Uma Introdução ao Lab Worm: de Worms Cultivar a mutagênese

Summary

Triagem de mutantes com defeitos fenotípicos é um método simples para identificar genes que funcionam em um determinado processo biológico. Neste artigo vamos descrever como worms cultura livre vivos (por exemplo,

Abstract

Este protocolo descreve os procedimentos para manter a nematóides em laboratório e como induz mutações los usando dois métodos alternativos: o metano sulfonato de etila (EMS) e 4, 5, 8-trimethylpsoralen combinada com luz ultravioleta (TMP / UV). Nematóides são poderosos sistemas biológicos para estudos genéticos por causa de seu plano corporal simples e sistema de acasalamento, que é composto de auto-fertilização hermafroditas e homens que podem gerar centenas de descendentes por animal. Nematóides são mantidos em placas de ágar contendo um gramado de bactérias e podem ser facilmente transferidos de uma placa para outra usando uma picareta. EMS é um agente alquilante comumente usado para induzir mutações pontuais e pequenas deleções, enquanto TMP / UV induz principalmente exclusões. Dependendo da espécie de nematóide sendo usado, as concentrações de EMS e TMP terá que ser otimizado. Para isolar mutações recessivas do nematóide pacificus Pristionchus, os animais da geração F2 foram selecionados para fenótipos visualmente. Para ilustrar esses métodos, mutagenizados worms e olhou para a falta de coordenação (Unc), Dumpy (DPY) e Transformer (Tra) mutantes.

Protocol

Parte 1: Preparando o crescimento da mídia nematóide (NGM) placas de Petri

Nematóides experimentais como C. elegans e P. pacificus são normalmente cultivadas em laboratório em 6 placas de Petri contendo meio centímetro Nematóides do Crescimento (NGM) ^1. Worms são mantidos a 20 ° C, mas pode ser incubado a uma gama de temperaturas (entre 4 ° C - 25 ° C), dependendo da espécie de nematóides e design experimental. Para preparar pratos com NGM, standard técnicas estéreis devem ser utilizados para evitar a contaminação por fungos e bactérias. Segue-se o protocolo para preparar placas NGM:

1. Pesar 15 g de ágar, 2,4 g NaCl, 2 g Triptona, e 2,72 g KH ₂ PO ₄ em 2 L frasco cônico, fazer volume até 1 L com autoclave, água e deixe-o esfriar até 60 ° C em banho-maria.
2. Adicione 0,8 ml cada, de 1 M CaCl _2, colesterol (5 mg / ml em etanol) e 1 M MgSO _4. Para evitar a contaminação por fungos e bactérias, 1 estreptomicina ml (100 mg / ml) e nistatina 1ml (10 mg / ml) podem ser adicionados a cada litro de meio.
3. Usando uma máquina Unispense e manter condições estéreis, despeje a mídia nas placas desejado. As placas devem ser preenchidos para cerca de 2 / 3 ^rd completo. Um padrão de 60 mm de diâmetro placa requer cerca de 10 ml dos meios de comunicação. Não mova as placas até que o ágar esteja completamente gelified, caso contrário haverá uma superfície irregular de agar, o que torna difícil se concentrar worms na estereomicroscópio.
4. Depois de secas, as placas podem ser semeadas imediatamente ou armazenados a 4 ° C até a semeadura com bactérias.

Parte 2: Preparando OP50 bactérias e semeadura placas NGM Petri

P. pacificus é cultivado em laboratório, alimentando a tensão OP50 E.coli. OP50 tem um crescimento limitado em placas NGM, formando um gramado fino que facilita a visualização dos worms ^1. A crescer uma cultura de OP50, use o caldo LB:

1. Adicionar 5 g bactotryptone, 2,5 g de extrato de levedura e 2,5 g de NaCl para um frasco de 500 ml tampa de rosca, faça aumentar o volume para 500 ml com água destilada e autoclave.
2. Inocular o caldo com uma única colônia de OP50 da placa de cultura em condições estéreis e deixá-lo crescer overnight a 37 ° C.
3. LB-OP50 está pronto para ser usado e pode ser armazenado a 4 ° C durante vários meses, se a esterilidade é mantida. Sempre que as placas precisam ser semeados, despeje uma pequena quantidade do caldo em um copo pequeno estéril e isso vai ajudar a evitar a contaminação da cultura estoque.
4. Para placas de semente, dispensar 100-120 mL da OP50 para a 60 mm de diâmetro NGM placa de Petri e agite para espalhá-lo.
5. Incubar estas placas semeadas durante a noite a temperatura ambiente para o relvado a crescer. Estas placas semeadas agora podem ser armazenados a 4 ° C por até 3 semanas. Armazenando-os em uma posição invertida ajuda a evitar uma secagem rápida.

