Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Стабильный Изотопный Профилирование посредник Flux Метаболический в развивающихся странах и взрослой стадии Caenorhabditis Элеганс Published: February 27, 2011 doi: 10.3791/2288
* These authors contributed equally

Summary

Стабильный изотопного профилирования с помощью газовой хроматографии масс-спектрометрического анализа посредника потока метаболических описан в нематода,

Abstract

Стабильный изотопного профилирования давно разрешено чувствительные исследования метаболических последствий генетических мутаций и / или фармакологической терапии в клеточном и млекопитающих моделей. Здесь мы описываем подробные методы для выполнения стабильного изотопного обмена веществ профилирования посредника и метаболического потока в нематода, Caenorhabditis Элеганс. Описаны методы профилирования целого червя свободных аминокислот, меченой углекислоты, маркированные органические кислоты, и меченых аминокислот в животных, подвергшихся воздействию стабильных изотопов либо из раннего развития на нематод питательной среды агара или в начале, как молодые люди в то время как подвергается различным лечения фармакологическими в жидкой культуры. Свободные аминокислоты являются количественно высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в целом аликвоты червь, добываемой в 4%-ной хлорной кислоты. Универсально меченых 13 С-глюкозы или 1,6 - 13 C 2-глюкоза используется в качестве стабильного изотопного предшественником которого меченого углерода прослеживается по масс-спектрометрии в углекислый газ (как атмосферных и растворенных), а также в метаболитов указывает на поток через гликолиз , пируват обмен веществ, и цикл трикарбоновых кислот. Представитель результаты включены, чтобы продемонстрировать эффект изотопного время экспозиции, различные бактериальные протоколы очистки, и альтернативные методы нарушения червя в дикого типа нематод, а также относительная степень изотопного включения в митохондриального комплекса III мутант червей (ISP-1 (qm150) ) по сравнению с диким типом червей. Применение стабильных изотопных профилирования в живых нематод предлагает новый потенциал для расследования в целом животном уровне в режиме реального времени метаболических изменений, вызванных отдельными генетическими нарушениями и / или фармакологической терапии.

Protocol

Протокол: Стабильный изотопного профилирования промежуточного метаболизма во время C. Элеганс развития на пластинах NGM.

* Примечание: Стабильный обогащения изотопа может быть успешно измеряется в молодой популяции нематод взрослых следующий изотоп экспозиции (либо универсально меченного 13 C глюкозы или 1,6 - 13 C 2-глюкозы), начиная либо в начале развития или в раннем взрослом возрасте. Этот протокол обеспечивает одновременный мониторинг здоровья животных, развития и роста на стандартной питательной среды нематоды (НГО), плит, которые не так легко добиться в жидкой культуры.

  1. Подготовка 100 мм чашки Петри с 10 мл среды нематоды роста (НГО), в стандартной методике 1.
  2. Распространение NGM пластин с OP50 Е. 1 палочка и дать высохнуть в течение ночи.
  3. Добавить 500 мкл 200 мМ 1,6 - 13 C 2 глюкозы (для достижения конечной концентрации 10 мМ на тарелку НГО) равномерно по тарелке. Дайте высохнуть в течение ночи.
  4. Bleach беременных взрослых червей 1. Пластина восстановленные яйца на NGM пластины без бактерий или 1,6 - 13 C 2 глюкозы. Инкубировать при 20 ° С в течение ночи.
  5. На следующий день, передача вылупились, L1 арестован личинок на NGM пластин ранее распространялся с 1,6 - 13 C 2-глюкозы и OP50 Е. палочка (на шаге № 2, выше). Расти червей молодой стадии взрослого (48-72 часов, в зависимости от штамма), принимая червей заботиться не голодают.
  6. Сбор синхронный, в первый день молодые черви взрослых из плит с 3-4 мл Базальные С..
  7. Вымойте червей в 50 мл С. Базальные в 50 мл труб Falcon. Разрешить червей для осаждения под действием силы тяжести в течение 5 минут. Удалить супернатант до ~ 5 мл. Повторите мыть два раза больше.
  8. Оценка червь путем подсчета числа три 100 мкл аликвоты 2. Отрегулируйте червь концентрации до 1000 червей / мл базального С..
  9. Внесите 1 мл (1000 червей) в 1,5 мл трубки центрифуги пластик.
  10. Добавить 69 мкл 60% СПС содержащей внутренний стандарт (ε-аминокапроновая кислота) до конечной концентрации 4% СПС и 200 мкмоль внутреннего стандарта.
  11. Давайте червей урегулировать под действием силы тяжести х 5 минут. Снимите и сохраните супернатант в другой трубке.
  12. Grind червь образцы с использованием пластиковых гомогенизатор (Kontes гранул пестиком) и моторизованных сверла (Kontes гранул Пестик Беспроводная Motor) в течение 15 секунд. Визуально подтвердить червь нарушения с помощью световой микроскопии. При необходимости повторите.
  13. Передача супернатант с шага № 11 сочетать с гомогената с шага № 12.
  14. Центрифуга образца при 2250 оборотов в минуту (1300 мкг) в течение 5 минут.
  15. Передача супернатант на свежий 7 стеклянной трубкой мл. Сохранить для гранул белка анализа концентрации, как описано в шаге № 20, ниже.
  16. рН образцов 7-8 (нейтральный) диапазон, используя 4N КОН.
  17. Центрифуга нейтрализованы образцов в 7 стеклянной трубкой мл на 2250 оборотов в минуту (1300 мкг) в течение 5 мин для удаления солей.
  18. Передача супернатант на свежий 7 стеклянной трубкой мл.
  19. Подготовка образцов для нейтрализованы метаболита количественного по:
    1. Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ): Отдельная 50 мкл нейтрализованы образца для прямого впрыска в ВЭЖХ. Свободных аминокислот количественного кислоты осуществляется с помощью ВЭЖХ (Varian) с использованием предварительно колонке дериватизации с о-phthalaldehyde и флуоресцентной детекции, как описано выше 3-4.
    2. Газовая хроматография / масс-спектрометрии (GC / MS): Приступить к добыче оставшиеся нейтрализованы образцы на основе ионообменных смол (Bio-Rad) для GC / MS определения изотопного обогащения аминокислот и органических кислот, как описано в ПРОТОКОЛ D.
  20. Добавьте 1 мл 1 н NaOH, чтобы оставшиеся гранулы белка (из шага # 15) в 7 стеклянной трубкой мл.
  21. Инкубируйте NaOH обработанных белков образца при комнатной температуре, при вращении (LABNET * LabRoller Rotator) в течение ночи до полного растворения.
  22. Используйте 75-100 мкл NaOH обработанных белков для определения концентрации белка с помощью стандартных методов (DC белка пробирной, Bio-Rad).

