Solucan Lab An Introduction to: Kültürleme Worms Mutagenez

Summary

Tarama fenotipik defekti olan mutantlar için, belirli bir biyolojik süreç fonksiyonu genleri tanımlamak için basit bir yöntem. Bu yazıda, kültür serbest yaşayan solucanlar (örneğin, nasıl tarif

Abstract

Ultraviyole ışığı ile birlikte (TMP / UV) etil metan sülfonat (EMS) ve 4, 5 ', 8-Trimethylpsoralen: Bu protokol, laboratuvar ve nasıl iki alternatif yöntemler kullanarak onları mutagenize nematod korumak için prosedürler açıklanmaktadır. Nematodlar, çünkü kendinden gübreleme hermafroditlerde ve hayvan başına ahfadının yüzlerce üretebilir erkek oluşmaktadır basit vücut planı ve çiftleşme sistemi, genetik çalışmalar için güçlü bir biyolojik sistemler. Nematod, bakteri çim içeren agar plaklarına korunur ve kolay bir plakadan bir pick kullanarak başka bir transfer edilebilir. TMP / UV esas silmeler indükler EMS, nokta mutasyonları ve küçük delesyonlar ikna etmek için yaygın olarak kullanılan bir alkilleyici ajandır. Nematod kullanılan türlerin bağlı olarak, EMS ve TMP konsantrasyonları optimize edilmesi gerekecektir. Nematod Pristionchus pacificus resesif mutasyonlar izole etmek için, F2 nesil hayvanlar görsel fenotipleri için tarandı. Bu yöntemleri göstermek için, solucanlar mutagenized ve koordinasyonsuz (UNC), Dumpy (dpy) ve Trafo (Tra) mutantlar aradı.

Protocol

Bölüm 1: nematod büyüme ortamının hazırlanması (NGM) Petri kapları

C. elegans ve P. Deneysel nematod pacificus genellikle nematodu Büyüme Orta (NGM) ¹ içeren 6 cm Petri kapları laboratuvarda kültür. Worms, 20 ° C'de tutulur, ama bir sıcaklık aralığında (4 ila ° C - 25 ° C) inkübe nematod türleri ve deneysel tasarım bağlı. NGM ile plakaları hazırlamak için, standart, steril teknikleri, mantar ve bakteri bulaşmasını önlemek için kullanılması gerekmektedir. NGM plakaları hazırlamak için protokol:

1. 15 g agar, 2.4 g NaCl, 2 g Tripton, 2.72 g KH ₂ PO _4, 2 L erlene, su, otoklav ile 1 litre hacim makyaj ve 60 ° C su banyosunda soğutmak için izin tartılır .
2. 0.8 ml 1 M CaCl _2, kolesterol (5 mg / ml etanol), ve 1 M MgSO _4. Fungal ve bakteriyel kirlenme, 1 ml streptomisin (100 mg / ml) ve 1ml nistatin (10 mg / ml) önlemek için her bir litre orta eklenebilir.
3. Unispense makine kullanma ve steril koşullarda muhafaza medya istenilen plakalar içine dökün. Plakalar yaklaşık 2 / 3 ^üncü tam dolu olmalıdır. Standart bir 60 mm çapında plaka medya yaklaşık 10 ml gerektirir. Agar tamamen gelified kadar plakaları hareket etmeyin, aksi halde zor stereomikroskopta solucanlar odak agar pürüzlü bir yüzey olacaktır.
4. Kuruduktan sonra plakalar hemen 4 numaralı seribaşı veya saklanabilir ° C bakteri ekim kadar.

