Introducción al Laboratorio de Worm: El cultivo de gusanos de Mutagénesis

Summary

La detección de mutantes con defectos fenotípicos es un método sencillo para identificar los genes que funcionan en un determinado proceso biológico. En este artículo se describe cómo los gusanos que viven la cultura libre (por ejemplo,

Abstract

Este protocolo describe los procedimientos para mantener los nematodos en el laboratorio y la forma de mutagenizar utilizando dos métodos alternativos: etil metano sulfonato (EMS) y 4 ", 5, 8 trimetilpsoraleno-combinada con la luz ultravioleta (TMP / UV). Los nematodos son potentes sistemas biológicos para estudios de genética, debido a su plan de cuerpo simple y el sistema de apareamiento, que se compone de auto-fertilización de los hermafroditas y los hombres que pueden generar cientos de progenie por animal. Los nematodos son mantenidos en placas de agar que contiene un césped de bacterias y se pueden transferir fácilmente a partir de un plato a otro con un pico. EMS es un agente alquilante comúnmente utilizadas para inducir mutaciones puntuales y deleciones pequeñas, mientras que TMP / UV induce principalmente supresiones. Dependiendo de las especies de nematodos que se utiliza, las concentraciones de EMS y TMP tendrá que ser optimizada. Para aislar las mutaciones recesivas del nematodo Pristionchus pacificus, los animales de la generación F2 fueron examinados visualmente para fenotipos. Para ilustrar estos métodos, mutagénesis gusanos y buscó falta de coordinación (UNC), Cochambrosa (dpy) y transformador (TRA) mutantes.

Protocol

Parte 1: Preparación de medios de cultivo de nematodos (NGM) placas de Petri

Nematodos experimentales, como C. elegans y P. pacificus se suelen cultivar en el laboratorio de 6 cm placas de Petri que contenían medio de nematodos Crecimiento (NGM) ^1. Los gusanos se mantienen a 20 ° C, pero se pueden incubar en un rango de temperaturas (entre 4 ° C - 25 ° C), dependiendo de las especies de nematodos y el diseño experimental. Para preparar platos con NGM, las técnicas estériles tienen que ser utilizados para prevenir la contaminación por hongos y bacterias. A continuación se presenta el protocolo para preparar platos NGM:

1. Pesar 15 g de agar, 2,4 g de NaCl, 2 g de triptona, y 2,72 g KH ₂ PO ₄ en un matraz de 2 L cónica, que el volumen hasta 1 litro con agua, autoclave y deje que se enfríe a 60 ° C en un baño de agua.
2. Añadir 0,8 ml cada una de 1 M de CaCl _2, el colesterol (5 mg / ml en etanol), y 1 M MgSO _4. Para prevenir la contaminación por hongos y bacterias, un ml de estreptomicina (100 mg / ml) y 1 ml de nistatina (10 mg / ml) se pueden agregar a cada litro de medio.
3. Usando una máquina Unispense y mantener condiciones estériles, vierta los medios de comunicación en los platos que desee. Las placas deben ser llenados con cerca de 2 / ³ de lleno. Una placa estándar de 60 mm de diámetro requiere alrededor de 10 ml de los medios de comunicación. No se mueven las placas hasta que el agar esté completamente gelificada, de lo contrario habrá una superficie irregular de agar, por lo que es difícil de enfocar los gusanos en el microscopio estereoscópico.
4. Una vez seco, las placas pueden ser sembradas inmediatamente o almacenarse a 4 ° C hasta la siembra de bacterias.

