Introduzione al Laboratorio Worm: da Worms coltura a mutagenesi

Summary

Screening per mutanti con difetti fenotipici è un metodo semplice per identificare i geni che funzionano in un dato processo biologico. In questo articolo descrivono come i vermi che vivono la cultura libera (ad esempio,

Abstract

Questo protocollo descrive le procedure per mantenere nematodi in laboratorio e come mutagenize utilizzando due metodi alternativi: metano solfonato etilico (EMS) e 4, 5 ', 8-trimethylpsoralen combinata con la luce ultravioletta (TMP / UV). I nematodi sono potenti sistemi biologici per gli studi di genetica a causa del loro piano di corpo semplice e il sistema di accoppiamento, che è composto di auto-fertilizzazione ermafroditi e maschi in grado di generare centinaia di progenie per animale. I nematodi sono mantenuti in piastre di agar contenente un prato di batteri e può essere facilmente trasferito da un piatto all'altro con un plettro. EMS è un agente alchilante comunemente usato per indurre mutazioni puntiformi e piccole delezioni, mentre TMP / UV induce soprattutto le eliminazioni. A seconda della specie di nematode usato, le concentrazioni di EMS e TMP dovrà essere ottimizzato. Per isolare mutazioni recessive del pacificus nematode Pristionchus, gli animali della generazione F2 erano visivamente sottoposti a screening per fenotipi. Per illustrare questi metodi, abbiamo mutagenizzate worm e cercato non coordinate (Unc), Dumpy (DPY) e trasformatore (Tra) mutanti.

Protocol

Parte 1: Preparazione di terreni di crescita nematode (NGM) piastre Petri

Nematodi sperimentali come C. elegans e P. pacificus sono tipicamente coltivate in laboratorio su 6 centimetri piastre Petri contenenti crescita media dei nematodi (NGM) ^1. I worm sono mantenuti a 20 ° C, ma può essere incubate a una gamma di temperature (tra i 4 ° C - 25 ° C), a seconda della specie di nematodi e il disegno sperimentale. Per preparare piatti con NGM, tecniche standard di sterili devono essere utilizzati per prevenire la contaminazione da funghi e batteri. In seguito è il protocollo di preparare piatti NGM:

1. Pesare 15 g di agar, 2,4 g NaCl, 2 g Triptone, e 2,72 g di KH ₂ PO ₄ in 2 beuta conica L, rendono il volume fino a 1 L con acqua, autoclave e lasciarlo raffreddare a 60 ° C a bagnomaria.
2. Aggiungere 0,8 ml ciascuna di 1 M CaCl _2, colesterolo (5 mg / ml in etanolo), e 1 M MgSO _4. Per prevenire la contaminazione da funghi e batteri, 1 ml di streptomicina (100 mg / ml) e nistatina 1 ml (10 mg / ml) può essere aggiunto ad ogni litro di terreno.
3. Utilizzando una macchina Unispense e il mantenimento di condizioni sterili, versare i media nei piatti desiderato. Le piastre devono essere riempite di circa 2 / 3 ^° pieno. Un piatto standard 60 mm di diametro sono necessari circa 10 ml di media. Non spostare le piastre fino a quando l'agar è completamente gelified, altrimenti ci sarà una superficie irregolare di agar, il che rende difficile mettere a fuoco i vermi sul stereomicroscopio.
4. Una volta essiccate, le piastre possono essere seminati immediatamente o conservato a 4 ° C fino alla semina con i batteri.

