und gelöstem Kohlendioxid.
* HINWEIS: Während PROTOKOLLE A und B Detail Methoden zur Isotopen-Einbau in freien Metaboliten Monitor innerhalb von Würmern über 2-3 Tage der Entwicklung oder 1 Tag im Leben eines Erwachsenen bzw. grober Bestätigung für den Erfolg und die Kinetik der Isotopen-Aufnahme über eine kurze Zeit natürlich (dh Minuten bis Stunden) kann durch die Überwachung Label Kohlendioxid in der Atmosphäre erreicht werden (CO 2) freigesetzt von Würmern oder enthalten in gelöstem Kohlendioxid im Wurm-Extrakt. Live oder abgetöteten Bakterien können Würmer gefüttert werden, wenn sie auf Platten (PROTOKOLL C-1) gewachsen. Bakterien ist nicht für kurzfristige Isotop Exposition von Würmern in flüssiger Kultur (PROTOKOLL C-2) erforderlich.
- Bereiten Sie 100 mm Petrischalen mit 10 ml NGM-Agar. Verbreiten Sie NGM-Platten mit entweder live oder UV-getötet OP50 E. coli (wie in Abbildung 1 gezeigt). Lassen Platten über Nacht trocknen.
- Add 500 ul 200 mM 1,6-beschriftet-13 C 2-Glukose zu OP50 Verbreitung NGM-Platten (für die endgültige Isotop-Konzentration von 10 mM auf NGM-Platte). Lassen Platten über Nacht trocknen.
- Erhalten synchron, am ersten Tag der Eiablage, verteilt jungen erwachsenen Würmer auf NGM-Agar-Platten aufgewachsen nur mit OP50 E. coli.
- Transfer 1000 junge erwachsene Würmer zu experimentellen NGM-Agarplatten mit stabilen Isotopen und E. coli (hergestellt wie pro Schritte # 1-2, oben).
- Legen experimentellen NGM-Platte (ohne Deckel) in benutzerdefinierte Glas Kammer mit gut verschlossen 3-Wege-Hahn ausgestattet, um präzise Atmosphäre Probenahme und Austausch zu ermöglichen. Unmittelbar Dichtungskammern mit optisch transparenten Glasscheibe. Decknaht wo Glasscheibe sitzt auf Teller mit Hochvakuumfett zu versiegeln. Rekordzeit als "Time 0".
- Probe 10 ml Atmosphäre aus Glas Kammer durch 3-Wege-Hahn mit einem 20-ml-Spritze bei 30, 60, 90 und 120 Minuten. Übertragen Sie jede atmosphärische Probe auf eine vorbereitete 10 mL Gummistopfen gekrönt Glasröhrchen mit 1 ml 1 mM NaHCO 3 in 0,1 N NaOH, die Vakuum versiegelt.
- Injektion von 10 ml Luft wieder in jedes Glas Kammer durch 3-Wege-Hahn mit einer 20 ml-Spritze. Close-Hahn an die Kammer nach der Probenahme / fuehrte Atmosphäre und vor der Wiederaufnahme der Inkubation zwischen Sammlung Zeitpunkten.
- Inject 100 ul von 20% Phosphorsäure durch Stopfen in 10 mL Gummistopfen gekrönt Glasröhrchen mit atmosphärischen CO 2-Probe.
- Nehmen Sie 2 mL der Atmosphäre und spritzen sie in 12 mL blau-Top-Autosampler Rohren mit Helium für atmosphärisches CO 2-Messung vorgefüllt.
- Analyze "atmosphärischen CO 2-Proben" von Gas-Massenspektrometer (Finnigan Thermoquest Delta Plus).
- Öffnen Glaskammern folgenden 2 Stunden Isotop Inkubationszeit und Sammlung aller atmosphärischen Proben.
- Wash Würmer aus der NGM-Platten mit 3 ml S. basal.
- Wash Würmer in 50 mL S. basal in 50 mL Falcon-Röhrchen. Wiederholen Sie waschen zwei weitere Male.
- Konzentrieren Sie sich Würmer ~ 1000 Würmern / mL in 7 mL Rundkolben Glasrohr (s).
- Vakuumdichtung Glasrohr mit Gummistopfen.
- 100 lvon 20% Phosphorsäure durch Gummistopfen mit Spritze Release gelösten CO 2.
- Nehmen Sie 2 mL der Atmosphäre und injizieren in 12 mL blau-Top-Autosampler Rohren mit Helium gelösten CO 2-Messung vorgefüllt.
