ワームの研究室の紹介：培養ワームから変異へ

Summary

表現型欠陥の変異体のスクリーニングは、特定の生物学的プロセスで機能する遺伝子を同定するための簡単​​な方法です。この記事では、どのように文化の自由生活のワーム（例えば、への説明

Abstract

紫外線（TMP / UV）と組み合わせエチルメタンスルホネート（EMS）と4,5'、8 - トリメチル：このプロトコルは、実験室で、どのように2つの代替方法を使用して突然変異を起こさせるために線虫を維持するために手順を説明します。線虫が原因の自己施肥雌雄同体と動物あたりの子孫の数百を生成することができる男性で構成される彼らのシンプルなボディプランと配偶システムの遺伝学研究のための強力な生物学的なシステムです。線虫は、細菌の芝生を含有する寒天プレートに保持され、簡単にプレートからピックを使用して別のに転送することができます。 TMP / UVは、主に欠失を誘導しながらEMSは、一般的に点突然変異と小さな欠失を誘導するために使用されるアルキル化剤です。使用されている線虫の種によっては、EMSとTMPの濃度は、最適化する必要があります。線虫Pristionchusのpacificusの劣性変異を分離するには、F2世代の動物が視覚的に表現型のスクリーニングを行った。これらのメソッドを説明するために、我々は、ワームの突然変異誘発し、非協調（UNC）、みすぼらしい（DPY）と変圧器（トラ）変異体を探した。

Protocol

パート1：準備線虫の増殖培地（NGM）ペトリ皿

このような線虫やPと実験線虫pacificusは通常、線虫の増殖培地^{（NGM）1を}含む6センチメートルペトリプレート上で実験室で培養されています。ワームは、20 ° Cに保たれていますが、気温の範囲（° C 4との間の - 25℃）でインキュベートすることができる線虫の種および実験計画に応じて、。 NGMでプレートを準備するには、標準的な滅菌技術は、真菌や細菌汚染を防ぐために使用する必要があります。以下は、NGMプレートを準備するプロトコルです。

1. 15gの寒天、2.4グラムのNaCl、2gのトリプトン、および2.72グラムのKH ₂ 2 Lの三角フラスコ中のPO _4を量り、水で1 Lにボリュームを構成してオートクレーブし、60℃の水浴中を冷却することができます。
2. 0.8ミリリットル1 M _塩化カルシウム、コレステロール（エタノール中の5 mg / ml）をそれぞれ、と1 M MgSO _4を追加。真菌や細菌汚染を防ぐために、1 mlのストレプトマイシン（100 mg / ml）をし、1ミリリットルナイスタチン（10 mg / mlのは）培地の各リットルに追加することができます。
3. Unispenseのマシンを使用し、無菌状態を維持し、目的の板にメディアを注ぐ。プレートは完全な約2 / ³番目に記入してください。標準的な直径60mmのプレートは、メディアの約10mlが必要です。寒天が完全にgelifiedされるまで、プレートを移動したりしないでください、それ以外は困難な実体顕微鏡でワームを集中すること、寒天の表面に凹凸があるでしょう。
4. いったん乾燥させ、プレートはすぐに播種または4℃で保存できます細菌でシードまでのC。

パート2：OP50細菌を準備し、NGMペトリ皿を播種

P. pacificusは、大腸菌 OP50株を食べることによって実験室で培養される。 OP50は、それによって、ワーム¹の可視化を容易に薄い芝生を形成し、NGMプレート上の限られた成長を持っています。 OP50の文化を成長させるために、LB -ブロスを使用します。

1. 500 mlのスクリューキャップのボトルに、蒸留水とオートクレーブで500 mlにボリュームを構成する5グラムバクトトリプトン、2.5 gの酵母エキスと2.5グラムのNaClを追加。
2. 無菌条件下での培養プレートからOP50のシングルコロニーを液体培地に接種し、37℃で一晩成長させ℃に
3. LB - OP50は、使用する準備ができており、無菌性が維持されている場合、4℃で数ヶ月保存できます。プレートがシードされる必要がある場合は、必ず小さな滅菌ビーカーに培養液の少量を注ぎ、これは株式の文化の汚染を防ぐことができます。
4. シードのプレートに、直径60mm NGMペトリ皿とそれを広めるために渦巻きにOP50の100から120μlを分注する。
5. 成長する芝生のため、室温で一晩これらのシードプレートをインキュベートする。これらの生成済のプレートは、現在、最大3週間までは4℃で保存することができます。倒立位置にそれらを保管すると急激な乾燥を防ぐのに役立ちます。

パート3：ピックを作る

このセクションでは、ワームのピックを作成する方法について説明します。ピックは、ある場所から別の場所にワームを転送するために使用されます。一部の研究者がわずかに異なる金属組成を好むかもしれませんがピックは、30ゲージ90％プラチナ10％イリジウムのワイヤーで作られています。

