Summary
중간 신진 대사 유량의 가스 크로마 토그래피 질량 spectrometric 분석하여 안정 원소 프로파일은 선충류에 설명되어 있습니다
Abstract
안정 원소 프로파일 오래 유전 변이 및 / 또는 세포와 포유 동물 모델 pharmacologic 요법의 대사 결과 민감한 조사를 허용하고 있습니다. 여기서 우리는 선충류, Caenorhabditis 엘레간스의 중간 신진 대사와 신진 대사 플럭스 안정 원소 프로파일을 수행하는 자세한 방법을 설명합니다. 방법은 다양한 pharmacologic 치료에 노출하는 동안 젊은 성인과 같은 선충류 성장 미디어 한천 플레이트 또는 시작에 초기 개발에서 두 안정 동위 원소에 노출 동물에서 전체 벌레 무료 아미노산, 표시 이산화탄소, 라벨 유기 지방산, 그리고 라벨 아미노산을 프로파일에 대해 설명되어 있습니다 액체 문화 인치 무료 아미노산은 4퍼센트 perchloric 산이 추출한 전체 웜 aliquots에서 고성능 액체 크로마 토그래피 (HPLC)에 의해 계량입니다. 보편적으로 13 C - 포도당 또는 1,6 표시 - 13 C 2 - 포도당은 누구의 표시 탄소 이산화탄소의 질량 분석계 (대기 및 해산 모두)뿐만 아니라 작용을 통해 흐름을 나타내는 metabolites으로 추적할 수있는 안정 원소 전구체로 사용된다 , pyruvate 신진 대사 및 tricarboxylic 산성주기. 대표 결과 (ISP - 1 (qm150) mitochondrial 복잡한 III 돌연변이 벌레의 원소 법인뿐만 아니라 상대적인 범위, 야생 타입 nematodes의 동위 원소 노출 시간의 효과, 각종 세균의 거래 프로토콜 및 대체 웜 중단 방법을 보여주는 포함되어 있습니다 ) 야생 형 벌레에 대한 상대. 생활 nematodes 안정 원소 프로파일 링의 응용 프로그램이 개별 유전자 장애 및 / 또는 pharmacologic 치료로 인해 발생하는 모든 동물 레벨 실시간 신진 대사 변경에 조사를 소설 용량을 제공합니다.
Protocol
프로토콜 : C. 동안 중간 대사의 안정 원소 프로 파일링 NGM 플레이트에 엘레간스 개발.
*주의 : 안정 동위 원소 농축이 성공적으로 동위 원소 노출 (중 보편 - 표시 13 C 포도당 또는 1,6와 함께 - 13 C 2 - 글루코오스) 다음과 같은 젊은 성인 선충류의 집단에서 측정할 수 조기 개발 또는 초기 성인기에 하나 시작. 이 프로토콜은 동물 건강, 개발, 쉽게 액체 문화에 달성하지 표준 선충류의 성장 미디어 (NGM) 접시에 성장의 동시 모니터링을 용이하게합니다.
- 표준 기술마다, 선충류 성장 미디어 10 ML (NGM)와 100mm 배양 접시를 준비합니다. 1
- OP50 E.로 확산 NGM 플레이트 대장균 1과 하룻밤 건조 수 있습니다.
- 13 C 2 포도당 (NGM 플레이트 10 mm의 최종 농도를 달성하기) 균일하게 접시에 - 200 MM 1,6 500 μL를 추가합니다. 하룻밤 건조하도록 허용합니다.
- 표백 gravid 성인 웜 1. 13 C 2 포도당 - 플레이트가 세균이나 1,6없이 NGM 접시에 달걀을 발견. ° C 하루 20 알을 품다.
- 13 C 2 - 포도당과 OP50 E. - 다음날, 이전에 1,6와 함께 보급 NGM 접시에 부화, L1 - 체포 애벌레를 전송 대장균 (위의 단계 # 2 당). 젊은 성인 단계 (48-72시간, 스트레인에 따라)에 벌레를 성장, 복용 관리 벌레들은 굶기는하지 않습니다.
- S.의 기초의 3-4 ML과 접시에서 동기 먼저 일 젊은 성인 벌레를 수집합니다.
- 50 ML 팰컨 튜브의 S.의 기초 50 ML에 벌레를 씻으십시오. 5 분 중력에 의해 펠릿에 벌레를 허용합니다. ~ 5 ML에 뜨는 제거합니다. 두 번 더 씻어 반복합니다.
- 세 100 μL aliquots 2 세어 웜 번호를 예상하고있다. 1,000 웜 / S.의 기초의 ML에 벌레 농도를 조정합니다.
- 1.5 ML의 플라스틱 원심 튜브에 피펫 1 ML (1000 웜).
- 60% 4퍼센트 PCA 및 내부 표준 200 μmol의 최종 농도에 내부 표준 (ε - aminocaproic 산성)이있는 PCA의 69 μL를 추가합니다.
- 벌레 중력 X 5 분 쉬라 구. 다른 튜브에 뜨는를 제거하고 저장합니다.
- 15 초 동안 플라스틱 균 질기 (Kontes 펠렛 페슬)와 전동 드릴 (Kontes 펠렛 페슬 무선 모터)를 사용하여 웜 샘플을 분쇄. 시각 가벼운 현미경으로 벌레 장애를 확인합니다. 필요한 경우 반복합니다.
- 단계 # 12 homogenate와 결합하는 단계 # 11에서 뜨는을 전송합니다.
- 5 분 2,250 RPM (1,300 XG)에서 샘플을 원심 분리기.
