An Introduction to Worm Lab: von Kultivierung Worms zu Mutagenese

Summary

Das Screening nach Mutanten mit phänotypischen Defekte ist eine einfache Methode zur Identifizierung von Genen, die in einem bestimmten biologischen Prozess funktionieren. In diesem Artikel beschreiben wir, wie die Kultur frei lebenden Würmer (z. B.

Abstract

Dieses Protokoll beschreibt Verfahren, die Nematoden im Labor und wie man sie mutagenisieren mit zwei alternative Methoden zu halten: Ethylmethansulfonat (EMS) und 4, 5 ', 8-Trimethylpsoralen mit ultraviolettem Licht (TMP / UV) kombiniert. Nematoden sind leistungsfähige biologische Systeme für genetische Studien wegen ihrer einfachen Körperbau und der Paarung, das aus sich selbst befruchtende Zwitter und Männchen, die hunderte von Nachkommen pro Tier erzeugen kann zusammengesetzt ist. Nematoden sind in Agarplatten mit einem Rasen von Bakterien erhalten und kann leicht von einer Platte zur anderen mit einem Pick übertragen werden. EMS ist ein Alkylierungsmittel häufig verwendet, um Punktmutationen und kleine Deletionen induzieren, während TMP / UV hauptsächlich induziert Löschungen. Je nach Art der Nematoden eingesetzt werden Konzentrationen von EMS und TMP müssen optimiert werden. Zur Isolierung rezessive Mutationen des Nematoden Pristionchus pacificus wurden die Tiere der F2-Generation visuell auf Phänotypen gescreent. Zur Veranschaulichung dieser Methoden, mutagenisierten wir Würmer und suchte Unkoordinierte (UNC), Dumpy (dpy) und Trafo (Tra) Mutanten.

Protocol

Teil 1: Vorbereiten Nematoden Nährmedien (NGM) Petrischalen

Experimentelle Nematoden wie C. elegans und P. pacificus sind in der Regel im Labor auf 6 cm Petrischalen mit Nematode Growth Medium (NGM) ¹ kultiviert. Würmer sind bei 20 ° C gehalten, können aber bei unterschiedlichen Temperaturen (zwischen 4 ° C - 25 ° C) bebrütet werden, abhängig von der Nematoden und experimentelles Design. Zur Vorbereitung Platten mit NGM haben Standard sterile Techniken verwendet werden, um Pilz-und Bakterienbefall zu verhindern. Es folgt das Protokoll zur NGM Platten vorbereiten:

1. Wiegen Sie 15 g Agar, 2,4 g NaCl, 2 g Trypton, und 2,72 g KH ₂ PO ₄ in 2 L-Erlenmeyerkolben, machen Volumen bis zu 1 L mit Wasser, Autoklaven und lassen Sie es bis 60 ° C abkühlen in ein Wasserbad.
2. Fügen Sie 0,8 ml je 1 M CaCl _2, Cholesterin (5 mg / ml in Ethanol) und 1 M MgSO _4. Um zu verhindern, Pilz-und Bakterienbefall, 1 ml Streptomycin (100 mg / ml) und 1 ml Nystatin (10 mg / ml) kann auf jeden Liter zugesetzt werden.
3. Mit einem Unispense Maschine und Pflege sterilen Bedingungen, gießen Sie die Medien in die gewünschte Platten. Die Platten sollten auf ca. 2 / 3 ^rd gefüllt sein. Ein Standard-Durchmesser von 60 mm Platte benötigt etwa 10 ml des Mediums. Bewegen Sie sich nicht die Platten, bis der Agar vollständig gelified ist, andernfalls wird es eine unebene Oberfläche von Agar werden, was es schwierig macht Würmer auf dem Stereomikroskop konzentrieren.
4. Einmal getrocknet, können die Platten sofort ausgesät werden oder bei 4 ° C gelagert, bis Impfen mit Bakterien.