Parte 2: Preparazione OP50 batteri e semina NGM piastre Petri

P. Pacifico è coltivate in laboratorio per l'alimentazione del ceppo E.coli OP50. OP50 ha una crescita limitata su piastre NGM, formando così un prato sottile che facilita la visualizzazione dei worm ^1. Per crescere una cultura di OP50, utilizzare LB-brodo:

1. Aggiungere 5 g bactotryptone, 2,5 g di estratto di lievito e 2,5 g di NaCl ad una bottiglia da 500 ml con tappo a vite, portare al volume di 500 ml con acqua distillata e autoclave.
2. Inoculare il brodo con una singola colonia di OP50 dalla piastra di coltura in condizioni di sterilità e lasciarlo crescere overnight a 37 ° C.
3. LB-OP50 è pronto per essere utilizzato e può essere conservato a 4 ° C per diversi mesi se la sterilità è mantenuta. Ogni volta che le piastre devono essere testa di serie, versare una piccola quantità di brodo in un bicchiere piccolo sterile e questo aiuterà a prevenire la contaminazione della coltura madre.
4. A piastre semi, dispensare 100-120 microlitri della OP50 sul diametro 60 mm NGM Petri e scuotere per diffonderla.
5. Incubare le piastre seminate durante la notte a temperatura ambiente per il prato a crescere. Queste piastre seminate ora può essere conservato a 4 ° C per un massimo di 3 settimane. Memorizzandoli in una posizione invertita aiuta a prevenire la rapida essiccazione.

Parte 3: Esecuzione di un pick

In questa sezione viene descritto come fare un pick per i vermi. Il prelievo è utilizzato per trasferire i vermi da una posizione all'altra. Il prelievo è composto da 30 calibro 90% filo di platino iridio 10%, anche se alcuni ricercatori potrebbero preferire composizioni di metallo leggermente diversa:

1. Tagliare circa 3-4 cm di filo, posto 0,5 cm dentro la punta di una pipetta Pasteur (la cui punta era rotto a una lunghezza più piccola), e poi sigillare nel bicchiere sopra un becco Bunsen. La lunghezza del filo che sporge dal vetro è di circa 3-3,5 cm, ma può variare a seconda delle preferenze individuali.
2. Appiattire la fine del filo che è sporgente con un martello o una pinza. Poi piegare verso l'alto parte appiattito a formare uno scoop.
3. Levigare gli spigoli del pick con una carta vetrata per evitare di danneggiare il verme o l'agar.

Parte 4: vermi Picking

1. Per scegliere i vermi, sterilizzare il filo di platino a fuoco e trascinare la punta appiattita del pick lungo il prato batterica a cappotto con la punta spessa batteri appiccicoso, facendo attenzione a non forare o danneggiare la superficie agar.
2. Utilizzando lo stereomicroscopio, molto leggermente pennello la punta appiccicosa contro i vermi verme / essere ritirati fino al worm attacca al batteri sulla scelta.
3. Una volta che il worm è sulla punta del plettro, trasferirlo immediatamente alla nuova piastra toccando o scorrere la punta del plettro contro il prato batterica della nuova piastra, e il worm dovrebbe strisciare fuori. Bisogna fare attenzione a non danneggiare la superficie di agar sul piatto altrimenti i vermi strisciare nei fori rendendo difficile recuperarli. Se il worm rimane sul prendere per troppo tempo, potrebbe essiccare.

Parte 5: EMS mutagenesi

Solfonato metano etile (EMS) induce un ampio spettro di mutazioni nel genoma del 2. Mutanti possono essere identificati da difetti, come la deposizione delle uova, dei difetti muscolaris, la determinazione del sesso, la formazione dauer, il comportamento e la formazione delle gonadi. Il protocollo per EMS mutagenesi è simile a quello descritto per C. elegans ^1.