Parte 3: Fazendo uma picareta

Nesta seção descrevemos como fazer uma escolha para vermes. A picareta é usado para transferir worms de um local para outro. A escolha é feita de 30 a 90% fio de platina irídio calibre 10%, embora alguns pesquisadores podem preferir composições de metal ligeiramente diferente:

1. Cortar cerca de 3-4 cm de fio, coloque 0,5 cm de la dentro a ponta de uma pipeta Pasteur (cuja ponta foi quebrada a um menor comprimento), e depois selá-la no vidro sobre um bico de Bunsen. O comprimento do fio saindo do vidro é de cerca de 3-3,5 cm, mas pode variar de acordo com as preferências individuais.
2. Achatar a extremidade do fio que está saindo com um martelo ou alicate. Em seguida, dobre para cima porção achatada para formar uma colher.
3. Suavizar as bordas afiadas da pick com uma lixa para evitar danos ao worm ou o ágar.

Parte 4: worms Picking

1. Para escolher worms, esterilizar o fio de platina em uma chama e arraste a ponta achatada da pick ao longo do gramado bacteriana para revestir a ponta com espessura bactérias pegajoso, tomando cuidado para não perfurar ou danificar a superfície do ágar.
2. Usando o estereomicroscópio, muito levemente a ponta da escova pegajosa contra os vermes worm / para ser escolhido até o worm varas para as bactérias na escolha.
3. Uma vez que o worm está na ponta da picareta, transferi-lo imediatamente para a nova placa tocando ou deslizando a ponta da picareta contra o gramado bacteriana da placa de novo, eo bicho deve rastrear off. Cuidados devem ser tomados para não danificar a superfície do agar na placa mais os vermes rastejam nos orifícios que torna difícil recuperá-los. Se o worm permanece na escolha por muito tempo, ele pode desidratar.

Parte 5: EMS mutagênese

Etílico metano sulfonato (EMS) induz a um amplo espectro de mutações no genoma do 2. Mutantes podem ser identificados por defeitos como a postura de ovos, defeitos muscularess, a determinação do sexo, formação Dauer, comportamento e formação das gônadas. O protocolo para EMS mutagênese é semelhante ao descrito para C. elegans ^1.

1. Prepare 500 ml (ou mais) de NaOH 1N.
2. Tome 4-5, 6 cm de diâmetro placas de Petri cheia de vermes, contendo algumas centenas de worms na terceira larval juvenil (J3) palco e lavar os worms fora de usar 2-3 ml de M9 estéril por placa.
3. Recolher todos os worms em uma estéril, descartável tubo de centrifugação de 15 ml. Centrifugar a 1500 xg por 5-7 minutos ou até que os vermes formam uma pelota.
4. Aspirar o líquido e usar 2 ml de M9 para re-suspender os vermes. Adicionar 20 mL EMS para um tubo contendo 2 ml de M9 e agite para dissolvê-lo. Em seguida, adicione esta solução EMS ao 2ml de suspensão worm e homogeneizar suavemente. A concentração final da EMS será 47 mM. Atenção: A EMS é um mutagênico muito forte e deve ser tratado em uma capela. Todos os materiais (luvas, pipetas, dicas) que entram em contato com este agente mutagénico deve ser tratada com NaOH 1N para inativo da EMS. Usar luvas duplo durante todo o procedimento mutagênese EMS. Descarte os resíduos perigosos de acordo com as diretrizes da instituição.
5. Coloque o tubo de centrifugação e cobrir a tampa com parafilme; colocá-lo horizontalmente no extractor de fumo e deixar as minhocas incubar por 3,5 horas. O tubo também pode ser colocado em um rocker de baixa velocidade.
6. Vire o tubo e cobrir a tampa com parafilme; lugar na posição vertical e incubar até que o dissipador worms.
7. Aspirar o sobrenadante e descartá-lo em um copo / frasco contendo NaOH 1N. Isto irá desativar o EMS.
8. Adicionar 5 ml M9 aos vermes, inverter o tubo 25-30 vezes para lavar os worms, centrifugar a 1500 xg por 5-7 minutos ou até que os vermes formam uma pelota. Aspirar o sobrenadante e descartar no copo NaOH 1N.
9. Repita o passo de lavagem, pelo menos, três vezes.
10. Após a lavagem final, re-suspender o worm sedimento em quantidade mínima (~ mL 500) de M9 e pipeta-los em placas NGM contendo um gramado de OP50 bactérias. Neste ponto, você não precisa mais trabalhar no bairro química.
11. Deixe o líquido secar por alguns minutos e em seguida, escolher e transferência de aparência saudável J4 larvas de placas semeadas frescas. Descarte a placa original de acordo com as diretrizes da instituição resíduos perigosos.
12. Deixe o auto worms mutagenizados fertilizar. Usando um microscópio estereoscópico, a tela do fenótipos geração F2 para mutantes recessivos de interesse.