Протокол В. Стабильность изотопного профилирования промежуточного метаболизма в C. Элеганс молодых людей в культуральной жидкости.

* Примечание: Фармакологические влияния на метаболические посредник потока у взрослых нематод могут быть изучены следующие изотопные начале экспозиции в первый день откладки яиц или на NGM пластин (см. Протокол выше) или в жидкой культуры. Мы предпочитаем последний подход к максимальной экономической эффективности стабильных изотопов и фармакологических агентов использования.

  1. Развести синхронный, первый день откладки яиц молодых людей в С. базальной содержащего 0,0005% холестерина (полученные путем добавления 0,5 мл 1% холестерина (в растворенном виде в 95% этанола) до 1 л С. Базальные) до 2000 животных на 500 мкл.
  2. Настройка ~ 4 мл общего объема культуры (а) в 25 мл колб Эрленмейера, а именно:
    ЛЕЧЕНИЕ: NONE "НАРКОТИКОВ"
    С. Базальные с холестерином 3020 мкл 3020 UL - "наркотики" объем
    Стабильный изотоп (1,6 - 13 C 2-глюкозы) 80 мкл 80 мкл
    К12 E. палочки (OD 660 от 2,5 до 3) 400 мкл 400 мкл
    Молодые черви взрослых (2000) 500 мкл 500 мкл
    Наркотиками (желаемая концентрация) - По желанию
  3. Обложка колбы с фольгой. Встряхните колбы в течение 24 часов при 220 оборотов в минуту при 20 ° С инкубировали платформы шейкера.
  4. Убедитесь в том, колбы не полностью запечатаны, как кислород, необходимые для посредника потока обмена веществ и приводит к маркировке эндогенных метаболитов нематоды.
  5. Вымойте червей путем добавления 4 мл культуры объемом до 46 мл С. базальных в 50 мл коническую пластиковую трубку. Разрешить червей для осаждения под действием силы тяжести в течение 5 минут. Вакуумные всасывания супернатанта до ~ 5 мл остается. Повторите стирать заправку трубки в два раза больше до 50 мл с базальными С..
  6. Концентрат мыть червей до 1000 червей / мл в 1,5 мл трубки центрифуги пластик.
  7. Добавить 69 мкл 60%-ной хлорной кислоты (СПС) и 2 мкл 10 мкМ внутреннего стандарта (ε-аминокапроновая кислота), чтобы достичь конечной концентрации 200 мкмоль внутреннего стандарта и 4% СПС.
  8. Подготовка образцов в соответствии с шагами # 11-22 в Протоколе А.

ПРОТОКОЛ C-1. Мониторинг использования изотопного у взрослых червей на пластинах путем отслеживания меченого углерода в атмосферном и растворенного углекислого газа.

* Примечание: В то время как протоколы и методы B подробно контролировать включение изотопа в свободное метаболитов в течение червей в течение 2-3 дней развития или 1 день взрослой жизни, соответственно, валовой подтверждение успеха и кинетики изотопного включения в течение короткого времени курс (то есть минут до нескольких часов) может быть достигнуто путем мониторинга метки в атмосфере углекислого газа (CO 2) освобождается от червей или содержащейся в растворенного углекислого газа в течение червь экстракта. Живые или убитых бактерий, могут быть поданы на червей при выращивании на пластинах (ПРОТОКОЛ С-1). Бактерии не является необходимым для краткосрочного воздействия изотопов червей в культуральной жидкости (ПРОТОКОЛ С-2).