1. Preparare 500 ml (o più) di NaOH 1N.
2. Prendere 4-5, 6 cm di diametro piastre Petri pieno di vermi, contenente poche centinaia di vermi al terzo larvale giovanile (J3) stadio e lavare via i vermi utilizzando 2-3 ml di M9 sterile per piastra.
3. Raccogliere tutti i vermi in un contenitore sterile, monouso 15 ml di tubo di centrifuga. Centrifugare a 1500 xg per 5-7 minuti o fino a quando i vermi forma una pallina.
4. Aspirare il liquido e l'uso 2 ml di M9 per risospendere i vermi. Aggiungere 20 l EMS in una provetta contenente 2 ml di M9 e agitare per dissolverlo. Aggiungere questa soluzione EMS al 2 ml di sospensione a vite senza fine e miscelare delicatamente. La concentrazione finale di EMS sarà 47 mm. Attenzione: EMS è un agente mutageno molto forte e devono essere trattati in una cappa aspirante. Tutto il materiale (guanti, pipette, puntali) che entrano in contatto con questo mutagene devono essere trattati con NaOH 1N a inattivo SME. Indossare i guanti doppio durante l'intera procedura di mutagenesi EMS. Smaltire i rifiuti pericolosi secondo le direttive del tuo istituto.
5. Posizionare la provetta e coprire il tappo con parafilm; posto orizzontalmente nella cappa e lasciare che il worm incubare per 3,5 ore. Il tubo può essere posizionato su una sedia a dondolo a bassa velocità.
6. Ruotare il tubo e coprire il tappo con parafilm, posto in posizione verticale e incubare fino al lavandino vermi.
7. Aspirare il supernatante ed eliminarlo in un bicchiere / pallone contenente NaOH 1N. Questo inattivare la SME.
8. Aggiungere 5 ml M9 per i vermi, invertire il tubo di 25-30 volte per lavare i vermi, centrifugare a 1500 xg per 5-7 minuti o fino a quando i vermi forma una pallina. Aspirare il supernatante ed eliminarlo nel becher NaOH 1N.
9. Ripetere la fase di lavaggio almeno 3 volte.
10. Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere il worm pellet in quantità minima (~ 500 microlitri) di M9 e pipetta fuori su piastre NGM contenente un prato di OP50 batteri. A questo punto non hai più bisogno di lavorare nella cappa chimica.
11. Lasciate asciugare il liquido per qualche minuto e poi raccogliere e trasferire sano cercando J4 larve di nuove piastre seminato. Scartare la piastra originale secondo le linee guida rifiuti pericolosi del tuo istituto.
12. Lasciate l'auto mutagenizzate vermi fertilizzare. Utilizzando uno stereomicroscopio, schermo i fenotipi generazione F2 per mutanti recessivi di interesse.

Parte 6: Psoralen mutagenesi

In questa sezione sono descritte le procedure per mutagenesi utilizzando TMP in collaborazione con lunghezza d'onda ultraviolette (UV). TMP / UV metodo di mutagenesi è ampiamente usato per indurre mutazioni per delezione all'interno di un genoma ^3.

1. Raccogliere i vermi 4-5, 6 piastre di Petri cm di diametro in una provetta da 15 ml per centrifuga, come descritto nella procedura precedente.
2. Aggiungere 10 ml di M9, capovolgere 20 volte per lavare i vermi, e centrifugare a 1500 xg per 5 minuti. Eliminare il surnatante e ripetere il lavaggio per un totale di 3 volte. Aspirare il liquido e risospendere i vermi in circa 10 volte il loro volume di M9 contenente 30 mg / ml di TMP. Pipettare 20 ml di TMP (3 mg / ml) in 2 ml di M9. Come lo SME, TMP è un potente cancerogeno e devono essere trattati adottando misure di sicurezza adeguate. Per prevenire dal rischio potenziale della giusta luce UV occhio indossa dovrebbe essere usato. Il monouso devono essere eliminati in sacchetti di corretta rischio biologico.
3. Incubare la provetta al buio per 15 minuti a temperatura ambiente su una sedia a dondolo a bassa velocità (40 UPM). La camera d'aria verticalmente coperto per 10 minuti per consentire tutte le lavandino vermi.
4. Togliere i vermi dal fondo della provetta con una pipetta Pasteur e trasferirli su un piatto NGM testa di serie. Scartare il sopranatante seguenti linee guida chimici pericolosi del tuo istituto.
5. Mantenere la piastra nel buio fino a quando la TMP in eccesso viene assorbito nel piatto.
6. Utilizzando un misuratore di raggi UV di intensità, impostare la distanza tra la sorgente di raggi UV onda lunga e la piastra in modo tale che l'intensità sul piatto è di 500 μW / cm ^{2 4.} Togliere il coperchio in alluminio e il coperchio e coprire ed esporre la piastra contenente i vermi TMP trattati per le radiazioni UV a onda lunga per 50 secondi.
7. Coprire e lasciare i vermi al buio per 5 ore a temperatura ambiente.
8. Raccogliere e trasferire sano cercando J4 larve di nuove piastre seminato. Scartare la piastra originale seguenti linee guida chimici pericolosi del tuo istituto.
9. Utilizzando uno stereomicroscopio, schermo i fenotipi generazione F2 per la mutazione di interesse.