- 신선한 7 ML 유리관에 뜨는 전송합니다. 아래와 같은 단계 # 20 세부, 단백질 농도 분석에 대한 펠렛을 저장합니다.
- 4N 코를 사용하여 7-8 (중성) 범위 산도 샘플.
- 소금을 제거하는 5 분 2,250 RPM (1,300 XG) 7 ML 유리 튜브에 무력화 샘플을 원심 분리기.
- 신선한 7 ML 유리관에 뜨는 전송합니다.
- 에 의해 신진 대사 quantitation에 대한 무력화 샘플을 준비 :
- 고성능 액체 크로마 토그래피 (HPLC) HPLC에 직접 분사에 대한 무력화 샘플 별도의 50 μL. 무료 아미노산 quantitation는 이전에 다음 ID로 3-4에서 설명하는 것처럼 HPLC (베리안은), O - phthalaldehyde과 형광 검출로 사전 컬럼 derivatization를 사용하여 수행됩니다.
- 가스 크로마 토그래피 / 질량 분석계 (GC / MS)로 PROTOCOL D.에 대한 자세한 아미노산과 유기 지방산의 원소 농축의 GC / MS 결정에 대한 이온 교환 수지 (생물 래드)를 사용하여 나머지 무력화 샘플의 추출을 진행합니다
- 7 ML 유리 튜브 (단계 # 15) 남아있는 단백질의 펠렛에 1N NaOH 1 ML을 추가합니다.
- 녹아 때까지 회전 (Labnet * LabRoller의 회전) 하룻밤 동안 품어는 실온에서 단백질 샘플을 NaOH - 대우.
- 표준 방법 (DC의 단백질 분석, 생체 방사선)에 의해 단백질 농도를 결정하기 위해 NaOH - 대우 단백질 75-100 μL를 사용하십시오.
C.의 중간 대사의 프로토콜 B. 안정 원소 프로 파일링 액체 문화 엘레간스 청년.
* 참고 : 성인 nematodes의 중간 대사 유량에 Pharmacologic 효과 NGM 접시에 누워 중 계란의 첫날 원소 노출 시작 다음 공부 (프로토콜, 위 참조) 또는 액체 문화에서하실 수 있습니다. 우리는 안정 동위 원소 및 pharmacologic 에이전트 활용의 비용 효율성을 극대화하기 위해 후자의 접근 방식을 선호합니다.
- 희석 동기, 첫날 달걀 누워 기초 S. 500 μL 당 2,000 동물 0.0005 %의 콜레스테롤 (기초 S.의 1L에 1 % 콜레스테롤의 0.5 ML를 (95 % 에탄올에 용해)을 추가하여 취득)이있는 젊은 성인합니다.
- 다음과 같이 25 ML Erlenmeyer flasks의에서 ~ 4 ML 총 볼륨 문화 (들)을 설정합니다 :
치료 : 없음 "마약" 콜레스테롤과 S.의 기저 3020 μL 3020 UL - "약물"볼륨 안정 동위 원소 (1,6 - 13 C 2 - 글루코오스) 80 μL 80 μL K12 E. 대장균 (OD 660 2.5-3) 400 μL 400 μL 젊은 성인 웜 (2,000) 500 μL 500 μL 약물 (원하는 농도) - 원하는대로 - 호일과 flasks 표지. 20 ° C incubated 플랫폼 통에 220 rpm으로 24 시간 동안 흔들어 flasks.
- 산소가 중간 대사 유량과 내생 선충류의 metabolites의 라벨을 결과에 필요합니다 같은 flasks가 완전히 밀봉하지 마십시오.
- 50 ML 원뿔형 플라스틱 튜브 S.의 기초 46 ML 4 ML 문화 볼륨을 추가하여 벌레를 씻으십시오. 5 분 중력에 의해 펠릿에 벌레를 허용합니다. 아래로 ~ 5 ML의 상태에 뜨는 진공 흡입. S.의 기초와 50 ML을 두 번 더 튜브를 충진하여 세차를 반복합니다.
- 1.5 ML의 플라스틱 원심 분리기 튜브 1000 웜 / ML로 씻어 벌레를 집중.
- 200 μmol 내부 표준의 최종 농도 및 4퍼센트 PCA를 달성 60 % perchloric 산성 (PCA)의 69 μL와 10 μm의 내부 표준 (ε - aminocaproic 산) 2 μL를 추가합니다.
- # 11-22 PROTOCOL A.에 따라 단계로 샘플 준비
PROTOCOL C - 1. 대기와 용존 이산화탄소에서 탄소 라벨을 추적하여 접시에 성인 웜의 원소 활용도를 모니터링.
* 참고 : 프로토콜 반해 A와 B의 세부 방법은 짧은 시간 코스 이상, 각각 성인 생활의 개발 또는 일일로부터 2-3 일 동안 웜 이내 무료 metabolites로 원소 설립의 성공과 반응 속도론의 총 확인 동위 원소의 설립을 모니터링하는 (즉, 시간 분) 웜에서 공개 또는 웜 추출물 내에 용해 이산화탄소에 포함된 (CO 2) 대기 이산화탄소의 모니터링 레이블에 의해 얻을 수 있습니다. 접시 (프로토콜 C - 1) 성장하면 라이브 또는 죽은 박테리아가 벌레 먹이 수 있습니다. 박테리아는 액체 문화에 벌레의 단기 동위 원소 노출 (프로토콜 C - 2) 필요하지 않습니다.