  1. Подготовка 100 мм чашки Петри по 10 мл NGM агара. Распространение NGM пластин с в прямом эфире или УФ-убил OP50 Е. палочки (как показано на рисунке 1). Разрешить пластин для высыхания на ночь.
  2. Добавить 500 мкл 200 мМ 1,6-меченого-13 C 2-глюкозы OP50 распространение NGM пластин (для конечной концентрации изотопа 10 мм на пластины НГО). Разрешить пластин для высыхания на ночь.
  3. Получить синхронный, первый день откладки яиц, молодые взрослые черви, выращенные на NGM пластин агара распространение только с OP50 Е. палочки.
  4. Передача 1000 молодых взрослых червей в экспериментальных NGM агара, содержащий стабильный изотоп и Е. палочки (подготовлен в соответствии с шагами № 1-2, выше).
  5. Место экспериментальная пластинка NGM (без покрытия) в пользовательских камер стекла оснащены хорошо запечатаны 3-ходовой кран, чтобы обеспечить точный отбор проб атмосферы и замены. Сразу же уплотнение камеры с оптически прозрачного стекла диска. Обложка шов, где стекло диск сидит на пластине с высоким вакуумом жир, чтобы запечатать. Время записи, как "Time 0".
  6. Пример 10 мл атмосферу из стекла камеры 3-ходовой кран с 20 мл шприца на 30, 60, 90 и 120 минут. Передача каждого атмосферного образца заранее подготовленные резиновой пробкой 10 мл превысила стеклянную трубку, содержащую 1 мл 1 мМ NaHCO 3 в 0,1 N NaOH, которая была запаянная.
  7. Inject 10 мл воздух обратно в каждый стакан камеру через 3-ходовой кран использовании 20 мл шприца. Закрыть кран в камеру после взятия пробы / reinjecting атмосферу и, прежде чем возобновить инкубации между точками времени сбора.
  8. Inject 100 мкл 20%-ной фосфорной кислоты через пробки на 10 мл резиновой пробкой превысила стеклянную трубку с СО 2 в атмосфере образца.
  9. Удалите 2 мл атмосферу, и внедрить его в 12 мл сине-топ автоматической пипетки труб предварительно заполненных гелием для атмосферного СО 2 измерения.
  10. Анализ "СО 2 в атмосфере образцы" в газовой Отношение масс-спектрометр (ThermoQuest Финниган Delta Plus).
  11. Открытые стекла камеры следующие два часа изотопа инкубационный период и сбор всех атмосферных проб.
  12. Вымойте червей прочь NGM пластин в 3 мл базальной С..
  13. Вымойте червей в 50 мл С. базальных в 50 мл труб Falcon. Повторите мыть два раза.
  14. Концентрат червей до ~ 1000 червей / мл в 7 мл с круглым дном стеклянной трубки (ы).
  15. Вакуумные уплотнения стеклянной трубкой с резиновой пробкой.
  16. Добавить 100 мкл20% фосфорной кислоты через резиновую пробку со шприцем, чтобы освободить растворенного CO 2.
  17. Удалите 2 мл атмосферу и впрыснуть в 12 мл сине-топ автоматической пипетки труб предварительно заполненных гелием для растворенного CO 2 измерения.
  18. Анализ "растворенного CO 2 образца" в газовой Отношение масс-спектрометр (ThermoQuest Финниган Delta Plus).

Альтернативный протокол (С-2): Мониторинг использования изотопного у взрослых червей в культуральной жидкости путем отслеживания меченого углерода в атмосферном и растворенного углекислого газа.