Bölüm 2: OP50 bakteri hazırlanması ve ekim NGM Petri kapları

P. pacificus E.coli OP50 gerginlik beslenen laboratuvar ortamında kültüre. OP50 böylece solucanlar ¹ görselleştirme kolaylaştıran ince bir çim oluşturan NGM plakalar üzerinde sınırlı bir büyüme vardır. OP50 bir kültür büyümek için, LB-suyu kullanın:

1. 500 ml vidalı kapaklı şişe, 500 ml distile su ve otoklav ile ses makyaj 5 g bactotryptone, 2.5 g maya özü ve 2.5 g NaCl ekleyin.
2. Suyu, steril koşullar altında kültür plakasına OP50 tek bir koloni aşılamak ve bu 37 geceleme büyümesine izin ° C
3. LB-OP50 kullanılmaya hazır ve kısırlık muhafaza ise 4 ° C'de birkaç ay saklanabilir. Plakalar numaralı seribaşı gerektiğinde, küçük bir steril beher içine küçük bir miktar suyu dökün ve bu stok kültür kirlenmesini önlemeye yardımcı olacaktır.
4. Tohum plakaları, 60 mm çap NGM Petri plaka ve yaymak için girdap üzerine OP50 100-120 ul dağıtmak.
5. Büyümek için çim için oda sıcaklığında bir gecede bu numaralı seribaşı plakaları inkübe edin. Bu seribaşı plakalar, 3 hafta kadar 4 ° C'de saklanabilir. Ters bir pozisyonda saklanması hızlı kurumasını önlemek yardımcı olur.

Bölüm 3: bir seçim yapma

Bu bölümde, solucanlar için bir seçim yapmak nasıl açıklar. Almak, solucanlar, tek bir konumdan diğerine aktarmak için kullanılır. Bazı araştırmacılar biraz değişik metal bileşimleri tercih olsa pick 30 göstergesi% 10% 90 platin iridyum tel yapılır:

1. Tel 3-4 cm Kes, Pasteur pipeti (ucu küçük bir uzunluğu kırıldı) ucu ve daha sonra içine 0,5 cm Bunsen beki üzerinden bardağa mühür. Camdan çıkıntılı tel uzunluğu yaklaşık 3-3.5 cm, ancak bireysel tercihlerine göre değişebilir.
2. Sonunda, bir çekiç ve pense kullanarak çıkıntılı tel düzleştirin. Sonra bir kepçe formu basık kısmını yukarı doğru bükün.
3. Solucan veya agar zarar görmesini engellemek için zımpara kağıdı ile pick keskin kenarları yumuşatmaya.

Bölüm 4: Toplama solucanlar

1. , Solucanlar almak bir alev platin tel sterilize ve delinme veya hasar agar yüzeyi bakım alarak, ceket ucu kalın yapışkan bakteri bakteriyel çim boyunca almak basık ucu sürükleyin.
2. Stereomikroskopta kullanarak, çok solucan alma bakteri sopalarla kadar alınır solucan / solucanlara karşı yapışkan ucu hafifçe fırçalayın.
3. Alma ucundaki solucan sonra, bakteriyel çim karşı yeni plaka almak ucu dokunmadan veya sürgülü hemen yeni plaka transfer ve solucan tarama olmalıdır. Bakım başka solucanlar zor onları almak için deliklere tarama plaka üzerinde agar yüzeyine zarar vermemek için alınmalıdır. Solucan, çok uzun süre pick kalırsa, birbirinden ayrılacak.

Bölüm 5: EMS mutagenez

Etil metan sülfonat (EMS) 2 genom mutasyonları geniş bir yelpazede neden olur. Mutantlar, yumurtlama, kas defekti gibi kusurları tespit edilebilirlar, cinsiyet tayini, Dauer oluşumu, davranış ve gonad oluşumu. EMS mutagenez için protokol C için açıklanan benzer elegans ^1.