Parte 7: Risultati Rappresentante

Alcuni dei P. pacificus fenotipi mutanti derivanti dalla mutagenesi (sia da EMS o TMP / UV) sono mostrati in figura 1. Ogni mutante ha un fenotipo caratteristica che è facilmente distinguibile dal tipo di animale selvatico. Dal wormche sono stati trattati con il mutageno, 30 J3/J4 larve della generazione dei genitori (P0) sono stati collocati in piatti separati e il permesso di deporre le uova, che sono la generazione F1. Dalle piastre che ha mostrato sana progenie F1, per un totale di 1000 F1S sono stati trasferiti su piatti individuali e la progenie F2 è stato proiettato per i fenotipi. Gli animali con Dumpy ^{5,6, 6} e non coordinate trasformatore ⁷ fenotipi sono stati trovati.

Figura 1. Pristionchus tipo pacificus selvatici e animali mutanti. A. wt ermafrodita B. peso maschile C. DPY mutante D. unc mutante E. TRA mutante. Prime due pannelli che mostrano selvatici tipo ermafrodita (a sinistra) e maschile (a destra) gli animali da confrontare con i mutanti differenti nei pannelli rimanenti.

Discussion

Mutagenesi è una tecnica ampiamente utilizzata per gli studi genetici in diversi organismi modello sperimentale. Esperimenti di mutagenesi sono spesso utilizzati per identificare la funzione di un gene ^2. Le procedure di mutagenesi qui descritto può essere utilizzato non solo per P. Pacifico, ma anche per la C. elegans ed altre specie di nematodi correlati. Qui si descrivono due metodi, EMS e TMP / UV mutagenesi.

EMS è una sostanza chimica che induce mutazioni puntiformi o piccole delezioni in tutto il genoma ^3,8. Psoralen mutagenesi (TMP / UV) induce la maggior parte mutazioni per delezione nel DNA a causa di possibili rotture indotte dalla luce UV. I frammenti di eliminazione sono tipicamente nel range compreso fra 0,10 e 15 kb di lunghezza ^3.

Siamo sottoposti a screening per fenotipi che sono relativamente comuni da trovare. In una schermata con EMS, per ogni 400 lastre con gli animali F2, circa un piatto ha avuto un DPY, Unc o Tra. DPY può essere riconosciuto per le sue dimensioni più brevi ^7, Unc per i suoi movimenti anomali Tra ⁶ e per avere un fenotipo maschile e un cariotipo XX ^7. TMP / UV mutagenesi ha una frequenza più bassa di generare mutanti rispetto a EMS ^3, ma genera più le eliminazioni.

Per i nematodi, la larva in ritardo quarta fase o giovane adulto è la fase più efficace di sviluppo di effettuare mutagenesi perché hanno il massimo numero di nuclei della linea germinale. E 'quindi utile iniziare l'esperimento con una popolazione sincronizzato dei genitori con molte larve di quarto stadio. Un modo semplice di fare le culture sincronizzato è facendo nuove culture con le uova invece di vermi adulti. Nella generazione successiva, più vermi sarà circa la stessa età. Mutazioni recessive può essere rilevato controllando la progenie di individui F1, che producono circa il 25 per cento di omozigoti.

La potenza di schermi genetica nei nematodi può essere ulteriormente sfruttato modificando il disegno dello schermo ^9. La combinazione di stile di vita ermafroditi e tempo di generazione rapida nematodi rende ideale per gli studi di genetica.