Parte 2: Preparación de las bacterias y OP50 siembra NGM placas de Petri

P. pacificus se cultiva en el laboratorio por la alimentación de la cepa de E. coli OP50. OP50 tiene un crecimiento limitado en las placas de NGM, formando un césped fino que facilita la visualización de los gusanos ^1. Para cultivar una cultura de la OP50, use LB caldo:

1. Añadir 5 g bactotryptone, 2,5 g de extracto de levadura y 2,5 g de NaCl a una botella de 500 ml con tapón de rosca, completar el volumen a 500 ml con agua destilada y autoclave.
2. Inocular el caldo con una sola colonia de OP50 de la placa de cultivo en condiciones estériles y se deja crecer la noche a 37 ° C.
3. LB-OP50 está listo para ser utilizado y se puede almacenar a 4 ° C durante varios meses si se mantiene la esterilidad. Cada vez que las placas deben ser cabeza de serie, vierta una pequeña cantidad del caldo en un vaso estéril pequeño y esto ayudará a evitar la contaminación de la cultura de valores.
4. A las placas de la semilla, prescindir de 100 a 120 l de la OP50 a los 60 mm de diámetro placa Petri NGM y agitar para que se extendiera.
5. Incubar las placas sembradas durante la noche a temperatura ambiente para el césped a crecer. Estas placas sembradas se pueden almacenar a 4 ° C durante un máximo de 3 semanas. El almacenamiento en una posición invertida ayuda a prevenir el secado rápido.

Parte 3: Hacer una selección de

En esta sección se describe cómo hacer una selección para los gusanos. La recogida se utiliza para transferir los gusanos de un lugar a otro. La selección se hace de calibre 30, un 90% de alambre de platino iridio 10%, aunque algunos investigadores prefieren composiciones de metal un poco diferente:

1. Cortar unos 3-4 cm de alambre, el lugar de 0,5 cm de la misma dentro de la punta de una pipeta Pasteur (cuya punta estaba rota a una menor longitud), y luego se junta en el vaso con un mechero Bunsen. La longitud de los cables que sobresalen de la copa es de unos 3-3,5 cm, pero puede variar de acuerdo a las preferencias individuales.
2. Aplanar el extremo del alambre que sobresale con un martillo o unos alicates. Luego, doblar hacia arriba la parte aplanada para formar una bola.
3. Suavizar los bordes afilados de la selección con un papel de lija para evitar que se dañe el gusano o el agar.

Parte 4: gusanos Picking

1. Para recoger los gusanos, esterilizar el alambre de platino en una llama y arrastre la punta plana de la selección a lo largo del césped bacteriano para cubrir la punta con un grueso bacteria pegajosa, teniendo cuidado de no perforar o dañar la superficie del agar.
2. Usando el microscopio estereoscópico, muy ligeramente el pincel punta pegajosa contra el gusano gusanos / para ser recogidos hasta el gusano se pega a las bacterias en la selección.
3. Una vez que el gusano está en la punta del pico, se transferirá inmediatamente a la nueva placa de toque o deslizando la punta de la selección contra el césped de bacterias de la placa nueva, y el gusano que se arrastran fuera. Se debe tener cuidado de no dañar la superficie del agar en la placa más que los gusanos se arrastran en los agujeros por lo que es difícil de recuperar. Si el gusano se queda en la selección por mucho tiempo, podría secarse.

Parte 5: Sistemas de gestión de mutagénesis

Sulfonato de metano etílico (EMS) induce un amplio espectro de mutaciones en el genoma en el 2. Mutantes pueden ser identificados por los defectos, como la puesta de huevos, defecto del músculos, la determinación del sexo, la formación de Dauer, el comportamiento y la formación de las gónadas. El protocolo de mutagénesis EMS es similar a la descrita para el C. elegans ^1.