1. 1N NaOH 500 ml (veya daha fazla) hazırlayın.
2. , Solucanlar tam 6 cm çapında Petri kapları 4-5 atın üçüncü larva jüvenil (J3) aşamada birkaç yüz solucanları içeren ve 2-3 ml steril M9 plaka başına kullanarak kapalı solucanlar yıkayın.
3. Steril, tek kullanımlık 15 ml santrifüj tüpüne tüm solucanları toplayın. Solucanlar yayılmak için bir pelet oluşana kadar 5-7 dakika veya 1500 xg'de santrifüjleyin.
4. Sıvı aspire ve M9 2 ml yeniden askıya solucanlar kullanabilirsiniz. M9 2 ml içeren bir tüp 20 ul EMS ekleyin ve bunu çözmek için sallayın. Sonra hafifçe solucan süspansiyon ve türbülans 2ml EMS çözüm ekleyin. EMS son konsantrasyonu 47 mM olacak. Dikkat: EMS çok kuvvetli mutajen ve davlumbaz ele alınmalıdır. Bu mutajen ile temas eden tüm malzemeler (eldiven, pipetler, ipuçları) EMS inaktif 1N NaOH ile tedavi edilmelidir. Tüm EMS mutagenez prosedürü sırasında çift eldiven giyin. Kurumun kurallarına göre tehlikeli atık bertaraf edin.
5. Santrifüj tüpüne yerleştirin ve parafilm kapağı kapak; davlumbaz yatay olarak yerleştirin ve 3,5 saat süreyle inkübe solucanlar izin. Tüp da düşük bir hızda rocker yerleştirilebilir.
6. Tüp parafilm kapağı açın ve kapağı, solucanlar lavaboya kadar dikey konumu ve inkübe yer.
7. Süpernatantı aspire ve 1N NaOH içeren bir beher / balona atın. Bu EMS inaktive.
8. 5 ml M9 solucanlar, solucanlar bir pelet oluşana kadar 5-7 dakika veya 1500 xg'de solucanlar, santrifüj yıkamak için tüp 25-30 kez ters çevirin. Süpernatantı aspire ve 1N NaOH beher içine atın.
9. Çamaşır adım en az 3 kez tekrarlayın.
10. M9 az miktarda (~ 500 ul) pelet solucan son yıkamadan sonra, yeniden askıya alma ve OP50 bakteriler içeren bir çim NGM plakalar üzerine pipetle. Bu noktada artık kimyasal kaputu çalışmak gerekiyor.
11. Sıvı birkaç dakika kurumasını bekleyin ve sonra taze numaralı seribaşı plakaları almak ve sağlıklı görünen J4 larva transferi. Orijinal plaka kurumun tehlikeli atık kurallarına göre atın.
12. Mutagenized solucanlar kendi kendini döller. Bir stereomikroskopta kullanarak, ilgi resesif mutantlar için F2 nesil fenotipleri ekran.

Bölüm 6: Psoralen mutagenez

Bu bölümde, uzun dalga boyu ultraviyole (UV) ile birlikte TMP kullanarak mutagenez için prosedürü açıklar. Mutagenez TMP / UV yöntemi yaygın bir genom ³ içinde silinmesi mutasyonlar ikna etmek için kullanılır.

1. Önceki yordamda açıklandığı gibi 15 ml santrifüj tüp içine 4-5, 6 cm çapında Petri kapları solucanları toplayın.
2. 5 dakika için 1500 xg'de 20 kez ters solucanlar, ve santrifüj yıkamak için, 10 ml M9 ekleyin. Süpernatantı atın ve bir toplam 3 kez yıkama tekrarlayın. Sıvı aspire ve M9 kendi hacmi 30 mcg / ml TMP içeren yaklaşık 10 kez solucanlar yeniden askıya. Pipet 20 M9 2 ml içine TMP ul (3 mg / ml). EMS gibi, TMP güçlü bir kanserojen ve uygun güvenlik önlemleri alarak ele alınması gerekir. UV ışık uygun göz giyer potansiyel risk önlemek için kullanılmalıdır. Tek uygun biyolojik tehlike torbalara atılmalıdır.
3. Tüp düşük devirli bir rocker (40 UPM), oda sıcaklığında 15 dakika boyunca karanlıkta inkübe edin. Dikey kapalı tüp solucanlar lavabo izin vermek için 10 dakika olarak ayarlayın.
4. Pasteur pipeti ile tüp altındaki solucanlar çıkarın ve seri başı olmayan bir NGM plaka üzerine aktarabilirsiniz. Kurumunuzun tehlikeli kimyasal yönergeleri izleyerek süpernatantı atın.
5. Aşırı TMP plaka emilir kadar karanlıkta plaka tutun.
6. UV yoğunluk ölçer kullanarak, 500 μW / cm ^{2 4} plaka üzerinde yoğunluk olduğunu, uzun dalga UV kaynağı ve plaka arasındaki mesafeyi ayarlamak . Alüminyum kapak ve kapak çıkarın ve 50 saniye için uzun dalga UV radyasyonu TMP tedavi solucanları içeren plaka kapak ve maruz.
7. Kapak ve oda sıcaklığında 5 saat süreyle karanlıkta solucanlar terk.
8. Alış ve taze numaralı seribaşı plakaları sağlıklı görünen J4 larva transferi. Kurumun tehlikeli kimyasal yönergeleri izleyerek orijinal plaka atın.
9. Bir stereomikroskopta kullanarak, ilgi mutasyon için F2 nesil fenotipleri ekran.