- NGM 한천 10 ML과 100mm 배양 접시를 준비합니다. 라이브 또는 UV - 살해 중 OP50 E. 함께 NGM 번호판을 확산 대장균 (그림 1 시연). 접시가 하룻밤 건조하도록 허용합니다.
- 200 MM 500 μL를 추가 1,6 - 라벨 - 13 C OP50 보급 NGM 플레이트 (NGM 플레이트 10 mm의 최종 동위 원소의 농도)로 2 - 포도당. 접시가 하룻밤 건조하도록 허용합니다.
- 구하는 동기, 첫날 달걀 누워 NGM 한천 접시에 성장 젊은 성인 벌레는 OP50 E.에만 보급 대장균.
- 안정 동위 원소와 E.을 포함하는 실험 NGM의 한천 플레이트 1000 젊은 성인 웜을 전송 대장균 (위의 단계마다 # 1-2, 등 준비).
- 정확한 분위기 샘플링 및 교환 수 있도록 잘 밀봉된 3 방향 꼭지가 장착되어 사용자 정의 유리 챔버에 넣어 실험 NGM 플레이트 (커버 제외). 즉시 광학 투명 유리 디스크로 방을 인감. 유리 디스크 인감 높은 진공 그리스와 함께 접시에 자리가 어디 솔기를 커버. "시간 0"으로 지정한 시간.
- 30, 60, 90 및 120 분 20 ML 주사기 3 방향 꼭지에 의해 유리 챔버에서 분위기 샘플 10 ML. 사전 준비 10 ML 고무 스토퍼 각 대기 샘플을 전송하는 것은 봉인 진공되었습니다 0.1 N NaOH 1 MM NaHCO 3 1 ML를 포함하는 유리 튜브를 눌렀다고.
- 20 ML의 주사기를 사용하여 3 방향 꼭지를 통해 각 유리 챔버로 공기 다시 10 ML을 주사. 분위기를 샘플링 / reinjecting 후 회수 시간 지점 사이에 보육을 재개하기 전에 챔버에 꼭지를 닫습니다.
- 10 ML의 고무 마개에 스토퍼를 통해 20 %의 인산 100 μL를 주사는 대기 CO 2 샘플을 포함하는 유리 튜브를 눌렀다고.
- 분위기 2 ML를 제거하고 12 ML 블루 맨 자동 샘플러 튜브 대기 CO 2 측정을위한 헬륨으로 미리 채워진에 그것을 주사.
- 가스 비율 질량 분석계 (ThermoQuest 피닝간 델타 플러스)하여 "대기 CO 2 샘플"을 분석할 수 있습니다.
- 모든 대기 샘플 2 시간 동위 원소의 잠복기 및 수집 다음 열기 유리 실.
- S.의 기초 3 ML을 사용 NGM 접시의 벌레를 씻으십시오.
- 50 ML 팰컨 튜브 50 ML S.의 기저에있는 벌레를 씻으십시오. 두 번 더 씻어 반복합니다.
- 7 ML 둥근 바닥 유리관 (S)에서 ~ 1000 웜 / ML에 벌레를 집중.
- 고무 마개로 밀봉 진공 유리관.
- 100 μL 추가CO 2를 해산 공개 주사기와 고무 마개를 통해 20 % 인산니다.
- 분위기 2 ML를 제거하고 12 ML 블루 맨 자동 샘플러 튜브 용해 CO 2 측정을위한 헬륨으로 미리 채워진으로 주입.
- 가스 비율 질량 분석기 (ThermoQuest 피닝간 델타 플러스)에 의해 "해산 CO 2 샘플"을 분석할 수 있습니다.
다른 프로토콜 (C - 2) : 대기와 해산 이산화탄소가 표시 탄소를 추적하여 액체 문화에 어른 벌레의 모니터링 원소 활용.
- OP50 E.로 확산 NGM 한천 플레이트에서 성장 동기, 첫날 달걀 누워, 젊은 성인 벌레를 구합니다 대장균.
- 50 ML 팰컨 튜브의 S.의 기초 50 ML에 벌레를 씻으십시오. 5 분 중력에 의해 펠릿에 벌레를 허용합니다. ~ 5 ML에 뜨는 제거합니다. 반복 두 번 더 씻는다.
- 1 ML S.의 기초 10 ML 왕복 하단의 유리관 1000 젊은 성인 웜을 전송합니다. 13 C - 포도당 웜 1 ML ~ 10 mm의 최종 농도를 달성하기위한 보편 - 레이블의 1 M 주식의 10.1 μl를 추가합니다.
- 이분 오픈 튜브에 100 % 산소를 흐르는과 분위기를 교환하여 웜 및 동위 원소를 포함하는 산화 왕복 하단의 유리관. 고무 마개로 튜브를 즉시 닫습니다.
- 220 rpm으로 20 ° C incubated 플랫폼 통에 실험용 튜브를 흔들어. "시간 0"로 시작 시간을 기록합니다.
- 30, 60, 90 및 120 분 고무 마개를 통해 10 ML의 주사기 25 게이지 바늘을 사용하여 10 ML 왕복 하단의 유리관에서 분위기 샘플 5 ML.
- 사전 준비, 고무 마개 각 대기 샘플을 전송 밀폐 진공되었습니다 0.1 N NaOH 1 MM NaHCO 3 1 ML을 포함한 10 ML 유리 튜브를 눌렀다고.
- 10 ML의 주사기 25 게이지 바늘을 사용하여 고무 마개를 통해 웜 및 동위 원소를 포함하는 각 실험 왕복 하단의 유리관에 공기 다시 5 ML을 주사.