1. Preparar 500 ml (o más) de NaOH 1N.
2. Tome 4-5, 6 cm de diámetro, las placas de Petri llenas de gusanos, que contiene unos pocos cientos de gusanos en la tercera larva juvenil (J3) y ​​la etapa de lavado de los gusanos con 2-3 ml de agua estéril M9 por placa.
3. Recoge todos los gusanos en un recipiente estéril, desechable 15 ml tubo de centrífuga. Centrifugar a 1500 xg durante 5-7 minutos o hasta que los gusanos forma una bolita.
4. Aspirar el líquido y el uso de 2 ml de M9 para volver a suspender los gusanos. Añadir 20 l EMS a un tubo que contiene 2 ml de M9 y agitar para que se disuelva. Después agregar esta solución a la EMS 2 ml de la suspensión de gusano y agitar suavemente. La concentración final de EMS será de 47 mm. Atención: EMS es un mutágeno muy fuerte y debe ser manejado en una campana extractora. Todos los materiales (guantes, pipetas, puntas) que entran en contacto con este mutágeno debe ser tratado con NaOH 1N para inactivar la EMS. Use guantes durante el procedimiento de mutagénesis toda la EMS. Disponer los residuos peligrosos de acuerdo a las directrices de su institución.
5. Coloque el tubo de centrífuga y cubierta de la tapa con parafilm y colóquelo horizontalmente en la campana extractora de humos y dejar que los gusanos se incuban durante 3,5 horas. El tubo también puede ser colocado en un agitador de baja velocidad.
6. A su vez el tubo y la cubierta de la tapa con parafilm, coloque en posición vertical y se incuban hasta que el disipador gusanos.
7. Aspirar el sobrenadante y desecharlo en un vaso / frasco que contiene NaOH 1N. Esto inactivar el SME.
8. Añadir 5 ml M9 a los gusanos, invertir el tubo 25-30 veces para lavar los gusanos, se centrifuga a 1.500 g durante 5-7 minutos o hasta que los gusanos forma una bolita. Aspirar el sobrenadante y desecharlo en el vaso de NaOH 1N.
9. Repita el paso de lavado por lo menos 3 veces.
10. Después del último lavado, vuelva a suspender el gusano de pellets en cantidad mínima (~ 500 l) de la M9 y una pipeta a cabo en placas de NGM contiene un césped de bacterias OP50. En este punto ya no es necesario trabajar en la campana química.
11. Deje el líquido en seco durante unos minutos y luego recoger y transferencia de aspecto saludable J4 larvas frescas placas sembradas. Deseche la placa original de acuerdo con las directrices de su institución de residuos peligrosos.
12. Deje que el auto gusanos mutagenizadas fertilizar. El uso de un microscopio estereoscópico, la pantalla de los fenotipos de la generación F2 de mutantes recesivos de interés.

Parte 6: Psoralen mutagénesis

En esta sección se describe el procedimiento para la mutagénesis con TMP en conjunto con luz ultravioleta de onda larga (UV). TMP / UV método de mutagénesis es ampliamente utilizado para inducir mutaciones de deleción en el genoma ^3.

1. Recoger los gusanos de 4-5, 6 cm de diámetro, las placas de Petri en un tubo de centrífuga de 15 ml, tal como se describe en el procedimiento anterior.
2. Agregar 10 ml de M9, invertir 20 veces para lavar los gusanos, y se centrifuga a 1500 xg durante 5 minutos. Eliminar el sobrenadante y repetir el lavado con un total de 3 veces. Aspirar el líquido y vuelva a suspender los gusanos en alrededor de 10 veces su volumen de M9 que contiene 30 mg / ml de TMP. Pipeta de 20 l de TMP (3 mg / ml) en 2 ml de M9. Como EMS, TMP es un potente cancerígeno y se debe manejar la adopción de medidas de seguridad adecuadas. Para evitar el riesgo potencial de la UV ojos la luz adecuada usa debe ser utilizado. Los materiales desechables se deben desechar en bolsas de bioseguridad adecuadas.
3. Incubar el tubo en la oscuridad durante 15 minutos a temperatura ambiente en un agitador de baja velocidad (40 UPM). Ajuste el tubo cubierto verticalmente durante 10 minutos para permitir que todos los gusanos del fregadero.
4. Eliminar los gusanos de la parte inferior del tubo con una pipeta Pasteur y transferirlos a una placa de NGM cabeza de serie. Descartar el sobrenadante siguiendo las directrices de su institución químicos peligrosos.
5. Mantener la placa en la oscuridad hasta que el exceso de TMP se absorbe en el plato.
6. El uso de un medidor de intensidad de los rayos UV, establecer la distancia entre la fuente de luz UV de onda larga y la placa de tal manera que la intensidad de la placa es de 500 mW / cm ^{2 4.} Quite la cubierta de aluminio y la tapa y la tapa y exponer la placa que contiene los gusanos TMP tratados con la radiación UV de onda larga de 50 segundos.
7. Tapar y dejar a los gusanos en la oscuridad durante 5 horas a temperatura ambiente.
8. Recogida y traslado de aspecto saludable J4 larvas frescas placas sembradas. Deseche la placa original siguiendo las directrices de su institución químicos peligrosos.
9. El uso de un microscopio estereoscópico, la pantalla de los fenotipos de la generación F2 de la mutación de interés.