  1. Получить синхронный, первый день откладки яиц, молодые взрослые черви, выращенные на NGM пластин агара распространяются с OP50 Е. палочки.
  2. Вымойте червей в 50 мл С. базальных в 50 мл труб Falcon. Разрешить червей для осаждения под действием силы тяжести в течение 5 минут. Удалить супернатант до ~ 5 мл. Повторите моет вдвое больше.
  3. Передача 1000 молодых взрослых червей в 1 мл базальной С. до 10 мл с круглым дном стеклянной трубки. Добавить 10,1 мкл 1 М запас универсально меченного 13 С-глюкозы по 1 мл червей для достижения конечной концентрации 10 мМ.
  4. Кислородом с круглым дном стеклянную трубку с червями и изотоп путем обмена атмосферу с проточной 100% кислорода в открытой трубе в течение 2 минут. Сразу же близко трубка с резиновой пробкой.
  5. Встряхните экспериментальные трубы при 20 ° С инкубировали платформы шейкера при 220 оборотах в минуту. Запись времени начала, как "Time 0".
  6. Пример 5 мл атмосферу от 10 мл с круглым дном стеклянную трубку с помощью 10 мл шприцев и 25 иглы через резиновую пробку на 30, 60, 90 и 120 минут.
  7. Передача каждого атмосферного образца заранее подготовленные, резиновой пробки превысила 10 мл стеклянную трубку, содержащую 1 мл 1 мМ NaHCO 3 в 0,1 N NaOH, которая была запаянная.
  8. Inject 5 мл воздух обратно в каждой экспериментальной круглым дном стеклянную трубку с червями и изотопа через резиновую пробку с помощью 10 мл шприцев и 25 иглы.
  9. Резюме инкубации экспериментальных 10 мл с круглым дном стеклянные пробирки, содержащие черви и изотопа, встряхивая при 220 оборотов в минуту между точками времени сбора.
  10. Inject 100 мкл 20%-ной фосфорной кислоты через пробку в атмосфере, содержащей резиновой пробкой превысила 10 мл стеклянной трубки.
  11. Удалите 2 мл атмосферу и впрыснуть в 12 мл сине-топ автоматической пипетки труб предварительно заполненных гелием для атмосферного СО 2 измерения.
  12. Анализ "СО 2 в атмосфере образцы" в газовой Отношение масс-спектрометр (ThermoQuest Финниган Delta Plus).
  13. В конце экспериментального периода, мыть червей в 50 мл С. базальных в 50 мл трубки Falcon. Разрешить червь гранулы для формирования под действием силы тяжести. Вакуумные всасывания супернатанта до ~ 5 мл остается. Повторите стирать в два раза больше в 50 мл базальной С..
  14. Концентрат червей до ~ 1000 червей / мл в 7 мл с круглым дном стеклянной трубки. Добавить резиновой пробкой и трубки вакуумного уплотнения. Добавить 100 мкл 20%-ной фосфорной кислоты с использованием 1 мл шприц с иглой 25 через резиновую пробку, чтобы освободить растворенного CO 2 червя.
  15. Удалите 2 мл атмосферу и впрыснуть в 12 мл сине-топ автоматической пипетки труб предварительно заполненных гелием для растворенного CO 2 измерения.
  16. Анализ "растворенного CO 2 образца" в газовой Отношение масс-спектрометр (ThermoQuest Финниган Delta Plus).

Протокол Д. Обработка нейтрализованы образцы протоколов и В для аминокислот и органических кислот анализа методом газовой хроматографии / масс-спектрометрии.

  1. Бусы приготовления:
    1. Добавить 1 N HCl как Ag 1 и Ag 50 бусин отдельно в 1 л стаканы.
    2. Движение каждой колбы в течение 30 минут с магнитной мешалкой.
    3. Вымойте бисером деионизированной водой в 10 раз до рН промывных равны рН воды.
  2. Колонка приготовления:
    1. Вставьте ватный тампон чуть выше самой узкой части пипетки Пастера чаевые.
    2. Добавить взимается бусины на каждый из двух колонок по образцу, заполняя каждую примерно до одной трети высота колонны. Используйте AG1 шарики для извлечения органических кислот. Используйте AG50 шарики для извлечения аминокислот кислоты.
  3. Пример обработки:
    1. Добавить 500 мкл образца на колонку с заряженными бисером AG1. Ничего не добавил к образцу (см. Протокол, шаг № 19В) до обращения в AG1 колонку для извлечения органических кислот, если образец уже при нейтральном рН.
    2. Добавить 1 мл 0,1 N HCL, чтобы остающиеся пробы перед его применением для AG50 колонку для извлечения аминокислот.
    3. Разрешить образцы для запуска полностью через колонки.
    4. Вымойте колонка с водой в 10 раз, пока промывные нейтральной (7-8 рН).
    5. Элюировать столбцы свежие, маркированные стеклянные флаконы 4 мл образца:
      1. Для извлечения органических кислот, добавьте 3 мл 3 раствора для AG1 колонке. Это дает возможность анализа изотопного обогащения в общее число меченых атомов углерода среди 3-углеродных видов (лактат), 4-углеродных видов (аспартат, сукцинат, малат),5-углеродных видов (глутамат), и 6-углеродных видов (цитрат).
      2. Для извлечения Amino кислота: добавить 3 мл 4 N NH 4 OH до AG50 колонке. Это дает возможность анализа изотопного обогащения в общее число меченых атомов углерода среди 3-углеродных видов (аланин) и 5-углеродных видов (глутамин).
    6. Место образца флаконов в реакционном Vap III Испаритель ночь до полного высыхания.

Е. Derivitization проб и настройки машины для масс-спектрометрии

Добавить 50 мкл ацетонитрила и 50 мкл N-метил-п-бутилдиметилсилил трифторацетамид (МТБСТФА) для каждого образца флаконе. Обложка, перемешать и инкубировать 30 минут при 60 ° C. Inject 1-2 мкл на пробу в газовой хроматографии / масс-спектрометр (ГХ / МС).

Ф. Анализ результатов

  1. Количественная оценка аминокислоты пики кислоты. Количественный каждой аминокислоты с помощью анализа ВЭЖХ рассчитывается площадь каждого пика по сравнению с показателями внутреннего стандарта.
  2. Расчет изотопного обогащения. Стабильный изотопное обогащение рассчитывается в Excel (Microsoft) для каждого вида в соответствии со следующей формулой: Превышение Atom процент, скорректированный (APE) = (R са-R й) * 100 / [(R са-R й) +100] где R SA - Отношение образца и R-м - Соотношение стандарта.
  3. Оценка статистических различий между образцом обогащения. Стьюдента тест используется для оценки значимости относительной аминокислот и изотопные различия между образцами этикетке.