- 수집 시간 지점 사이의 220 rpm으로 흔들어하여 웜 및 동위 원소를 포함하는 실험 10 ML 왕복 하단의 유리 튜브의 보육을 재개.
- 고무 마개를 포함하는 대기에 스토퍼를 통해 20 %의 인산 100 μL를 주입 10 ML 유리 튜브를 눌렀다고.
- 분위기 2 ML를 제거하고 12 ML 블루 맨 자동 샘플러 튜브 대기 CO 2 측정을위한 헬륨으로 미리 채워진으로 주입.
- 가스 비율 질량 분석계 (ThermoQuest 피닝간 델타 플러스)하여 "대기 CO 2 샘플"을 분석할 수 있습니다.
- 실험 기간이 끝날 때, 50 ML 팰컨 튜브 50 ML S.의 기저에있는 벌레를 씻으십시오. 웜 펠렛은 중력에 의해 형성하도록 허용합니다. 아래로 ~ 5 ML의 상태에 뜨는 진공 흡입. S.의 기초 50 ML에 두번 이상으로 세차를 반복합니다.
- 7 ML 둥근 바닥 유리 튜브 ~ 1000 웜 / ML에 벌레를 집중. 고무 마개 및 진공 밀봉 튜브를 추가합니다. 녹아 웜 CO 2를 공개하기 위해 고무 마개를 통해 25 게이지 바늘로 1 ML의 주사기를 사용하여 20 %의 인산 100 μL를 추가합니다.
- 2 ML 분위기를 제거하고 12 ML 블루 맨 자동 샘플러 튜브 용해 CO 2 측정을위한 헬륨으로 미리 채워진으로 주입.
- 가스 비율 질량 분석기 (ThermoQuest 피닝간 델타 플러스)에 의해 "해산 CO 2 샘플"을 분석할 수 있습니다.
프로토콜 D. 처리 A와 B 아미노산 및 가스 크로마 토그래피 / 질량 분석법에 의해 유기산 분석을위한 프로토콜에서 샘플을 무력화.
- 비드 준비 :
- 자세 1 1L 비커에서 별도로 자세 50 구슬 모두 1 N HCL을 추가합니다.
- 자기 활동가와 함께 30 분 동안 각 플라스크를 저어.
- 세탁의 산도는 물의 산도와 동일한 때까지 탈이온수 10 번 구슬을 씻으십시오.
- 열 준비 :
- 단지 파스퇴르 피펫 팁의 좁은 부분 위에 목화 플러그를 삽입합니다.
- 열 높이의 약 3로 각각 작성, 샘플 당 두 개의 열이 각각에게 부과 구슬을 추가합니다. 유기산 추출에 대한 AG1 구슬을 사용합니다. 아미노산 추출을위한 AG50 구슬을 사용합니다.
- 샘플 처리 :
- 청구 AG1 비즈와 컬럼에 시료 500 μL를 추가합니다. 아무것도 예제에서는 중립 산도에 이미있는 경우, 유기 지방산을 추출 AG1 컬럼에 적용하기 전에 (프로토콜 단계 # 19B 참조) 샘플에 추가되지 않습니다.
- 아미노산을 추출하기 위해 AG50 컬럼에 적용하기 전에 나머지 예제 0.1 N HCL 1 ML을 추가합니다.
- 샘플 컬럼을 통해 완벽하게 실행할 수 있습니다.
- 세탁이 (7-8 산도 범위) 중성 때까지 물로 10 배와 컬럼을 씻으십시오.
- 신선한, 라벨 유리 4 ML 샘플 튜브에 열을 Elute :
- 유기산 추출 들어, AG1 열 3 N HCL의 3mL를 추가합니다. 이것은 3 탄소 종 (락트 산), 4 - 탄소 종 (aspartate, succinate, malate) 사이에 표시 탄소의 총수의 동위 원소 농축의 분석을 수5 - 탄소 종 (조미료), 그리고 6 - 탄소 종 (구연 산염).
- 아미노산 추출의 경우 : AG50 열 4 N NH 4 OH의 3mL를 추가합니다. 이것은 3 탄소 종 (알라닌) 및 5 - 탄소 종 (글루타민) 사이에 표시 탄소의 총수의 동위 원소 농축의 분석을 수 있습니다.
- 건조까지 밤새 Reacti - VAP III 증발기에있는 샘플 튜브를 놓습니다.
질량 분석법에 대한 E. 샘플 Derivitization 및 머신 설정
각 샘플 약병에 acetonitrile 50 μL와 N - 메틸 - NT - butyldimethylsilyl trifluoroacetamide (MTBSTFA) 50 μL를 추가합니다. , 커버 믹스 60 ° C. 30 분 알을 품다 가스 크로마 토그래피 / 질량 분석계 (GC / MS)에 샘플 당 1-2 μl를 주입.
결과 F. 분석
- 아미노산 봉우리 부량. HPLC 분석에 의해 각각의 아미노산의 Quantitation는 내부 표준의 각 피크 상대의 영역을 사용하여 계산됩니다.
- 원소 농축을 계산. 안정 원소 강화가에 따라 각 종족에 대한 엑셀 (마이크로 소프트)의 계산은 다음 공식 : 아톰 비율 초과, 수정 (원숭이) = (R SA - R ST) * 100 / [(R SA - R ST) 100] 어디 R SA - 샘플 및 R의 성 비율 - 표준의 비율.
- 샘플 농축 사이에 통계적 차이를 평가. 학생의 T - 시험은 상대적으로 아미노산과 샘플 사이의 원소 라벨 차이의 중요성을 평가하는 데 사용됩니다.