- Analyze "gelöstes CO 2 Proben" von Gas-Massenspektrometer (Finnigan Thermoquest Delta Plus).
Alternative Protocol (C-2): Monitoring Isotopen-Auslastung bei erwachsenen Würmern in flüssiger Kultur durch Verfolgung gekennzeichnet Kohlenstoff in der Atmosphäre und gelöstem Kohlendioxid.
- Erhalten synchron, am ersten Tag der Eiablage, jungen erwachsenen Würmer auf NGM-Agar-Platten mit OP50 E. verbreitet angebaut coli.
- Wash Würmer in 50 ml S. basal in 50 mL Falcon-Röhrchen. Lassen Würmer Pellets durch die Schwerkraft für 5 Minuten. Überstand entfernen zu ~ 5 mL. Wiederholen Sie wäscht zweimal.
- Transfer 1000 junge erwachsene Würmer in 1 mL S. basal bis 10 ml Rundboden-Glasrohr. Add 10,1 ul 1 M Bestand an allgemein-markierten 13 C-Glucose in 1 ml Würmer Endkonzentration von 10 mM zu erreichen.
- Oxydieren das Rundboden-Glasröhrchen mit Würmern und Isotop durch den Austausch von Atmosphäre mit fließendem 100% Sauerstoff in offenen Rohr für 2 Minuten. Unmittelbar in der Nähe Rohr mit Gummistopfen.
- Schütteln experimentellen Röhren in 20 ° C inkubiert Plattform Schüttler bei 220 Umdrehungen pro Minute. Rekord Startzeit wie "Time 0".
- Probe 5 ml Atmosphäre aus 10 ml Rundboden-Glasrohr mit einem 10-ml-Spritze und 25-Gauge-Nadel durch den Gummistopfen mit 30, 60, 90 und 120 Minuten.
- Übertragen Sie jede atmosphärische Probe auf eine vorbereitete, Gummistopfen gekrönt 10 mL Glasröhrchen mit 1 ml 1 mM NaHCO 3 in 0,1 N NaOH, die Vakuum versiegelt.
- Inject 5 ml Luft in jeder experimentellen Rundboden-Glasröhrchen mit Würmern und Isotop durch Gummistopfen mit einem 10-ml-Spritze und 25-Gauge-Nadel.
- Fortsetzen der Inkubation von experimentellen 10 mL Rundkolben Glasröhren mit Würmern und Isotop durch Schütteln bei 220 rpm zwischen Sammlung Zeitpunkten.
- Inject 100 ul von 20% Phosphorsäure durch Anschlag in die Atmosphäre mit Gummistopfen gekrönt 10 mL Glasröhrchen.
- Nehmen Sie 2 mL der Atmosphäre und injizieren in 12 mL blau-Top-Autosampler Rohren mit Helium für atmosphärisches CO 2-Messung vorgefüllt.
- Analyze "atmosphärischen CO 2-Proben" von Gas-Massenspektrometer (Finnigan Thermoquest Delta Plus).
- Am Ende der experimentellen Phase, waschen Würmer in 50 mL S. basal in 50 mL Falcon-Röhrchen. Lassen Wurm Pellet durch die Schwerkraft zu bilden. Vakuum-Sauggreifer Überstand bis auf ca. 5 mL bleibt. Wiederholen Sie waschen, indem zweimal in 50 ml S. basal.
- Konzentrieren Sie sich Würmer ~ 1000 Würmern / mL in 7 mL Rundkolben Glasröhre. Add-Gummistopfen und Vakuumdichtung Röhre. Geben Sie 100 ul 20% ige Phosphorsäure mit einer 1 ml Spritze mit einer 25-Gauge-Nadel durch den Gummistopfen aufgelöst Wurm CO 2-Freisetzung.
- Nehmen Sie 2 mL Atmosphäre und injizieren in 12 mL blau-Top-Autosampler Rohren mit Helium gelösten CO 2-Messung vorgefüllt.
- Analyze "gelöstes CO 2 Proben" von Gas-Massenspektrometer (Finnigan Thermoquest Delta Plus).
Protokoll D. Verarbeitung neutralisiert Proben von Protokolle A und B für Aminosäuren und organischen Säuren Analyse mittels Gaschromatographie / Massenspektrometrie.
- Bead Zubereitung:
- Add 1 N HCl auf beide Ag 1 und Ag 50 Perlen separat in 1L Becher.
- Stir jedem Kolben für 30 Minuten mit Magnetrührer.
- Wash Perlen mit entionisiertem Wasser 10 Mal, bis pH-Wert von Waschungen gleich pH-Wert des Wassers sind.