Bölüm 7: Temsilci Sonuçlar

Bazı P. mutagenez (ya EMS veya TMP / UV) kaynaklanan pacificus mutant fenotipleri Şekil 1'de gösterilmiştir. Her mutant vahşi tip hayvan kolayca ayırt karakteristik bir fenotip vardır. Solucanlarmutajen, ebeveyn nesil (P0) 30 J3/J4 larvaları ayrı tabak yerleştirilir ve F1 nesil yumurta bırakmak için izin verildi ile tedavi edildi. Sağlıklı F1 döl gösterdi plakaları, toplam 1000 F1s ayrı ayrı kalıplara transfer edildi ve F2 döl fenotipleri gösterildi. Dumpy ^5,6, ankoordine ⁶ ve Trafo ⁷ fenotipleri Hayvanlar bulundu.

Şekil 1 Pristionchus pacificus yabani tip ve mutant hayvanlar. A. wt hermafrodit B. wt erkek C. dpy mutant D. unc mutant E. tra mutant. Top iki panel vahşi tip hermafrodit (solda) ve erkek (sağ) Hayvanların gösteren kalan paneller farklı mutantlar ile karşılaştırmak.

Discussion

Mutagenez çeşitli deneysel model organizmaların genetik çalışmalar için yaygın olarak istihdam edilen bir tekniktir. Mutagenez deneyler genellikle bir genin ² işlevini tanımlamak için kullanılır. Pa sadece burada açıklanan mutagenez prosedürleri kullanılabilir pacificus değil, aynı zamanda C elegans ve ilgili diğer nematod türü. Burada iki yöntem, EMS ve TMP / UV mutagenez açıklar.

EMS genom ^3,8 boyunca nokta mutasyonları veya küçük delesyonlar indükler bir kimyasaldır. Psoralen mutagenez (TMP / UV), UV ışınları tarafından uyarılan mümkün kırılması nedeniyle DNA silme mutasyonlar çoğunlukla neden olur. Silme parçalarının uzunluğu ³ ,10-15 kb aralığında genellikle.

Biz bulmak için oldukça yaygındır fenotipleri gösterildi. EMS, F2 hayvanlar ile her 400 plakaları için kullanan bir ekran yaklaşık bir plaka dpy, UNC veya Tra vardı. Dpy, bir erkek fenotip ve bir XX ^karyotip 7 için anormal ^{hareket 6} ve Tra için kısa ^{boyutu 7,} UNC tarafından kabul edilebilir . TMP / UV mutagenez mutantlar üreten EMS ³ ile karşılaştırıldığında daha düşük bir frekans var, ama büyük silmeler üretir.

Nematod için geç dördüncü aşamada larva veya genç erişkin germ line çekirdeğinin en fazla sayıda var çünkü mutagenez yürütmek için en etkili gelişim aşamasıdır. Bu nedenle çok dördüncü evre larvaları ile senkronize bir ebeveyn nüfusu ile denemeyi başlatmak için yararlıdır. Yumurta yerine erişkin solucanlar yeni kültürler yaparak basit bir şekilde senkronize kültürler yapma. Aşağıdaki nesil, en solucanlar aynı yaşta olacaktır. Resesif mutasyonlar homozigot yirmi beş yüzde üretecek F1 bireylerin döl inceleyerek tespit edilebilir.

Nematod genetik ekranlar güç ⁹ ekran tasarımı değiştirerek yararlanılabilir. Hermaphroditic, yaşam tarzı ve hızlı nesil zaman kombinasyonu genetik çalışmalar için ideal bir nematod yapar.