1. ワイヤーの3-4 cmのカット、場所は、パスツールピペット（その先端より小さい長さに切断された）の先端部、及び内部のそれの0.5 cmのブンゼンバーナーを介してガラスにそれを封印。ガラスから突出線の長さは約3〜3.5センチメートルですが、個々の好みに応じて変えることができます。
2. ハンマーやペンチを使って出ているワイヤの端を平らに。その後、スクープを形成するために平坦化された部分を上に曲げる。
3. ワームや寒天の損傷を防ぐために、サンドペーパーでピックのシャープなエッジを滑らかに。

パート4：ピッキングワーム

1. ワームを選択するために、穿刺または損傷寒天表面​​に注意していないながら、厚い粘着性細菌との先端を炎に白金線を殺菌し、コートに細菌の芝生に沿ってピックアップの平坦化された先端をドラッグします。
2. 実体顕微鏡を使用して、非常に軽くワームはピックで細菌に付くまでピックアップされるワーム/ワームに対してスティッキー先端を磨きます。
3. ワームは、ピックの先端にしたら、触れたり、新しいプレートの細菌の芝生に対してピックの先端をスライドさせて新しいプレートにすぐにそれを転送し、ワームがオフクロールする必要があります。ケアは、ワームは、それが難しいそれらを取得すること穴にクロールする他のプレートに寒天の表面を傷つけないように注意する必要があります。ワームが長すぎるためにピックしたままの場合、それは生気を奪うかもしれない。

第5部：EMS変異誘発

エチルメタンスルホネート（EMS）は、ゲノム2での突然変異の広いスペクトルを誘導する。変異体は、産卵、筋肉の欠陥などの欠陥によって識別することができますの、性決定、dauer形成、行動、および生殖腺の形成。 EMS変異誘発のためのプロトコルは、Cに対して記載したものと同様です。 エレガンス ^1。

1. 1N NaOHを500mlのを（またはそれ以上）を準備。
2. 4-5取る、ワームの完全な直径6cmペトリ皿、サード幼虫幼若（J3）の段階で数百ワームを含む、プレート当たり滅菌M9 2〜3 ​​mlを使用してからワームを洗う。
3. 滅菌済み、使い捨て15 ml遠心チューブ内のすべてのワームを収集する。ワームは、ペレットを形成するまで5-7分のためのまたは1500 × gで遠心する。
4. 液体を吸引し、再度サスペンドワームにM9の2 mlを使用してください。 M9の2ミリリットルを含むチューブに20μlのEMSを追加し、それを溶かすために振る。その後、静かにワームのサスペンションと渦の2ミリリットルにこのEMSソリューションを追加します。 EMSの最終濃度は47 mMのようになります。注意：EMSが非常に強い変異原性物質であり、ドラフト内で処理する必要があります。この変異原物質と接触するすべての材料は（手袋、ピペ​​ット、チップ）は、非アクティブEMSに1N NaOHで処理されるべきである。全体のEMS突然変異誘発手順の間に二重手袋を着用してください。あなたの機関のガイドラインに従って有害廃棄物を処分する。
5. 遠心管を配置し、パラフィルムでキャップをカバーする、ドラフト内で水平に配置し、3.5時間インキュベートワームを聞かせ。チューブはまた、低速度のロッカー上に配置することができます。
6. チューブを回して、パラフィルムでキャップをカバーする、ワームのシンクまでの垂直位置とインキュベートの場所。
7. 上清を吸引除去し、1N NaOHを含むビーカー/フラスコにそれを捨てる。これは、EMSを不活性化されます。
8. ワームから5 mL M9を追加する、ワームのペレットを形成するまで5〜7分のためにまたは1500 × gでワーム、遠心分離機を洗浄するためにチューブを25から30回転倒。上清を吸引除去し、1NのNaOHのビーカーに捨てる。
9. 洗浄工程を少なくとも3回繰り返します。
10. 最終洗浄後、M9の最小量（〜500μl）をでワームペレットを再サスペンドし、OP50細菌の芝生を含むNGMプレート上にそれらをピペット。この時点で、もはや化学のフード内で作業する必要はありません。
11. 数分間液体を乾燥させて、その後新鮮なシードのプレートにJ4幼虫を探して、健康を選択して転送する。あなたの機関の有害廃棄物のガイドラインにしたがって原版を破棄。
12. 突然変異ワームの自己受精させて。実体顕微鏡を使用して、関心の劣性突然変異体のF2世代の表現型をスクリーニングする。

パート6：ソラレン変異誘発

このセクションでは、長波長紫外線（UV）と一緒にTMPを使用して突然変異誘発のための手順を説明します。変異誘発のTMP / UV法は、広くゲノム³内に欠失変異を誘発するために使用されます。