- Column Zubereitung:
- Legen Sie eine Wattestopfen knapp oberhalb der engsten Stelle des Pasteur Pipette.
- Add geladenen Kugeln zu je zwei Spalten pro Probe, stopfen sich gegenseitig zu etwa einem Drittel der Säulenhöhe. Verwenden Sie AG1 Perlen für organische Säure-Extraktion. Verwenden Sie AG50 Perlen für Aminosäure-Extraktion.
- Sample Processing:
- Add 500 ul der Probe auf die Säule mit geladenen AG1 Perlen. Nichts ist zu der Probe gegeben (siehe Protokoll A, Schritt # 19B), bevor es auf AG1 Spalte zur organischen Säuren zu extrahieren, wenn die Probe bereits bei neutralem pH.
- 1 ml 0,1 N HCL auf die verbleibenden Probe, bevor es auf die AG50 Spalte, um Aminosäuren zu extrahieren.
- Werden die Proben auf komplett durchlaufen Spalten.
- Wash Säule mit Wasser 10 Mal, bis Waschungen neutral sind (7-8 pH-Bereich).
- Eluieren Spalten an die frische, beschriftet Glas 4 mL Probenfläschchen:
- Für Organic Acid-Extraktion, fügen Sie 3 ml 3 N HCl auf AG1 Spalte. Dies ermöglicht eine Analyse der Isotopen-Anreicherung in der Gesamtzahl der markierten Kohlenstoffatome unter 3-Kohlenstoff-Spezies (Laktat), 4-Kohlenstoff-Spezies (Aspartat, Succinat, Malat),5-Kohlenstoff-Spezies (Glutamat) und 6-Kohlenstoff-Spezies (Citrat).
- Für die Aminosäure-Extraktion: add 3 ml 4 N NH 4 OH auf AG50 Spalte. Dies ermöglicht eine Analyse der Isotopen-Anreicherung in der Gesamtzahl der markierten Kohlenstoffatome unter 3-Kohlenstoff-Spezies (Alanin) und 5-Kohlenstoff-Spezies (Glutamin).
- Legen Sie die Probengefäße in Reacti-Vap III Verdampfer über Nacht, bis es trocken.
E. Beispiel Derivatisierung und Geräteeinstellungen für Massenspektrometrie
Dann werden 50 ul Acetonitril und 50 ul N-Methyl-nt-Butyldimethylsilyl trifluoracetamid (MTBSTFA) zu jeder Probe Durchstechflasche. Cover, mischen und inkubieren für 30 Minuten bei 60 ° C. Inject 1-2 ul pro Probe in der Gaschromatographie / Massenspektrometrie (GC / MS).
F. Analyse der Ergebnisse
- Die Quantifizierung der Aminosäure Gipfel. Die Quantifizierung der einzelnen Aminosäuren durch HPLC-Analyse wird anhand der Fläche der einzelnen Peaks relativ zu der des internen Standards.
- Berechnung Isotopenanreicherung. Stabile Isotopenanreicherung ist in Excel (Microsoft) für jede Art berechnet sich nach folgender Formel: Atom Prozent Excess, korrigiert (APE) = (R sa-R st) * 100 / [(R sa-R st) +100] wo R sa - Ratio der Probe und R st - Ratio der Norm.
- Die Beurteilung statistischen Unterschiede zwischen Probe Bereicherung. Student-t-Test dient zur Bedeutung der relativen Aminosäure und Isotopenmarkierung Unterschiede zwischen den Proben zu beurteilen.
Repräsentative Ergebnisse:
Stabile Isotope in jungen erwachsenen Würmer gut eingearbeitet, wie durch markierte Kohlenstoff in der Atmosphäre CO 2 gelöst und Wurm CO 2 gemessen belegt. In Würmern gefüttert lebend oder UV-Bestrahlung getötet OP50 E. coli, wurde das Verhältnis von 13 CO 2 bis 12 CO 2 mehr in der gelösten Wurm CO 2-Anteil in Bezug auf die freigegebenen atmosphärischen CO 2 (Abbildung 1). Feeding Würmer leben oder getötet OP50 E. coli nicht signifikant verändern die gemessenen 13 CO 2 bis 12 CO 2-Verhältnis in gewaschen Wurm-Extrakt (siehe Protokoll C1).