Teil 2: Vorbereiten OP50 Bakterien und Aussaat NGM Petrischalen

P. pacificus wird im Labor durch die Fütterung auf der E.coli-Stamm OP50 kultiviert. OP50 verfügt über eine begrenzte Wachstum auf NGM-Platten, wodurch eine dünne Rasen, der die Visualisierung der Würmer ¹ erleichtert. Um zu wachsen eine Kultur des OP50 verwenden LB-Brühe:

1. Add 5 g bactotryptone, 2,5 g Hefeextrakt und 2,5 g NaCl in einem 500 ml Schraubverschluss Flasche, dass das Volumen auf 500 ml mit destilliertem Wasser und Autoklaven.
2. Inoculate die Brühe mit einer einzigen Kolonie von OP50 von der Kultur Platte unter sterilen Bedingungen und ließ es über Nacht wachsen bei 37 ° C.
3. LB-OP50 ist bereit, verwendet werden können und bei 4 ° C für mehrere Monate gelagert werden, wenn die Sterilität eingehalten wird. Wenn Platten ausgesät werden müssen, eine kleine Menge der Brühe in eine kleine sterile Becher und dies wird dazu beitragen, eine Verunreinigung der Stammkultur.
4. Um Samen Platten, verzichten 100-120 ul des OP50 auf das 60 mm Durchmesser NGM Petrischale und wirbeln um sie zu verbreiten.
5. Inkubieren diese ausgesät Platten über Nacht bei Raumtemperatur für den Rasen zu wachsen. Diese ausgesät Platten können nun bei 4 ° C gelagert werden für bis zu 3 Wochen. Wenn Sie sie in umgekehrter Stellung verhindert eine schnelle Trocknung.

Teil 3: Making a holen

In diesem Abschnitt werden wir beschreiben, wie ein Pick für Würmer machen. Die Abholung wird verwendet, um Würmer von einem Ort zum anderen zu übertragen. Die Abholung ist von 30 Gauge 90% Platin 10% Iridium-Draht gemacht, obwohl einige Forscher etwas andere Metal-Kompositionen bevorzugen:

1. Cut ca. 3-4 cm aus Draht, Ort, 0,5 cm davon in der Spitze einer Pasteurpipette (dessen Spitze war es, eine geringere Länge gebrochen), und dann verschließen Sie diese in das Glas über einem Bunsenbrenner. Die Länge des Drahtes ragt aus dem Glas ist ca. 3-3,5 cm, kann aber je nach individuellen Vorlieben variieren.
2. Glätten Sie das Ende des Drahtes, die vorstehende mit einem Hammer oder Zange. Dann biegen Sie die Abflachung nach oben, um eine Kugel zu bilden.
3. Glätten der scharfen Kanten der Pick mit einem Schleifpapier um eine Beschädigung des Wurms oder Agar.

Teil 4: Picking Würmer

1. Um Würmer holen, sterilisieren Platindraht auf einer Flamme und ziehen Sie die abgeflachte Spitze des Pick entlang der Bakterienrasen zur Beschichtung der Spitze mit dicken klebrigen Bakterien, dabei nicht zu durchstechen oder Beschädigung der Agar-Oberfläche.
2. Mit dem Stereomikroskop, sehr leicht Pinsel der klebrigen Spitze gegen den Wurm / Würmer abgeholt, bis der Wurm-Sticks an die Bakterien auf der Pick werden.
3. Sobald der Wurm an der Spitze des Pick, übertragen sie sofort auf die neue Platte durch Berühren oder Gleiten der Spitze des Pick gegen den Bakterienrasen der neuen Platte, und der Wurm sollte kriechen. Es ist darauf zu achten, dass die Oberfläche des Agar auf der Platte beschädigt werden, da sonst die Würmer in die Löcher so dass es schwierig ist, sie abzurufen, zu kriechen. Wenn der Wurm bleibt auf dem Pick zu lange, kann es austrocknen.

Teil 5: EMS Mutagenese

Ethylmethansulfonat (EMS) induziert ein breites Spektrum von Mutationen in dem in das Genom 2. Mutanten können durch Defekte wie Eiablage, Muskel-Defekt identifiziert werdens, Geschlechtsbestimmung, dauer Bildung, Verhalten und Gonade Bildung. Das Protokoll für EMS-Mutagenese ist ähnlich wie bei C beschrieben elegans ^1.