1. 前の手順で説明した15 mlの遠心管に4-5、直径6cmペトリ皿からワームを収集する。
2. 10ミリリットルM9を追加し、20回反転ワームを洗い、5分間1500 × gで遠心する。上清を捨て、3回の合計のために洗浄を繰り返します。 TMPの30μg/ mlを含むM9の約10倍の体積の液体と再サスペンドワームを吸引除去する。 M9の2mlにTMPのピペットを20μl（3 mg / ml）を。 EMSと同様に、TMPは強力な発がん性物質であり、適切な安全対策を取って処理する必要があります。適切な眼が身に着けている紫外光の潜在的な危険を防止するために使用する必要があります。使い捨ては、適切なバイオハザードバッグに廃棄する必要があります。
3. 低速のロッカー（40 UPM）に室温で15分間、暗所でチューブをインキュベートします。すべてのワームのシンクを聞かせ、10分間垂直に覆われた管を設定します。
4. パスツールピペットでチューブの底からワームを削除し、シーディングされていないNGMプレートに移す。あなたの機関の有害化学物質のガイドラインに従って、上清を捨てる。
5. 過剰なTMPが板に吸収されるまでは暗いところでプレートを保管してください。
6. 紫外線強度計を用いて、プレート上の強度は500μW/ cm ^2と4であることを長波UV光源とそのようなプレート間の距離を設定します。アルミカバーと蓋を取り外し、50秒間長波長紫外線にTMP扱わワームを含むプレートをカバーし、公開します。
7. 室温で5時間、暗所でワームをカバーしておきます。
8. ピックと新鮮なシードのプレートに健康なJ4幼虫を移す。あなたの機関の有害化学物質のガイドラインに従って、原版を破棄。
9. 実体顕微鏡を使用して、関心の突然変異のためにF2世代の表現型をスクリーニングする。

パート7：代表的な結果

P.のいくつか変異誘発（どちらかEMSまたはTMP / UVによる）に起因するpacificus変異体の表現型は図1に示されています。それぞれの変異体は野生型の動物から容易に区別できる特徴的な表現型を持っています。ワームからその変異で処理した、親世代（P0）から30 J3/J4幼虫は、別々のプレートに配置し、F1世代な卵を、レイアウトを許された。健康なF1子孫を示したプレートから、1000 F1Sの合計は、個々のプレートに移し、F2子孫は、表現型をスクリーニングした。みすぼらしい^5,6、非協調⁶と変圧器⁷の表現型を有する動物が発見された。

図1。Pristionchus pacificus野生型および変異動物。 A.重量両性B.重量男性C. ほかの細胞系列変異体D. UNC変異体E. TRA変異体。残りのパネルで別の変異体と比較する野生型雌雄同体（左）とオス（右）の動物を示す上の2つのパネル。

Discussion

変異導入は、様々な実験モデル生物で遺伝学的研究に広く使用される技術です。変異導入実験はしばしば遺伝子²の機能を識別するために使用されます。ここで説明する変異誘発の手順は、P.のためだけでなく、使用することができます。 pacificusだけでなく、Cの虫や他の関連線虫の種。ここでは二つの方法、EMSおよびTMP / UV変異導入を説明します。

EMSは、ゲノム^3,8を通して点変異または小欠失を誘導する化学物質です。ソラレン変異誘発（TMP / UV）は、主に紫外光により誘導される可能性が破損のためにDNAの欠失変異を誘発する。削除の断片は長さ³の0.10〜15キロバイトの範囲にある。

我々は見つけることが比較的一般的な表現型をスクリーニング。 EMSを使って画面で、F2動物との各400プレートに、約1プレートはdpy、UNCまたはトラを持っていた。非対称分裂は、雄の表現型とXX核型^7を有するため、その異常な動き⁶とトラのためにその短いサイズ^7、UNCで認識することができます。 TMP / UV突然変異誘発はEMS ³に比べて変異体を生成する低周波数を持っていますが、それは大きな欠失を生成します。

線虫の場合は、後期第四段階の幼虫や若い成人は、彼らが生殖系列の核の最大数を持っているので、変異導入を行うことが最も効果的な発達段階です。したがって、多くの四段目の幼虫との同期親の人口で実験を開始すると便利です。同期の文化を作る簡単な方法は、卵の代わりに、成虫で新しい文化を作ることです。以下の世代では、ほとんどのワームは、同じ年齢ぐらいでしょう。劣性変異はホモ接合五約20パーセントを生産するF1個体の子孫を調べることによって検出することができます。

線虫の遺伝子スクリーニングのパワーは、さらに画面⁹のデザインを変更することによって悪用される可能性があります。雌雄同体のライフスタイルと急速な世代時間の組み合わせは、遺伝学研究のための理想的な線虫になります。