Länger andauernde Einwirkung von stabilen Isotopen aus dem frühen Larvenstadium Zeitraum um Isotopenanreicherung in Vermittler Metaboliten. Korrigierte Atoms Prozent Excess von markiertem Kohlenstoff im Vermittler Metaboliten von jungen Erwachsenen Wildtyp-Würmern bestimmt war größer in allen Glutamat Arten bei Würmern gefüttert wurden universell-markierten 13 C-Glucose und lebenden Bakterien während der gesamten Entwicklung in Bezug auf ähnlich behandelt Tiere verfüttert markierten Bakterien für 48 Stunden nur nach Erreichen der Eiablage erwachsenen Stadium (Abbildung 2).
Einfluss von Clearing-Zeiten auf Isotopenanreicherung. Unabhängig von Exposition Zeitverlauf wurden alle Tiere auf den Platten gewachsen "gelöscht" von Isotopen-Label vor nachgelagerten Vorbereitung für GC / MS-Analysen. Vergleich von Clearing-Protokollen wurde durchgeführt, wie in Abbildung 2 dargestellt, einschließlich der Fütterung Würmer für 2 Stunden auf NGM-Agar-Platten mit Live-frische Bakterien ohne Isotop oder Fütterung auf NGM-Agar-Platten verteilt, ohne Bakterien für 2 Stunden und Fütterung auf NGM-Agar-Platten ohne Bakterien entweder 2 oder 6 Stunden. Unabhängig von Isotopen-Exposition war natürlich kein signifikanter Unterschied in Isotopenanreicherung in Vermittler Metaboliten von jungen, erwachsenen ganzen Wurm-Extrakt beobachtet, wenn die Tiere wurden auf Platten ohne Bakterien für entweder 2 oder 6 Stunden gelöscht. Im Gegensatz dazu war weniger Isotopenanreicherung in Vermittler Metaboliten beobachtet, wenn die Tiere wurden in der Folge "gelöscht" von überschüssigem Isotop durch die Fütterung auf unmarkierten Bakterien für 2 Stunden. Allerdings erhöhte Anreicherung in +3, +4 und +5 Art war offensichtlich, wenn Würmer wurden Isotop aus dem frühen Larvenstadium Zeitraum ausgesetzt. Deshalb wurde die optimale Clearing-Protokoll bestimmt zu sein Clearing-Würmer nach ihrer Inkubation auf NGM-Platten mit stabilen Isotopen und Bakterien durch anschließende Inkubation für 2 Stunden auf ungespreizten NGM-Platten ausgestrichen. Zu beachten ist, waren Würmer in flüssiger Kultur gezüchtet gewaschen klar von Isotopen-Label und Bakterien in drei Bänden von S. basale (siehe Protokoll B); GC / MS-Analyse von Waschungen zeigten keine signifikanten Isotopenanreicherung von der dritten Wäsche.
Worm Schleifen ergab maximale Anreicherung in Vermittler Metaboliten. Zur Optimierung Prozent Bereicherung in Vermittler Metaboliten nach ähnlichen Behandlungsbedingungen, Vergleich wurde der Wurm Proben durch Beschallung allein oder Ultraschall sowie Schleifen unterbrochen hat. Abbildung 3 zeigt, dass Würmer gestört folgenden Isotop Exposition durch Beschallung und Schleifen hatten größere Isotopenanreicherung als Proben nur durch Ultraschall aufgeschlossen. Diese Daten legen nahe, dass mehr sub-organismal Fraktionen durch Schleifen als durch Beschallung wurden gestört. Nachfolgende Studien zeigten, allein Schleifen ohne sonication war ausreichend, um eine maximale Isotopenanreicherung (Daten nicht gezeigt) zu erreichen.
Whole-Wurm Isotopen Exposition ermöglicht die Analyse der Vermittler Stoffwechselweg Fluss. Feeding lebenden Würmern mit stabilen Isotopen Vorläufer entweder während der Entwicklung (Protokoll A, Abbildung 4A) oder am Anfang in erwachsenen Stadium Tieren (Protokoll B, 4B) ermöglicht sensitive Analyse von Isotopen-Anreicherung unter Metaboliten bezeichnend für Fluss durch Glykolyse (Laktat, Alanin), Pyruvat Stoffwechsel (Alanin), und die Tricarbonsäurezyklus (Citrat, Malat, Succinat, Aspartat, Glutamat und Glutamin). Universell-markierten 13 C-Glucose bietet robuste Kennzeichnung aller Kohlenstoff-Spezies, während Auslastung von 1,6 - 13 C 2-Glukose ermöglicht robuste Kennzeichnung nur in +1 Arten von einzelnen Metaboliten. Diese Technik kann sensibel erkennen Unterschiede von Wildtyp-Wurm Vermittler Stoffwechselflusses unter mitochondrialen Atmungskette Mutanten, wie der Komplex III der mitochondrialen Atmungskette Untereinheit mutierten isp-1 (qm150). Abbildung 5 zeigt das Ausmaß der Unterschiede in der absoluten Etikett zwischen isp-1 (qm150) und N2 Würmer jeweils für 24 Stunden bis 1,6 ausgesetzt beobachtet - 13 C 2-Glucose in flüssiger Kultur mit K12 E. coli-Bakterien vom ersten Tag der Eiablage jungen erwachsenen Stadium (Protokoll B). Zusätzliche stabilen Isotopen-Studien in einer Reihe von mitochondrialen mutierten Würmer sind im Gange.