대리인 결과 :
안정 동위 원소는 같은 분위기 CO 2 및 해산 웜 CO 2 측정 표시 탄소에 의해 입증, 젊은 성인 벌레에 잘 통합됩니다. 벌레 먹은에 살고있는 또는 UV - 조사 하나는 OP50 E.를 죽였다 대장균, 13 CO 2-12 CO 2의 비율이 출시 대기 CO 2 (그림 1)에 상대적인 해산 웜 CO 2 분율에 큰되었습니다. 수유 벌레는 OP50 E. 살고 죽어 대장균은 크게 (프로토콜 C1 참조) 씻어 벌레 추출물의 측정 13 CO 2-12 CO 2 비율을 변경하지 않았다.
초기 애벌레 시대의 안정 동위 원소에 장시간 노출은 중간 metabolites의 원소 농축 증가했습니다. 벌레가 먹은 때 젊은 성인 야생 형 웜의 중간 metabolites 결정 레이블 탄소 수정 원자의 비율 초과는 모든 글루 탐 산염 종에 걸쳐 큰했습니다 보편 - 표시 13 C - 포도당과 마찬가지로 치료 동물에 비해 개발 전반에 걸쳐 사는 박테리아는 48에 대한 레이블 박테리아를 먹이로 시간은 계란 - 누워있는 성인 무대 (그림 2)에 도달 후.
원소 농축에 시대를 청소의 효과. 에 관계없이 노출 timecourse의 접시에 성장 모든 동물은 GC / MS 분석을위한 스트림 준비하기 전에 원소 라벨의 '삭제'되었다. 그림 2에서와 같이 삭제 프로토콜의 비교는 2 시간 동안 세균없이 NGM 한천 플레이트에 대한 동위 원소 또는 수유없이는 살 신선한 박테리아 확산 NGM 한천 플레이트 2 시간 동안 벌레를 먹이, 그리고에 대한 세균없이 NGM 한천 접시에 먹이를 포함하여 수행되었다 2 6시간 중. 동물 2 6시간 중 하나에 대한 세균없이 접시에 해제했을 때 원소에 상관없이 노출 물론, 젊은 성인 전체 벌레 추출물의 중간 metabolites의 원소 농축에 중요한 차이는 관찰되지 않았습니다. 동물 후 두 시간 동안 레이블이 지정되지 않은 박테리아의 먹이에 의해 초과하는 동위 원소의 '삭제'했을 때 반대로, 적은 원소 농축는 중간 metabolites에서 관찰되었다. 그러나, 4, 3의 농축을 증가하고, 벌레가 초기 애벌레 시대의 동위 원소에 노출되었을 때 다섯 종족이 분명했다. 따라서, 최적의 거래 프로토콜 unspread NGM의 접시에 2 시간 이후에 부화하여 안정 동위 원소와 박테리아 확산 NGM 접시에 자신의 부화를 따라 웜을 삭제하는 결정했다. 참고의, 액체의 문화 속에서 자란 벌레는 S.의 기초 세 권 원소 라벨과 세균 (프로토콜 B 참조) 명확하게 씻어되었습니다, 세탁의 GC / MS 분석은 세 번째 세척에 의해 더 큰 원소 농축을 보여주 없습니다.
웜 연마는 중간 metabolites에서 최대한의 이득을 굴복. 비슷한 치료 조건을 다음과 같은 중간 metabolites에서 %의 농축을 최적화하기 위해 비교 혼자 sonication 또는 sonication 플러스 연삭에 의해 방해 웜 샘플 만들어졌습니다. 벌레가 sonication하여 다음과 같은 동위 원소의 노출을 중단 플러스 전용 sonication에 의해 방해 샘플보다 큰 원소 농축을했다 연삭 그림 3 보여줍니다. 이러한 데이터는 더 하위 organismal 분수가 sonication하여보다 연삭에 의해 교란되었다하는 것이 좋습니다. 후속 연구는 sonicatio없이 혼자 연삭 공개n은 최대한의 원소 농축을 (데이터가 표시되지 않음) 달성에 충분했다.
전체 벌레 원소 노출 중간 대사 경로 유량의 분석을 수 있습니다. 성인 무대 동물 개발 (프로토콜, 그림 4A) 또는 시작 중 하나 안정 원소 전구체 살아있는 벌레를 먹이면 (프로토콜 B, 그림 4B) 작용을 통해 흐름을 나타내는 metabolites 중에서 원소 농축의 민감한 분석 (락트 산, 알라닌), pyruvate를 허용 신진 대사 (알라닌) 및 tricarboxylic 산성주기 (구연 산염, malate, succinate, aspartate, 글루 탐 산염 및 글루타민). 보편 - 표시 13 C - 포도당은 1,6의 활용 반면, 모든 탄소 종의 강력한 라벨을 제공합니다 - 13 C 2 - 포도당은 신진 대사의 한 각 수종에 강력한 라벨을 수 있습니다. 이 기술은 sensitively 등 복잡한 III mitochondrial 호흡 사슬 subunit 돌연변이 ISP - 1 (qm150)로 mitochondrial 호흡 사슬 돌연변이 변종 중 야생 형 웜 중간 대사 유량의 차이를 분별 수 있습니다. 13 K12 E.와 액체 문화에 C 2 - 포도당 - 그림 5는 ISP - 1 (qm150)과 N2의 웜을 1,6 24 시간 동안 노출된 각 사이의 절대 레이블에서 관찰 차이의 크기를 보여줍니다 첫날부터 대장균 세균 달걀 누워있는 젊은 성인 단계 (프로토콜 B)를. mitochondrial 돌연변이 벌레의 범위에서 추가 안정 원소 연구가 진행되고 있습니다.