1. Bereiten Sie 500 ml (oder mehr) 1 N NaOH.
2. Nehmen Sie 4-5, 6 cm Durchmesser Petrischalen voller Würmer, mit ein paar hundert Würmer auf dem dritten Larvenstadium juvenile (J3) Bühne und waschen Sie die Würmer weg mit 2-3 ml sterilem M9 pro Platte.
3. Sammeln Sie alle Würmer in einer sterilen Einweg-15 ml-Zentrifugenröhrchen. Zentrifuge bei 1500 xg für 5-7 Minuten oder bis die Würmer ein Pellet bilden.
4. Saugen Sie die Flüssigkeit und die Verwendung von 2 ml M9 zu resuspendieren die Würmer. Fügen Sie 20 ul EMS in ein Röhrchen mit 2 ml M9 und schütteln, um es aufzulösen. Dann stell 'das EMS-Lösung, die 2 ml-Wurm Federung und vorsichtig schwenken. Die Endkonzentration der EMS wird 47 mm sein. Achtung: EMS ist ein sehr starkes Mutagen und sollte in einem Abzug gehandhabt werden. Alle Materialien (Handschuhe, Pipetten, Spitzen), die in Kontakt mit diesem mutagen zu kommen, sollte mit 1N NaOH zur Inaktivierung des EMS behandelt werden. Tragen Sie doppelte Handschuhe während des gesamten EMS-Mutagenese Prozedur. Entsorgen Sie den gefährlichen Abfällen gemäß Ihrer Institution Richtlinien.
5. Legen Sie die Zentrifugenröhrchen und decken Sie die Kappe mit Parafilm, legen Sie es waagerecht in den Dunstabzug und lassen die Würmer für 3,5 Stunden inkubiert. Der Schlauch kann auch bei niedriger Geschwindigkeit Wippe platziert werden.
6. Drehen Sie den Schlauch und Mantel der Kappe mit Parafilm, in vertikaler Position und inkubieren, bis die Würmer zu versenken.
7. Den Überstand aspirieren und verwerfen sie in ein Becherglas / Kolben mit 1N NaOH. Dies wird Inaktivierung der EMS.
8. 5 ml M9, die Würmer, das Röhrchen 25-30 mal die Würmer, Zentrifuge bei 1500 xg waschen für 5-7 Minuten oder bis die Würmer ein Pellet bilden. Den Überstand aspirieren und verwerfen in die 1N NaOH Becher.
9. Wiederholen Sie den Waschvorgang mindestens 3-mal.
10. Nach dem letzten Waschen, resuspendieren der Wurm Pellet in minimaler Menge (~ 500 ul) M9 und Pipette sie hinaus auf NGM-Platten mit einem Rasen von OP50 Bakterien. An dieser Stelle müssen Sie nicht mehr in der chemischen Haube arbeiten.
11. Lassen Sie die Flüssigkeit trocknen für ein paar Minuten und dann abholen und Transfer gesund aussehende J4 Larven an die frische ausgesät Platten. Entsorgen Sie die Original-Platte nach Ihrer Institution gefährlicher Abfall-Richtlinien.
12. Lassen Sie die mutagenisierten Würmer selbst zu befruchten. Mit einem Stereomikroskop, Bildschirm der F2-Generation Phänotypen für rezessive Mutanten von Interesse.

Teil 6: Psoralen Mutagenese

In diesem Abschnitt beschreiben wir das Verfahren für die Mutagenese mit TMP in Verbindung mit langwelligem ultravioletten (UV). TMP / UV-Methode der Mutagenese wird häufig verwendet, um Deletionsmutationen innerhalb eines Genoms ³ induzieren.

1. Sammeln von Würmern 4-5, 6 cm Durchmesser Petrischalen in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen, wie im vorherigen Verfahren beschrieben.
2. 10 ml M9, 20 Mal kippen, um die Würmer und Zentrifuge bei 1500 xg waschen für 5 Minuten. Überstand verwerfen und wiederholen Sie die Wäsche für insgesamt 3-mal. Absaugen der Flüssigkeit und resuspendieren die Würmer in ca. 10-fache ihres Volumens der M9 mit 30 ug / ml TMP. Je 20 ul von TMP (3 mg / ml) in 2 ml M9. Wie EMS, ist TMP ein starkes Karzinogen und muss behandelt unter richtigen Sicherheitsmaßnahmen werden. Um zu verhindern, vor möglichen Risiken des UV-Lichts richtige Auge trägt verwendet werden sollte. Das Verbrauchsmaterial muss in der richtigen biohazard Säcke entsorgt werden.
3. Inkubieren Sie die Röhrchen im Dunkeln für 15 Minuten bei Raumtemperatur auf einem niedrigen Drehzahlen Wippe (40 UPM). Setzen Sie den überdachten vertikal für 10 Minuten bis alle Würmer sinken lassen.
4. Entfernen Sie die Würmer aus dem Boden des Röhrchens mit einer Pasteurpipette und übertragen Sie sie auf eine ungesetzte NGM Platte. Verwerfen Sie den Überstand nach Ihrer Institution gefährlichen chemischen Richtlinien.
5. Halten Sie die Platte in dunklen, bis das überschüssige TMP in die Platte absorbiert wird.
6. Mit Hilfe eines UV-Intensität Meter, stellen Sie den Abstand zwischen den langwelligen UV-Quelle und die Platte so, dass die Intensität auf der Platte 500 mW / cm ^{2 4} ist. Entfernen Sie die Aluminium-Deckel und Deckel und Abdeckung und setzen die Platte mit den TMP behandelt Würmer, die langwellige UV-Strahlung für 50 Sekunden.
7. Zugedeckt die Würmer in der Dunkelheit für 5 Stunden bei Raumtemperatur.
8. Pick and Transfer gesund aussehende J4 Larven an die frische ausgesät Platten. Entsorgen Sie die Original-Platte nach Ihrer Institution gefährlichen chemischen Richtlinien.
9. Mit einem Stereomikroskop, Bildschirm der F2-Generation Phänotypen für die Mutation von Interesse.