Abbildung 1. Universell-markierten 13 C-Glucose stabile Isotop wurde in jungen erwachsenen Würmer gut eingearbeitet 13 CO 2:. 12 CO 2-Verhältnis (Atome Prozent Überschuss (APE), korrigiert) in Wildtyp-(N2) Würmer folgenden 2 Stunden füttern universell gekennzeichnet 13 C-Glucose und entweder UV-oder getötet zu leben OP50 Bakterien auf Platten (PROTOKOLL C1). 13 C Einbau in Wurm Metaboliten wurde nach zwei Stunden Isotop Exposition robust. Blaue und rote Balken zeigen die relativen Isotopen-Anreicherung in der Gasphase ("atmosphärischen CO 2") und der flüssigen Phase ("Wurm CO 2"), bzw..
Abbildung 2. Längerer Isotop Exposition aus den frühen Larvenstadien Zeitraum und in der Folge "Clearing" Würmer auf NGM-Agar-Platten ohne Bakterien erhöht Isotopenanreicherung in freies Glutamat von jungen erwachsenen Würmer. Isotopenanreicherung in Glutamat Arten Würmer auf NGM-Agar-Platten mit gespeist wird gezeigt, universell-markierten- 13 C-Glucose und OP50 Bakterien entweder während der gesamten Entwicklung von der L1 Larvenstadium durch den 959 Zellen junger Erwachsener Stufe ("L1", siehe Protokoll A), oder für 48 Stunden ab, wenn Würmer am ersten Tag des erreichten Eiablage junge Erwachsenen-Stadium ("YA"). X-Achse zeigt die Anzahl der markierten Kohlenstoffatomen in jeder Glutamat Arten. Y-Achse zeigt die prozentuale Anreicherung (korrigiert Atome pro Überschuss (APE)). Grüne Balken zeigen die Würmer gelöscht folgenden Isotop Exposition durch die Fütterung OP50 E. coli ohne Isotop auf NGM-Platten für zwei Stunden vor dem PCA-Extraktion. Blaue und graue Balken zeigen die Würmer gelöscht folgenden Isotopen-Exposition auf NGM Platten ohne Bakterien oder Isotope für zwei bis sechs Stunden, jeweils vor der PCA-Extraktion.
Abbildung 3. Die Unterbrechung Würmer durch Schleifen liefert maximal Isotopenanreicherung in Mittler-Wurm Metaboliten. Prozent aus Kohlenstoff Bereicherung in +1 Citrat Arten in Wildtyp-Würmern für 24 Stunden in Flüssigkultur mit 1,6 behandelt gemessen - 13 C 2-Glukose ohne Bakterien (PROTOKOLL B). Schwarz und grau Balken zeigen die Würmer, die durch Beschallung nur oder durch Beschallung gestört wurden und Schleifen, bzw.. Isotopenanreicherung nach Exposition mit 1,6 - 13 C 2-Glucose ist am besten in Metaboliten auf ein Kohlenstoffatom markiert beurteilt. Im Gegensatz dazu ist label in allen Arten der einzelnen Metaboliten bereichert, wenn allgemein-markierten-13 C-Glukose verwendet wird.
Abbildung 4. Repräsentative Ergebnisse verdeutlichen das Ausmaß Isotopenanreicherung in Wurm Vermittler Metaboliten bezeichnend für Fluss durch Glykolyse, Pyruvat-Metabolismus und der Tricarbonsäurezyklus. Korrigierte Atome Prozent Überschuss (APE) wurde in jungen erwachsenen Wildtyp (N2 Bristol) Würmer folgenden 1 bestimmt, 6 bis 13 C 2-Glukose-Exposition entweder (A) während der Entwicklung von L1 Bühne, auf Platten (PROTOKOLL A) oder (B) ab dem ersten Tag der Eiablage als junge Erwachsene für 24 Stunden in flüssiger Kultur (PROTOKOLL B) . Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung, wo eine zuverlässige isotopischen Daten aus drei biologischen Replikaten zur Verfügung stand.