그림 1. 보편 - 표시 13 C - 포도당 안정 동위 원소는 젊은 성인 벌레에 잘 통합되었다 13 CO 2 : 12. 이송 이시간 다음과 같은 야생 - 타입 (N2) 웜 보편 인 CO 2 비율 (원자의 %를 초과 (원숭이), 수정) 13 C - 포도당과 중 UV - 살해 또는 접시 (프로토콜 C1)에 OP50 박테리아를 살아 13. 표시된 웜 metabolites로 C 정관은 동위 원소 노출의 두 시간 후에 강력한되었다. 파란색과 빨간색 막대는 각각 기체 단계에서 상대 원소 농축 ( "대기 CO 2")과 액상 (이하 "웜 CO 2") 나타냅니다.
그림 2. 연장 동위 원소의 초기 애벌레 시대의 노출 후 세균없이 NGM 한천 플레이트에 벌레를 '삭제'는 젊은 성인 웜 무료로 글루 탐 산염의 원소 농축을 증가시켰습니다. 글루 탐 산염 종의 원소 농축이 함께 NGM의 한천 플레이트에 공급 웜 표시되는 보편 - 분류 - 13 C - 포도당과 중 959 세포 젊은 성인 단계를 통해 L1 애벌레 단계에서 개발 전반에 걸쳐 OP50 세균 ( "L1", 프로토콜 참조), 또는 사십팔시간에 대한이 웜은의 첫날에 도달하면 시작 계란 - 누워있는 젊은 성인 무대 ( "YA"). X - 축 각 글루 탐 산염 종의 표시 탄소 원자의 총 수를 나타냅니다. Y - 축은 %의 농축을 (를 초과마다 수정 원자 (원숭이))을 나타냅니다. 녹색 막대 벌레가 OP50 E. 먹이에 따라 동위 원소의 노출을 삭제 표시 이전 PCA 추출 두 시간 동안 NGM 접시에 동위 원소없이 대장균. 블루와 회색 막대 벌레 전에 PCA 추출하기 위해 각각 두 개 6 시간 동안 세균이나 동위 원소없이 NGM 접시에 다음과 같은 동위 원소의 노출을 삭제 나타냅니다.
그림 3. 수율에게 중간 웜 metabolites에서 최대한의 원소 농축을 연삭하여 웜을 방해. 13 C 2 - 포도당 균 (PROTOCOL B)없이 - 1,6와 액체 문화에 24 시간 처리 야생 타입 웜으로 한 구연 산염 종에서 측정된 탄소 농축의 비율. 검은색과 회색 막대는 각각 sonication에만 또는 sonication에 의해 방해하고 분쇄했다 벌레를 나타냅니다. 1,6에 노출 다음 원소 농축 - 13 C 2 - 포도당이 최고 탄소에 표시 metabolites로 평가됩니다. 보편적으로 - 분류 - 13 C - 포도당이 활용되었을 때 대조적으로, 레이블은 각 신진 대사의 모든 수종에 풍부합니다.
그림 4. 대표 결과가 작용, pyruvate 신진 대사 및 tricarboxylic 산성주기를 통해 유량을 나타내는 웜 중간 metabolites의 원소 우라늄 농축의 범위를 보여줍니다. 수정된 원자의 %를 초과 (원숭이)가 1을 다음과 젊은 성인 야생 타입 (N2 브리스톨) 웜에서 산출된 것입니다, 6-13 중 (A) 접시 (프로토콜)에 L1 단계에서 개발하는 동안 또는 (b) 시작의 첫날 C 2 - 포도당 노출 달걀 누워 (PROTOCOL B) 액체 문화 24 시간 동안 젊은 성인으로 . 오류 막대는 생물이 복제 거미의 신뢰할 수있는 원소 데이터를 사용할 수 표준 편차를 나타냅니다.
그림 5. 야생 유형과 mitochondrial 돌연변이 웜 변종에 아미노산 대사 종 절대 아미노산 quantitation. 네 아미노산의 각 종류에 절대 레이블 곱하여 계산 HPLC - 결정된 각 종족에 대한 수정 원자의 %를 초과 (원숭이)을 통해 무료로 아미노산 농도 (nmol / MG 웜 단백질). 회색과 검정색 막대는 각각 (ISP - 1 (qm150)) 야생 형 (N2 브리스톨)과 mitochondrial 복잡한 III subunit의 돌연변이 변종을 나타냅니다. 바 스트레인 지당 3 생물 복제 실험의 평균 나타냅니다.
Discussion
중간 metabolites의 원소 풍요로움을 측정하기 위하여 질량 분광법을 적용하는 것은 중요한 생화 학적 변화 5 멋지고 상세한 내용을 파악할 수 있었죠. 여기, 우리는 유전적으로 다양한 모델 동물, C.의 중간 대사 유량을 평가하기 위해이 매우 민감하고 구체적인 방법론을 악용에 대한 자세한 절차를 제공 엘레간스. 사실, 안정 동위 원소 살아있는 동물을 먹이면 하류 metabolites의 원소 농축을 측정하면 신진 대사 엽 성의 전구 물질 (예 : C - 포도당 13 등) 중간 대사 경로 유량에 소설 통찰력을 허용 레이블. 우리는 작용, pyruvate 신진 대사 및 tricarboxylic 산성 순환 유량의 강력한 분석을 얻으려면 신뢰할 수있는 방법론을 개발했습니다. 이것은 초기 발달 단계에서 애벌레 안정 동위 원소를 먹은 동물이나 사후 mitotic 성인 시대의 시작을 모두 얻을 수 있습니다. 이전에 무료로 웜 알라닌, aspartate, 글루 탐 산염과 글루타민의 다른 수종에 절대 원소 농축을 결정하기 위해, 4 설명된대로 다른 신진 대사 종의 원소 농축은 고성능 액체 크로마 토그래피에 의해 전체 벌레 무료 아미노산 프로파일과 함께 공부하실 수 있습니다. 1000 2000 젊은 성인 동기 웜의 aliquots에서 아미노산과 유기산 analytes를 측정하면 실제로, 원소 농축의 일관된 패턴이 얻을 수 있습니다. 이러한 방법론 sensitively 야생 타입의 웜을 상대 핵 유전자 기반 mitochondrial 돌연변이 계통에 이상 중간 유량을 구별하실 수 있습니다.