Репрезентативные результаты:

Стабильный изотоп хорошо включены в молодых взрослых червей, о чем свидетельствует меченого углерода измеряется в СО 2 в атмосфере и растворенного CO 2 червя. В червей кормили либо жизни или УФ-облучении убит OP50 Е. палочка, соотношение 13 CO 2 до 12 CO 2 было больше в растворенном червь CO 2 доли по отношению к выпустила атмосферного СО 2 (рис. 1). Кормление черви живут или убиты OP50 Е. кишечной существенно не изменит измеряется 13 CO 2 до 12 CO 2 соотношение мыть экстракт червя (см. Протокол C1).

Длительное воздействие стабильного изотопа из ранних личиночных период увеличилась изотопного обогащения посредников метаболитов. Исправлено Атомы Процент Превышение меченого углерода определяется в посредником метаболитов молодого взрослого дикого типа червей была больше всех видов глутамата, когда червей кормили универсально меченного 13 С-глюкозы и живых бактерий на протяжении развития по сравнению с аналогичным подопытных животных кормили меченых бактерий в течение 48 часы только после достижения откладки яиц взрослой стадии (рис. 2).

Влияние очистки раза по изотопному обогащению урана. Независимо от воздействия timecourse, все животные, выращенные на пластинах были "очищены" от изотопной метки вниз по течению до подготовки к ГХ / МС анализа. Сравнение протоколов очистка была выполнена, как показано на рисунке 2, в том числе питание червей в течение 2 часов на NGM пластин агара распространение с живыми бактериями, без свежего изотопа или питаясь NGM пластинах агар без бактерий в течение 2 часов, и питание на NGM пластинах агар без бактерий для 2 или 6 часов. Вне зависимости от изотопного конечно экспозиции, никаких существенных различий в изотопное обогащение в посредником метаболитов из молодых взрослых целом экстракт червя наблюдается, когда животные были очищены на пластинах без бактерий для 2 или 6 часов. С другой стороны, менее изотопное обогащение наблюдалось в посредником метаболитов, когда животные были впоследствии 'очищен' избыточных изотопов, питаясь бактериями немеченого течение двух часов. Однако увеличение обогащения +3, +4, +5 и вид был очевидным, когда черви подвергались изотоп из ранних личиночных период. Таким образом, оптимальным протоколом очистки была определена в очистке черви после их инкубации на NGM пластин с распространением стабильных изотопов и бактерий последующей инкубации в течение 2 часов на unspread пластин NGM. Следует отметить, червей, выращенных в жидкой культуры промывали подальше от изотопной метки и бактерий в трех томах базального С. (см. Протокол B); ГХ / МС анализа стирок не показали никакого существенного изотопного обогащения третьей стирки.

Worm шлифовальные дали максимальное обогащение посредника метаболитов. Чтобы оптимизировать процент обогащения посредников метаболитов следующих аналогичных условиях лечения, сравнивались образцы червь нарушается с помощью ультразвука в одиночку или ультразвуком плюс шлифования. Рисунок 3 показывает, что черви нарушена в результате воздействия изотопов с помощью ультразвука плюс шлифовальные имели больший изотопного обогащения, чем образцы нарушается только с помощью ультразвука. Эти данные показывают, что более суб-организменном фракций были сорваны шлифовальные, чем с помощью ультразвука. Последующие исследования показали, измельчение в одиночку без sonicatioя был достаточным для достижения максимальной изотопного обогащения (данные не приведены).

Всего червь изотопного экспозиции позволяет анализировать посредник потока пути метаболизма. Кормление черви со стабильной изотопной предшественника как во время разработки (ПРОТОКОЛ, рисунок 4А) или в начале у взрослых животных этапе (ПРОТОКОЛ В, рис 4В) позволяет чувствительной анализ изотопного обогащения среди метаболитов указывает на поток через гликолиз (лактат, аланин), пируват метаболизма (аланин), и цикл трикарбоновых кислот (цитрат, малат, сукцинат, аспартат, глутамат и глутамин). Универсально меченных 13 С-глюкозы обеспечивает надежную маркировку всех видов углерода, тогда как использование 1,6 - 13 C 2-глюкозы позволяет надежной маркировки только в +1 видов каждого метаболита. Эта техника может чутко распознавать отличия от дикого типа червь потока метаболических посредником между дыхательной цепи митохондрий мутантные штаммы, например, комплекс III дыхательной цепи митохондрий субъединицы мутант ISP-1 (qm150). Рисунок 5 иллюстрирует, насколько велики различия наблюдаются в абсолютной этикетке между ISP-1 (qm150) и N2 червей каждый подвергается в течение 24 часов до 1,6 - 13 C 2-глюкозы в культуральной жидкости с К12 E. кишечной бактерии с первого дня откладки яиц молодые стадии взрослых (Протокол B). Дополнительная стабильной изотопные исследования в диапазоне митохондриальной мутант червей продолжаются.