Abbildung 5. Absolute Aminosäure Quantifizierung von Aminosäuren Metabolit Arten in Wildtyp-und mutierten Mitochondrien Wurm Stämme. Absolute Label in jeder Art von vier Aminosäuren wurde berechnet durch Multiplikation HPLC-bestimmt freie Aminosäure-Konzentration (nmol / mg Protein Wurm) berichtigt Atome Prozent Überschuss (APE) für die einzelnen Arten. Graue und schwarze Balken zeigen die Wildtyp-(N2 Bristol) und der mitochondrialen Komplex III-Untereinheit Mutanten (isp-1 (qm150)), bzw.. Balken zeigen die durchschnittlich drei biologische Experimente zu replizieren pro Stamm.
Discussion
Die Anwendung der Massenspektrometrie zur Isotopenhäufigkeit in Vermittler Metaboliten zu messen bietet ein wunderbar detailliertes Bild der kritischen biochemischen Veränderungen 5. Hier haben wir ausführliche Protokolle für die Nutzung dieses hochsensitive und spezifische Methode zur Vermittlung Stoffwechselflusses in den genetisch vielseitige Modell Tier, C. Beurteilung zur Verfügung gestellt elegans. In der Tat, Fütterung lebenden Tieren mit stabilen Isotopen markierte metabolischen Vorstufen (z. B. 13 C-Glucose) ermöglicht neuartige Einblicke in Vermittler Stoffwechselweg flux bei der Messung von Isotopen-Anreicherung in Downstream-Metaboliten. Wir haben zuverlässige Methode entwickelt, um robuste Analyse der Fluss durch die Glykolyse, Pyruvat-Metabolismus und der Tricarbonsäurezyklus erhalten. Dies kann sowohl in Tieren, die stabilen Isotope von Anfang larvalen Entwicklungsstadien oder Anfang in der post-mitotischen Erwachsenen Zeitraum erreicht werden. Isotopen-Anreicherung in verschiedenen Metaboliten Arten können in Verbindung mit ganzen Wurm freie Aminosäure Profilierung durch Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie untersucht werden, wie zuvor 4 beschrieben, um absolute Isotopenanreicherung in verschiedene Arten von freien Wurm Alanin, Aspartat, Glutamat und Glutamin zu bestimmen. In der Tat sind übereinstimmende Muster von Isotopen-Anreicherung erzielt, wenn die Messung Aminosäure und einer organischen Säure Analyten in Aliquots von 1.000 bis 2.000 junge Erwachsene synchrone Würmer. Diese Methodik kann sensibel diskriminieren abnormal Vermittler Fluss im nuklearen Gen-basierte mitochondrialen Mutanten gegenüber Wildtyp-Würmer.
Diese Technik hält Wert flux Veränderungen in bestimmten biochemischen Stoffwechselwege von Relevanz zu untersuchen, um gemeinsame angeborene Stoffwechselstörungen. Insbesondere informiert die Verwertung von Glukose mit stabilen Isotopen markierte Kohlenstoffflusses durch zentrale Stoffwechselwege von Relevanz für mitochondriale Erkrankungen. In der Tat weisen unsere Daten Anwendung dieser Methodik können sensibel diskriminieren abnormal Vermittler flux in ein nukleares Gen-basierte mitochondrialen Komplex III-Untereinheit Mutante (isp-1 (qm150)) relativ zum Wildtyp-Würmer.