이 기술은 일반적인 대사 타고난 오류 관련의 특정 생화 학적 경로의 유량 변경을 조사할 가치를 보유하고 있습니다. 특히, 안정 동위 원소와 함께 레이블 포도당의 이용은 mitochondrial 질병에 관련 중앙 대사 경로를 통해 탄소 유량을 알려줍니다. 사실, 우리의 데이터는 이러한 방법의 응용 프로그램이 sensitively 야생 형 웜을 상대 핵 유전자 기반 mitochondrial 복잡한 III subunit의 돌연변이 스트레인 (ISP - 1 (qm150))의 비정상적인 중간 유량을 구별 할 수 것이 좋습니다.
원소 노출이 며칠 하나의 기간 동안 완료 이후 그것은 셀 기반의 모델로 결정 수도로 계량 원소 농축 시간 정의된 기간 동안 "정상 상태"농축 가치보다는 같지는 유량을 대표 그렇게 인식하는 것이 중요합니다 시간 분 동안 동위 원소에 노출. 선충류 개발의 과정을 통해 경로 유량을 심문의 또 다른 잠재적인 제한은 특정 돌연변이 계통에서 발생하는 애벌레 개발의 길이를 서로 다른 관련이 있습니다. 예를 들어, 많은 심각한 mitochondrial 돌연변이가 세 번째 (L3) 애벌레 단계 6에서 체포를 일으키는 것으로 알려져 있습니다. 그러므로, 오직 성체로 생존 동물의 동위 원소의 설립 분석은 전체 인구의 돌연변이 대표되지 않을 수 있습니다. 그러나이 방법은 특정 애벌레 단계 (예 : L2 등)보다는 동물이 성인 무대에 도달하는 대기의 중간 metabolites의 원소 정관을 평가하기 위해 적응 수 있습니다. 마찬가지로, 가능성 dauer로 알려진 대체 애벌레 단계를 입력 동물 크게 네 개의 애벌레 단계를 통해 직접 진행 동물에 상대 (가능성이 낮은) 대사 플럭스 변경했습니다. 미래 연구는 직접 다른 유전 배경 dauer 단계 동물의 원소 정관을 평가하기 위해 수행 수 있습니다. 동물들이 젊은 성인 단계에 도달 한 번 시작 고정 기간 (여기서, 24-48시간)에 대한 안정 동위 원소에 동물을 노출하면 (같은 프로토콜 B에 설명된) 변수 발달 기간의 영향을 제거합니다. 13 C - 포도당은 해당 작용, 신진 대사 및 pyruvate tricarboxylic 산성주기 유량을 interrogates 있지만, 다른 원소 추적기는 잠재적 nematodes에 대한 관심의 다른 경로를 통해 생화 학적 경로 유량을 심문하러 평가 수 있습니다. 예를 들어, 15 N - 글리신은 nematodes의 아미노산 회전율을 평가하기 위해 활용 수 있습니다.
이 접근법의 또 다른 잠재적인 제한은 신진 대사의 검출 감도의 레벨입니다. 우리의 경험은 500 젊은 성인 nematodes 최소가 성공적으로 여기에 사용된 HPLC 및 GC / MS 방법으로 원소 정관를 정할 필요합니다 제안합니다. 같은 울트라 성능 액체 크로마 토그래피 (UPLC)와 같은 큰 감도와 악기를 사용, 우리는 이것이 하나의 벌레의 신진 대사 종에 metabolites과 원소 정관의 신뢰성 quantitation을 허용하지 않을 수 있습니다 예상하지만, 공부 동물 번호 더욱 감소를 허용 수 있습니다. 우리는 각 변형이 적은 어번던스 metabolites을 안정적으로 검출하는 것으로 실험 1,000 동물의 벌레 인구를 공부했습니다. 그러나, GABA 같은 metabolites는 단 안정의 순서에 nematodes의 훨씬 더 큰 인구에 계량 수1x10 6 동물 4.