Parte 7: Resultados de Representante

Algunos de los P. fenotipos mutantes pacificus resultantes de la mutagénesis (ya sea por EMS o TMP / UV) se muestran en la Figura 1. Cada mutante tiene un fenotipo característico que se distingue fácilmente de los animales de tipo salvaje. De los gusanosque fueron tratados con el mutágeno, 30 J3/J4 larvas de la generación parental (P0) se colocaron en platos separados y se les permite poner sus huevos, que son la generación F1. De las placas que mostraban plantas de la F1 saludable, un total de 1000 F1 fueron transferidos a platos individuales y la progenie F2 fue proyectado por los fenotipos. Los animales con Cochambrosa ^5,6, falta de coordinación ⁶ y ⁷ fenotipos transformador se encontraron.

Figura 1. Pristionchus pacificus tipo salvaje y los animales mutantes. A. B. hermafrodita peso en peso masculino C. dpy mutante D. unc mutante E. tra mutante. Los dos primeros paneles que muestran de tipo salvaje hermafroditas (izquierda) y machos (derecha) para comparar con los diferentes mutantes en los paneles restantes.

Discussion

Mutagénesis es una técnica ampliamente utilizada para los estudios genéticos en varios organismos modelo experimental. Experimentos de mutagénesis se utilizan a menudo para identificar la función de un gen ^2. Los procedimientos de mutagénesis descritos aquí pueden ser utilizados no sólo para P. pacificus, sino también para C. elegans y otras especies de nematodos relacionados. Aquí se describen dos métodos, EMS y mutagénesis TMP / UV.

EMS es una sustancia química que induce mutaciones puntuales o pequeñas deleciones en el genoma ^3,8. Psoraleno mutagénesis (TMP / UV), sobre todo induce mutaciones de deleción en el ADN debido a la posible rotura inducida por la luz UV. Los fragmentos de la eliminación son típicamente en el rango de 0,10 a 15 kb de longitud ^3.

Se seleccionaron para los fenotipos que son relativamente comunes de encontrar. En una pantalla mediante EMS, por cada 400 placas con los animales F2, sobre una placa tenía una dpy, tío o Tra. Dpy se puede reconocer por su tamaño más corto ^7, tío de su movimiento anormal ⁶ y Tra por tener un fenotipo masculino y un cariotipo XX ^7. TMP / UV mutagénesis tiene una menor frecuencia de la generación de mutantes en comparación con el EMS ^3, pero que genera grandes supresiones.

Para los nematodos, la larva tarde la cuarta etapa o un adulto joven es la etapa de desarrollo más eficaz para llevar a cabo la mutagénesis, porque tienen el mayor número de núcleos de la línea germinal. Por tanto, es útil comenzar el experimento con una población sincronizada de los padres con muchas larvas cuarta etapa. Una forma sencilla de sincronizar las culturas es haciendo nuevas culturas con los huevos en vez de los gusanos adultos. En la siguiente generación, la mayoría de los gusanos serán de la misma edad. Las mutaciones recesivas pueden ser detectados por la inspección de la progenie de los individuos de F1, que se producen alrededor de un veinticinco por ciento de los homocigotos.

El poder de la genética en las pantallas de los nematodos puede ser explotado por la modificación del diseño de la pantalla ^9. La combinación de estilo de vida hermafroditas y tiempo de generación rápida hace que los nematodos ideal para estudios de genética.