Es ist wichtig zu erkennen, dass da Isotopen Exposition über einen Zeitraum von einem bis zu mehreren Tagen abgeschlossen ist, quantifiziert Isotopenanreicherung stellt einen "steady state" Bereicherung Wert als quantifizierbare Fluß über einen definierten Zeitraum als in zellbasierten Modellen ermittelt werden könnte ausgesetzt Isotop für einen Zeitraum von Minuten bis Stunden. Eine weitere mögliche Einschränkung der Abfrage Weg Fluss im Laufe der Nematoden Entwicklung betrifft die unterschiedlichen Längen der Entwicklung der Larven, die in bestimmten Mutanten auftreten. Zum Beispiel sind viele schwere mitochondriale Mutationen bekannt, Verhaftung in der dritten (L3) Larvenstadium 6 zu bewirken. So kann die Analyse von Isotopen-Satzung nur bei Tieren, die bis ins Erwachsenenalter überleben nicht repräsentativ für die gesamte Bevölkerung mutierte werden. Allerdings könnte diese Methodik angepasst Isotopen Einbindung in Vermittler Metaboliten zu untersuchen in einem bestimmten Larvenstadium (wie L2), anstatt zu warten für die Tiere der erwachsenen Stadium erreicht zu sein. Ebenso haben Tiere, die die alternative Larvenstadium als dauer bekannt geben dürfte wesentlich verändert (wahrscheinlich weniger) Stoffwechselflusses gegenüber Tieren, die direkt vor durch die vier Larvenstadien. Zukünftige Studien könnten auch durchgeführt werden, um direkt zu bewerten Isotopen Einbindung in dauer der Bühne Tiere verschiedener genetischer Herkunft sein. Offenlegen von Tieren zu stabilen Isotopen für einen festen Zeitraum (hier 24 bis 48 Stunden) zu Beginn einmal Tiere erreichten die jungen erwachsenen Stadium (wie in Protokoll B detailliert) beseitigt die Auswirkungen der variable Entwicklungszeiten. Während 13 C-Glucose nur fragt Glykolyse, Pyruvat-Metabolismus und Tricarbonsäurezyklus Fluss, könnten auch andere Isotopen-Tracer potenziell beurteilt zu biochemischen Weg Fluss durch andere Wege des Interesses in Nematoden verhören werden. Zum Beispiel könnte 15 N-Glycin verwendet werden, um Aminosäure Umsatz in Nematoden zu beurteilen.
Eine weitere mögliche Einschränkung dieses Ansatzes ist der Grad der Empfindlichkeit der Metabolit-Erkennung. Unsere Erfahrung zeigt, ein Minimum von 500 jungen Erwachsenen Nematoden notwendig sind, um erfolgreich zu quantifizieren Isotopen Einbau durch die HPLC und GC / MS-Verfahren hier beschäftigt. Einsatz von Instrumenten mit höherer Empfindlichkeit, wie Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC), können gestatten, weitere Reduzierung der Anzahl Tiere untersucht, obwohl wir erwarten, dass dies unwahrscheinlich ist, um zuverlässige Quantifizierung von Metaboliten und Isotopen-Einbau in Metabolit Arten von einzelnen Würmern ermöglichen. Wir untersuchten Wurm Populationen von 1.000 Tiere pro Versuch, das fanden wir zuverlässig zu erkennen geringer Menge Metaboliten in jedem Stamm. Allerdings können manche Metaboliten, wie GABA, zuverlässig nur in viel größeren Populationen von Nematoden quantifiziert werden, in der Größenordnung von1x10 6 Tiere 4.
Zusammenfassend liefert stabile Isotop Profilierung eine nicht-invasive und sichere (nicht-radioaktive) Ansatz, der seit langem eingesetzt, um angeborene Stoffwechselstörungen zu untersuchen. Die Anwendung dieser Methode auf C. elegans wurden die neuen Kapazitäten in vivo, in Echtzeit, metabolische Veränderungen, die auf das ganze Tier-Ebene auftreten, die von einzelnen genetisch bedingten Erkrankungen und / oder pharmakologischen Wirkstoff Engagements führen kann untersucht werden.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde zum Teil durch die National Institutes of Health (K08-DK073545 und NICHD geförderten Geistiges und Developmental Disabilities Research Center New Investigator Award), The Philadelphia Foundation und der University of Pennsylvania McCabe award (MJF), sowie die Tristan finanziert Mullen Fund (MJF und MY). Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und stellen nicht notwendigerweise die offizielle Meinung von den National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| S. basal | 1 - page 59 | Protocols A and B | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C-8503 | Protocol B |
| OP50 E. coli | Caenorhabditis Genetics Center | Protocols A and C | |
| K12 E. coli | Caenorhabditis Genetics Center | Protocol B | |
| NGM agar | Research Products International Corp. | N81800-1000.0 | Protocols A, B, and C |