Teil 7: Repräsentative Ergebnisse

Einige der P. pacificus mutanten Phänotypen, die aus der Mutagenese (entweder durch EMS oder TMP / UV) sind in Abbildung 1 dargestellt. Jede Mutante besitzt einen charakteristischen Phänotyp, die leicht zu unterscheiden von der Wildtyp-Tier ist. Von den Würmerndass waren mit dem Mutagen, 30 J3/J4 Larven aus der elterlichen Generation (P0) wurden in getrennten Platten gelegt und dürfen Eier, die der F1-Generation sind Laien behandelt. Von den Platten, die gesunde F1-Nachkommen zeigten, wurden insgesamt 1000 F1 auf die einzelnen Platten übertragen und die F2-Nachkommen wurde Phänotypen gescreent. Tiere mit Dumpy ^5,6, unkoordinierte ⁶ und Transformator ⁷ Phänotypen gefunden.

Abbildung 1. Pristionchus pacificus Wildtyp und Mutante Tiere. A. wt Hermaphrodit B. wt männlichen C dpy mutierten D. unc mutierten E. tra-Mutante. Top zwei Tafeln zeigen Wildtyp Hermaphrodit (links) und Männchen (rechts) Tiere mit den verschiedenen Mutanten in den restlichen Platten zu vergleichen.

Discussion

Mutagenese ist eine weithin angewandte Technik für genetische Studien in verschiedenen experimentellen Modell-Organismen. Mutagenese-Experimente werden häufig verwendet, um die Funktion eines Gens ^{2 zu} identifizieren. Die Mutagenese hier beschriebenen Verfahren können nicht nur für P. verwendet werden pacificus, sondern auch für C. elegans und anderen verwandten Nematoden. Hier beschreiben wir zwei Methoden, EMS und TMP / UV-Mutagenese.

EMS ist eine Chemikalie, Punktmutationen oder kleine Deletionen im gesamten Genom ^3,8 induziert. Psoralen Mutagenese (TMP / UV) meist induziert Löschung Mutationen in der DNA durch möglichen Bruch durch das UV-Licht induziert. Die Löschung Fragmente sind in der Regel im Bereich von 0,10 bis 15 kb in Länge ^3.

Wir für Phänotypen, die relativ häufig zu finden sind geschirmt. In einem Bildschirm mit EMS, für je 400 Platten mit F2 Tiere, etwa eine Platte hatte eine dpy, UNC oder Tra. Dpy kann durch seine kürzere Größe ^7, Unc für seine anormale Bewegung ⁶ und Tra werden für einen männlichen Phänotyp und eine XX Karyotyp ⁷ erkannt. TMP / UV-Mutagenese wurde eine geringere Häufigkeit von Erzeugung von Mutanten im Vergleich zum EMS ^3, aber es erzeugt größere Deletionen.

Für Nematoden, ist am Ende des vierten Larve oder jungen Erwachsenen die effektivste Entwicklungsstadium durchzuführen Mutagenese, weil sie die maximale Anzahl von Keimbahn Kerne haben. Es ist daher sinnvoll, den Versuch mit einem synchronisierten elterlichen Bevölkerung mit vielen vierte Stufe Larven beginnen. Ein einfacher Weg, um synchronisierte Kulturen, indem sie neue Kulturen mit Eiern statt erwachsenen Würmer. In der folgenden Generation, die meisten Würmer etwa im gleichen Alter sein. Rezessive Mutationen können durch Einsicht in den Nachkommen der F1 Individuen, die etwa 25 Prozent der homozygoten produzieren erkannt werden.

Die Macht der genetischen Screens in Nematoden kann durch Änderung der Gestaltung der Bildschirm ⁹ genutzt werden. Die Kombination von hermaphroditischen Lifestyle und schnelle Generierung Zeit macht Nematoden ideal für genetische Studien.