Рисунок 1
Рисунок 1. Универсально меченных 13 С-глюкозы стабильный изотоп был хорошо включены в молодых взрослых червей 13 CO 2: 12. CO 2 соотношение (атомов процентов превышения (APE), исправленный) в дикого типа (N2) червей следующие два часа кормления универсально- меченого 13 С-глюкозы и УФ-либо убиты или жить OP50 бактерий на пластинах (ПРОТОКОЛ C1). 13 С включением в червь метаболитов надежный после двух часов изотопа экспозиции. Синий и красный полоски указывают на относительную изотопного обогащения в газовой фазе ("атмосферного СО 2") и жидкой фазы ("червь CO 2"), соответственно.

Рисунок 2
Рисунок 2. Длительное воздействие изотопа из ранних личиночных периода, а затем 'очистки' червей на NGM пластинах агар без бактерий увеличилось изотопного обогащения свободного глутамата молодых червей взрослых. Изотопного обогащения в глутамата видов показан для червей кормили на пластинах NGM агар с универсально-меченых 13 С-глюкозы и OP50 бактерий либо протяжении развития от L1 личиночной стадии через 959 ячейки молодых стадии взрослого ("L1", см. Протокол), или в течение сорока восьми часов с начала, когда черви достигли первого дня откладки яиц молодых взрослой стадии ("Я."). X-ось указывает общее число меченых атомов углерода в каждой глутамата видов. Y-ось обозначает процент обогащения (исправлено атомов в избытке (APE)). Зеленые полоски указывают червей очищается после воздействия изотопов путем подачи OP50 Е. кишечной без изотопа на NGM пластин в течение двух часов до извлечения СПС. Синий и серый полоски указывают червей очищается после контакта изотопа на NGM пластины без бактерий или изотопов в течение двух-шести часов, соответственно, до извлечения СПС.

Рисунок 3
Рисунок 3. Разрушение червей путем измельчения дает максимальный изотопного обогащения в метаболитов посредника червя. Процент углерода обогащение измеряется в +1 цитрат видов дикого типа червей лечение в течение 24 часов в жидкой культуре с 1,6 - 13 C 2-глюкозы без бактерий (Протокол B). Черные и серые полоски указывают на червей, которые были разрушены с помощью ультразвука или только с помощью ультразвука и шлифовальные, соответственно. Изотопное обогащение после воздействия 1,6 - 13 C 2-глюкоза лучше всего оценивать в метаболитов наклеена на один атом углерода. В отличие от этого, этикетка обогащается у всех видов каждого метаболита, когда универсально меченных-13 С-глюкозы используется.

Рисунок 4
Рисунок 4. Представитель результаты иллюстрируют степень изотопного обогащения червя посредника метаболитов указывает на поток через гликолиз, пируват обмен веществ, и цикл трикарбоновых кислот. Исправлено атомов процентов превышения (APE) определяли у молодых взрослых дикого типа (N2 Bristol) червей следующие 1, 6 - 13 C 2-глюкозы воздействия либо (А) в процессе развития от L1 этап на пластинах (ПРОТОКОЛ), или (б) начиная с первого дня откладки яиц, как молодые люди в течение 24 часов в культуральной жидкости (ПРОТОКОЛ В) . Ошибка полоски показывают стандартное отклонение, где требуется надежное изотопных данных с трех биологических воспроизводит не было.


Рисунок 5. Абсолютная аминокислоты количественного кислоты аминокислот метаболита видов дикого типа и мутантных штаммов митохондриальной червя. Абсолютная метка в каждой из четырех видов аминокислот рассчитывается путем умножения ВЭЖХ определенной концентрации свободных аминокислот кислоты (нмоль / мг белка червь) на исправлены атомов процентов превышения (APE) для каждого вида. Серые и черные полоски указывают на дикого типа (N2 Бристоль) и митохондриального комплекса субъединицы III мутантных штаммов (ISP-1 (qm150)), соответственно. Бары указывают среднем три биологические эксперименты повторить в напряжении.

Discussion

Применение масс-спектрометрии для измерения изотопного изобилии в посредником метаболитов дает удивительно подробную картину критических биохимические изменения 5. Здесь мы представили подробные протоколы для эксплуатации этого высокую чувствительность и специфичность методологии оценки потока посредника в метаболических генетически универсальная модель животного, C. Элеганс. Действительно, кормление живых животных со стабильным изотопом помечены метаболические предшественники (например, 13 С-глюкозы) позволяет романа понимание посредника метаболические пути потока при измерении изотопного обогащения в нижнем течении метаболитов. Мы разработали надежную методологию для получения надежного анализа поток через гликолиз, пируват обмен веществ, и цикл трикарбоновых кислот. Это может быть достигнуто как в животных, которых кормили стабильного изотопа с ранней личиночной стадии развития или в начале в пост-митотического взрослый период. Изотопное обогащение в различных метаболитов виды могут быть изучены в сочетании с целым червем свободных аминокислот профилирования кислоты высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше 4, чтобы определить абсолютного изотопного обогащения различных видов свободных аланин червем, аспартат, глутамат и глутамин. В самом деле, закономерности изотопного обогащения, полученных при измерении аминокислот и органических кислот в анализируемых аликвот от 1000 до 2000 молодых взрослых синхронных червей. Такая методология может чутко различать ненормальное потока посредником в ядерных генов митохондриального основе мутантных штаммов по сравнению с диким типом червей.