| 13C glucose (universally labeled) | Cambridge Isotope Laboratories | CLM-1396 | Protocol A and C |
| 13C glucose (1,6 labeled) | Cambridge Isotope Laboratories | CLM-2717 | Protocol B |
| 60% Perchloric acid (PCA) | Fisher Scientific | MK2766500 | Protocols A and B |
| ε-aminocaproic acid (Internal Standard) | Sigma-Aldrich | A-2504 | Protocols A and B |
| MTBSTFA | Regis | 270243 | Protocol E |
| Acetonitrile | Regis | 270010 | Protocol E |
| AG 1-X8, 100-200, Chloride form resin | Bio-Rad | 140-1441 | Protocols A and B (organic acid extraction) |
| AG 50W-X8, 100-200, Hydrogen form resin | Bio-Rad | 142-1441 | Protocols A and B (amino acid extraction) |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S-8875 | Protocol C |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | Protocol C |
| 3N HCl | Sigma-Aldrich | 320331 | Protocol D |
| 1N HCl | Sigma-Aldrich | 320331 | Protocol A |
| 0.1 N HCl | Sigma-Aldrich | 320331 | Protocol D |
| 4N NH4OH | Sigma-Aldrich | 30501 | Protocol D |
| 4N KOH | Sigma-Aldrich | 484016 | Protocols A and B |
| Deionized water | Milli Q Biocel | ZMQA60F01 | Protocol D |
| Helium | Airgas | 24001364 | Protocol C2 |
| SMZ-800 Zoom Stereo-Microscope | Nikon Instruments | NI MNA41000 | Protocols A, B, and C |
| pH meter | Fisher Scientific | S68167 | Protocols A and B |
| Table top centrifuge - 5804R | Eppendorf | 05-400-93 | Protocols A and B |
| Incubated platform shaker | New Brunswick Scientific | M1324-0004 | Protocol B |
| Mini LabRoller Rotator | Labnet International | H-5500 | Protocols A and B |
| Pestles | Kontes Corp | K749520-0090 | Protocols A and B |
| Drill | Kontes Corp | K749540-0000 | Protocols A and B |
| 1 L glass beaker | Fisher Scientific | 02-539P | |
| 1 L Erlenmeyer Flasks | VWR international | 89000-368 | |
| 25 mL Erlenmeyer Flasks | VWR international | 89000-356 | Protocol B |
| 7ml round-bottom glass tubes + rubber stopper | VWR international | VT6431 | Protocols A, B, and C1,C2 |
| 10 ml round-bottom glass tubes + rubber stopper | VWR international | VT6430 | Protocol C2 |
| Blue top tubes | Labco | 438B | |
| 50 ml conical plastic tubes | Falcon BD | 14-959-49A | All protocols |
| 1.5 ml microfuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | Protocols A and B |
| Syringes (1 mL, 10 mL, 20 mL) | BD Biosciences | 301025, 301029, 301031 | Protocols C1 and C2 |
| 25 gauge needles | Fisher Scientific | 22-253-131 | Protocols C1 and C2 |
| Poly-Prep Chromatography Columns | Bio-Rad | 731-1550 | Protocol D |
| Pasteur pipettes | VWR international | 14673-043 | Protocol D |
| 60mm Petri dishes | VWR international | 25373-085 | Protocol C |
| Glass chamber (cut bottom of 1 L flask) fitted with grease-sealed 3-way stopcock | Custom Made | Protocol C | |
| Optically transparent glass plate | Custom Made | Protocol C | |
| Reacti-Vap III Evaporator | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 18826 | Protocol D |
| Cotton | VWR international | 14224-516 | Protocol D |
| High Vacuum Grease | Dow Corning | 1597418 | Protocol C1 |
| Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-18 | Protocol B |
| Timer | ISC Bioexpress | T-2504-5 | Protocol C |
| Gas-Ratio Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Protocol D | |
| GC-MS | Hewlett-Packard | 5980/5971 | Protocol D |
| GC-MS | Agilent Technologies | 6980N/5973N | Protocol D |
| HPLC | Varian Inc., Agilent | 9010 | Protocol D |
References
- Hope, I. A. C. elegans: A practical approach. , University Press. Oxford. (1999).
- Dingley, S. Mitochondrial respiratory chain dysfunction variably increases oxidant stress in Caenorhabditis elegans. Mitochondrion. 10, 125-136 (2010).
- Jones, B. N., Gilligan, J. P. o-Phthaldialdehyde precolumn derivatization and reversed-phase high-performance liquid chromatography of polypeptide hydrolysates and physiological fluids. Journal of chromatography. 266, 471-482 (1983).
- Falk, M. J. Metabolic pathway profiling of mitochondrial respiratory chain mutants in C. elegans. Molecular genetics and metabolism. 93, 388-397 (2008).
- Yudkoff, M. Measuring in vivo ureagenesis with stable isotopes. Molecular genetics and metabolism. 100, Suppl 1. 37-41 (2010).
- Tsang, W. Y., Sayles, L. C., Grad, L. I., Pilgrim, D. B., Lemire, B. D. Mitochondrial respiratory chain deficiency in Caenorhabditis elegans results in developmental arrest and increased life span. J Biol Chem. 276, 32240-32246 (2001).