요약, 안정 동위 원소 프로 파일링 오래 대사 타고난 오류를 공부하고 활용되어 비침습 및 안전 (비 방사성) 접근 방식을 제공합니다. C.이 방법의 응용 엘레간스 개별 유전자 장애 및 / 또는 pharmacologic 에이전트 노출에서 발생할 수 있습니다 생체내, 전체 동물 수준에서 발생하는 실시간 대사 변경에 조사를 소설 용량을 제공합니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 국립 보건원 (K08 - DK073545 및 NICHD 후원 지적 및 발달 장애 연구 센터 새로운 탐정 수상), 필라델피아 재단, 그리고 펜실베니아 맥카베 수상 대학 (MJF)뿐만 아니라 트리스탄에 의해 일부 자금되었습니다 멀런 기금 (MJF과 내). 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 대변하지 않습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| S. basal | 1 - page 59 | Protocols A and B | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C-8503 | Protocol B |
| OP50 E. coli | Caenorhabditis Genetics Center | Protocols A and C | |
| K12 E. coli | Caenorhabditis Genetics Center | Protocol B | |
| NGM agar | Research Products International Corp. | N81800-1000.0 | Protocols A, B, and C |
| 13C glucose (universally labeled) | Cambridge Isotope Laboratories | CLM-1396 | Protocol A and C |
| 13C glucose (1,6 labeled) | Cambridge Isotope Laboratories | CLM-2717 | Protocol B |
| 60% Perchloric acid (PCA) | Fisher Scientific | MK2766500 | Protocols A and B |
| ε-aminocaproic acid (Internal Standard) | Sigma-Aldrich | A-2504 | Protocols A and B |
| MTBSTFA | Regis | 270243 | Protocol E |
| Acetonitrile | Regis | 270010 | Protocol E |
| AG 1-X8, 100-200, Chloride form resin | Bio-Rad | 140-1441 | Protocols A and B (organic acid extraction) |
| AG 50W-X8, 100-200, Hydrogen form resin | Bio-Rad | 142-1441 | Protocols A and B (amino acid extraction) |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S-8875 | Protocol C |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | Protocol C |
| 3N HCl | Sigma-Aldrich | 320331 | Protocol D |
| 1N HCl | Sigma-Aldrich | 320331 | Protocol A |
| 0.1 N HCl | Sigma-Aldrich | 320331 | Protocol D |
| 4N NH4OH | Sigma-Aldrich | 30501 | Protocol D |
| 4N KOH | Sigma-Aldrich | 484016 | Protocols A and B |
| Deionized water | Milli Q Biocel | ZMQA60F01 | Protocol D |
| Helium | Airgas | 24001364 | Protocol C2 |
| SMZ-800 Zoom Stereo-Microscope | Nikon Instruments | NI MNA41000 | Protocols A, B, and C |
| pH meter | Fisher Scientific | S68167 | Protocols A and B |
| Table top centrifuge - 5804R | Eppendorf | 05-400-93 | Protocols A and B |
| Incubated platform shaker | New Brunswick Scientific | M1324-0004 | Protocol B |
| Mini LabRoller Rotator | Labnet International | H-5500 | Protocols A and B |
| Pestles | Kontes Corp | K749520-0090 | Protocols A and B |
| Drill | Kontes Corp | K749540-0000 | Protocols A and B |
| 1 L glass beaker | Fisher Scientific | 02-539P | |
| 1 L Erlenmeyer Flasks | VWR international | 89000-368 | |
| 25 mL Erlenmeyer Flasks | VWR international | 89000-356 | Protocol B |
| 7ml round-bottom glass tubes + rubber stopper | VWR international | VT6431 | Protocols A, B, and C1,C2 |
| 10 ml round-bottom glass tubes + rubber stopper | VWR international | VT6430 | Protocol C2 |
| Blue top tubes | Labco | 438B | |
| 50 ml conical plastic tubes | Falcon BD | 14-959-49A | All protocols |
| 1.5 ml microfuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | Protocols A and B |
| Syringes (1 mL, 10 mL, 20 mL) | BD Biosciences | 301025, 301029, 301031 | Protocols C1 and C2 |
| 25 gauge needles | Fisher Scientific | 22-253-131 | Protocols C1 and C2 |
| Poly-Prep Chromatography Columns | Bio-Rad | 731-1550 | Protocol D |
| Pasteur pipettes | VWR international | 14673-043 | Protocol D |
| 60mm Petri dishes | VWR international | 25373-085 | Protocol C |
| Glass chamber (cut bottom of 1 L flask) fitted with grease-sealed 3-way stopcock | Custom Made | Protocol C | |
| Optically transparent glass plate | Custom Made | Protocol C | |
| Reacti-Vap III Evaporator | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 18826 | Protocol D |
| Cotton | VWR international | 14224-516 | Protocol D |
| High Vacuum Grease | Dow Corning | 1597418 | Protocol C1 |
| Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-18 | Protocol B |
| Timer | ISC Bioexpress | T-2504-5 | Protocol C |
| Gas-Ratio Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Protocol D | |
| GC-MS | Hewlett-Packard | 5980/5971 | Protocol D |
| GC-MS | Agilent Technologies | 6980N/5973N | Protocol D |
| HPLC | Varian Inc., Agilent | 9010 | Protocol D |
References
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- Dingley, S. Mitochondrial respiratory chain dysfunction variably increases oxidant stress in Caenorhabditis elegans. Mitochondrion. 10, 125-136 (2010).
- Jones, B. N., Gilligan, J. P. o-Phthaldialdehyde precolumn derivatization and reversed-phase high-performance liquid chromatography of polypeptide hydrolysates and physiological fluids. Journal of chromatography. 266, 471-482 (1983).
- Falk, M. J. Metabolic pathway profiling of mitochondrial respiratory chain mutants in C. elegans. Molecular genetics and metabolism. 93, 388-397 (2008).
- Yudkoff, M. Measuring in vivo ureagenesis with stable isotopes. Molecular genetics and metabolism. 100, Suppl 1. 37-41 (2010).
- Tsang, W. Y., Sayles, L. C., Grad, L. I., Pilgrim, D. B., Lemire, B. D. Mitochondrial respiratory chain deficiency in Caenorhabditis elegans results in developmental arrest and increased life span. J Biol Chem. 276, 32240-32246 (2001).