Этот метод имеет значение для расследования поток изменений в определенных биохимических путей, имеющих отношение к общей врожденные нарушения обмена веществ. В частности, утилизации глюкозы, меченных стабильными изотопами углерода сообщает поток через центральные метаболические пути, имеющие отношение к митохондриальных болезней. Действительно, наши данные свидетельствуют о применении такой методики может чутко различать ненормальное потока посредником в ядерных генов основе митохондриального комплекса субъединицы III мутантного штамма (ISP-1 (qm150)) по сравнению с диким типом червей.

Важно признать, что, поскольку изотопный экспозиции завершена в течение периода от одного до нескольких дней, количественные изотопного обогащения представляет "устойчивое состояние" обогащения стоимости, а не количественно поток на протяжении определенного периода времени, может быть определена в клеточной модели подвергается изотопа в течение минут или часов. Другим потенциальным ограничением допрос пути потока в течение нематоды событие связано с различными длинами развития личинок, которые происходят, в частности, мутантные штаммы. Например, во многих тяжелых митохондриальных мутаций, как известно, причиной ареста на третьем (L3) личиночной стадии 6. Таким образом, анализ изотопного включения только у животных, которые выживают до взрослого возраста не может быть репрезентативной для всего населения мутанта. Однако, эта методика может быть адаптирована для оценки изотопного включения в посредником метаболитов в определенное личиночной стадии (например, L2), а не ждать для животных достичь взрослого состояния. Точно так же животные, которые входят альтернативные личиночной стадии известный как Dauer, скорее всего, значительно измененные (скорее всего меньше) метаболических потоков по отношению к животным, которые приступят непосредственно через четыре стадии личиночного. Будущие исследования также могут быть выполнены, чтобы непосредственно оценку изотопного включения в Dauer стадии животных разных генетических фон. Демонстрация животных стабильного изотопа в течение фиксированного периода времени (в данном случае от 24 до 48 часов), начиная однажды животных достигла стадии молодые взрослые (как указано в протоколе B) устраняет влияние переменной периоды развития. Хотя 13 С-глюкозы только допрашивает гликолиза, пируват обмен веществ и поток трикарбоновых кислот цикле, других изотопных индикаторов потенциально могли бы быть оценены допросить биохимических потоков путь через другие пути интерес у нематод. Например, 15 N-глицин может быть использован для оценки аминокислоты оборот кислоты у нематод.

Другим потенциальным ограничением этого подхода является уровень чувствительности метаболита обнаружения. Наш опыт показывает, минимум 500 молодых взрослых нематод являются необходимыми для успешного количественного изотопного включения посредством ВЭЖХ и ГХ / МС методов, используемых здесь. Использование инструментов с большей чувствительностью, таких как ультра жидкостной хроматографии (UPLC), может разрешить дальнейшее сокращение числа животных изучен, хотя мы ожидаем, что это вряд ли разрешение надежный количественного определения метаболитов и изотопного включения в метаболита видов из одного червей. Мы изучали червя населения 1000 животных на эксперимент, который мы нашли надежного выявления малого метаболитов изобилии в каждой линии. Однако, некоторые метаболиты, такие как ГАМК, может быть надежно количественно в гораздо больших популяций нематод, на порядок1x10 6 животных 4.

Таким образом, стабильный изотоп профилирование обеспечивает неинвазивный и безопасный (нерадиоактивных) подход, который уже давно используется для исследования врожденных нарушений обмена веществ. Применение этой методики к C. Элеганс предоставляет новые возможности для расследования в естественных условиях, в режиме реального времени, метаболические изменения, которые происходят в целом на уровне животных, которые могут возникнуть в результате индивидуальных генетических расстройств и / или воздействия фармакологических агентов.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Эта работа была частично финансируется Национальным институтом здоровья (K08-DK073545 и NICHD спонсируемых интеллектуальной и порокам развития научно-исследовательский центр Новая премия следователь), Филадельфии Фонда и Университета Пенсильвании награду МакКейб (MJF), а также Тристан Маллен фонда (MJF и МГ). Содержание несут их авторы и не обязательно отражает официальную точку зрения Национального института здравоохранения.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
S. basal 1 - page 59 Protocols A and B
Cholesterol Sigma-Aldrich C-8503 Protocol B
OP50 E. coli Caenorhabditis Genetics Center Protocols A and C
K12 E. coli Caenorhabditis Genetics Center Protocol B
NGM agar Research Products International Corp. N81800-1000.0 Protocols A, B, and C
13C glucose (universally labeled) Cambridge Isotope Laboratories CLM-1396 Protocol A and C
13C glucose (1,6 labeled) Cambridge Isotope Laboratories CLM-2717 Protocol B
60% Perchloric acid (PCA) Fisher Scientific MK2766500 Protocols A and B
ε-aminocaproic acid (Internal Standard) Sigma-Aldrich A-2504 Protocols A and B
MTBSTFA Regis 270243 Protocol E
Acetonitrile Regis 270010 Protocol E
AG 1-X8, 100-200, Chloride form resin Bio-Rad 140-1441 Protocols A and B (organic acid extraction)
AG 50W-X8, 100-200, Hydrogen form resin Bio-Rad 142-1441 Protocols A and B (amino acid extraction)
NaHCO3 Sigma-Aldrich S-8875 Protocol C
NaOH Sigma-Aldrich S8045 Protocol C
3N HCl Sigma-Aldrich 320331 Protocol D
1N HCl Sigma-Aldrich 320331 Protocol A
0.1 N HCl Sigma-Aldrich 320331 Protocol D
4N NH4OH Sigma-Aldrich 30501 Protocol D
4N KOH Sigma-Aldrich 484016 Protocols A and B
Deionized water Milli Q Biocel ZMQA60F01 Protocol D
Helium Airgas 24001364 Protocol C2
SMZ-800 Zoom Stereo-Microscope Nikon Instruments NI MNA41000 Protocols A, B, and C
pH meter Fisher Scientific S68167 Protocols A and B
Table top centrifuge - 5804R Eppendorf 05-400-93 Protocols A and B
Incubated platform shaker New Brunswick Scientific M1324-0004 Protocol B
Mini LabRoller Rotator Labnet International H-5500 Protocols A and B
Pestles Kontes Corp K749520-0090 Protocols A and B
Drill Kontes Corp K749540-0000 Protocols A and B
1 L glass beaker Fisher Scientific 02-539P
1 L Erlenmeyer Flasks VWR international 89000-368
25 mL Erlenmeyer Flasks VWR international 89000-356 Protocol B
7ml round-bottom glass tubes + rubber stopper VWR international VT6431 Protocols A, B, and C1,C2
10 ml round-bottom glass tubes + rubber stopper VWR international VT6430 Protocol C2
Blue top tubes Labco 438B
50 ml conical plastic tubes Falcon BD 14-959-49A All protocols
1.5 ml microfuge tubes Fisher Scientific 02-681-320 Protocols A and B
Syringes (1 mL, 10 mL, 20 mL) BD Biosciences 301025, 301029, 301031 Protocols C1 and C2
25 gauge needles Fisher Scientific 22-253-131 Protocols C1 and C2
Poly-Prep Chromatography Columns Bio-Rad 731-1550 Protocol D
Pasteur pipettes VWR international 14673-043 Protocol D
60mm Petri dishes VWR international 25373-085 Protocol C
Glass chamber (cut bottom of 1 L flask) fitted with grease-sealed 3-way stopcock Custom Made Protocol C
Optically transparent glass plate Custom Made Protocol C
Reacti-Vap III Evaporator Thermo Fisher Scientific, Inc. 18826 Protocol D
Cotton VWR international 14224-516 Protocol D
High Vacuum Grease Dow Corning 1597418 Protocol C1
Aluminum Foil Fisher Scientific 01-213-18 Protocol B
Timer ISC Bioexpress T-2504-5 Protocol C
Gas-Ratio Mass Spectrometer Thermo Fisher Scientific, Inc. Protocol D
GC-MS Hewlett-Packard 5980/5971 Protocol D
GC-MS Agilent Technologies 6980N/5973N Protocol D
HPLC Varian Inc., Agilent 9010 Protocol D

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hope, I. A. C. elegans: A practical approach. , University Press. Oxford. (1999).
  2. Dingley, S. Mitochondrial respiratory chain dysfunction variably increases oxidant stress in Caenorhabditis elegans. Mitochondrion. 10, 125-136 (2010).
  3. Jones, B. N., Gilligan, J. P. o-Phthaldialdehyde precolumn derivatization and reversed-phase high-performance liquid chromatography of polypeptide hydrolysates and physiological fluids. Journal of chromatography. 266, 471-482 (1983).
  4. Falk, M. J. Metabolic pathway profiling of mitochondrial respiratory chain mutants in C. elegans. Molecular genetics and metabolism. 93, 388-397 (2008).
  5. Yudkoff, M. Measuring in vivo ureagenesis with stable isotopes. Molecular genetics and metabolism. 100, Suppl 1. 37-41 (2010).
  6. Tsang, W. Y., Sayles, L. C., Grad, L. I., Pilgrim, D. B., Lemire, B. D. Mitochondrial respiratory chain deficiency in Caenorhabditis elegans results in developmental arrest and increased life span. J Biol Chem. 276, 32240-32246 (2001).

Tags

Биология развития выпуск 48 стабильных изотопов аминокислоты количественного кислоты органические кислоты количественный нематоды обмен веществ
Стабильный Изотопный Профилирование посредник Flux Метаболический в развивающихся странах и взрослой стадии<em> Caenorhabditis Элеганс</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Falk, M. J., Rao, M., Ostrovsky, J., More

Falk, M. J., Rao, M., Ostrovsky, J., Daikhin, E., Nissim, I., Yudkoff, M. Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (48), e2288, doi:10.3791/2288 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video
Waiting X
Simple Hit Counter