Parte 6: Psoralen mutagênese

Nesta seção, vamos descrever o processo de mutagênese com TMP em conjunto com comprimento de onda ultravioleta longo (UV). TMP / UV método de mutagênese é amplamente utilizado para induzir mutações exclusão dentro de um genoma ^3.

1. Coletar worms 4-5, 6 cm de diâmetro placas de Petri em um tubo de centrifugação de 15 ml, conforme descrito no procedimento anterior.
2. Adicionar 10 ml M9, inverter 20 vezes a lavar os worms, e centrifugar a 1500 xg por 5 minutos. Desprezar o sobrenadante e repetir a lavagem para um total de 3 vezes. Aspirar o líquido e re-suspender a worms em cerca de 10 vezes o seu volume de M9 contendo 30 mg / ml de TMP. Pipeta mL 20 de TMP (3 mg / ml) em 2 ml de M9. Como EMS, TMP é um carcinógeno potente e deve ser tratada tomando medidas de segurança apropriadas. Para evitar de risco potencial do olho luz UV adequada usa deve ser usado. Os materiais descartáveis ​​devem ser descartados em sacos adequados biohazard.
3. Incubar o tubo no escuro por 15 minutos em temperatura ambiente em um rocker de baixa velocidade (40 UPM). Definir o tubo coberto verticalmente por 10 minutos para deixar tudo afundar o worms.
4. Remover os vermes do fundo do tubo com uma pipeta Pasteur e transferi-los para uma placa NGM unseeded. Desprezar o sobrenadante seguir as diretrizes da instituição químicos perigosos.
5. Manter a placa no escuro até o TMP excesso é absorvido pela placa.
6. Usando um medidor de intensidade de UV, definir a distância entre a fonte de UV de onda longa ea placa de tal forma que a intensidade na placa é de 500 μW / cm ^{2 4.} Remova a tampa de alumínio ea tampa e cobrir e expor a placa contendo os vermes TMP tratados à radiação UV de onda longa por 50 segundos.
7. Cubra e deixe os vermes no escuro por 5 horas em temperatura ambiente.
8. Escolha e transferência de aparência saudável J4 larvas de placas semeadas frescas. Descarte a placa original após as diretrizes da instituição químicos perigosos.
9. Usando um microscópio estereoscópico, a tela do fenótipos geração F2 para a mutação de seu interesse.

Parte 7: Resultados Representante

Alguns dos P. fenótipos pacificus mutante resultante da mutagênese (seja por EMS ou TMP / UV) são mostrados na Figura 1. Cada mutante tem um fenótipo característico que é facilmente distinguível do animal do tipo selvagem. Do wormsque foram tratados com o mutagênico, 30 larvas J3/J4 da geração parental (P0) foram colocados em pratos separados e permitiu a pôr ovos, que são a geração F1. Das placas que mostrou progênie F1 saudável, um total de 1000 F1s foram transferidos para placas individuais ea progênie F2 foi exibido para os fenótipos. Animais com Dumpy ^{5,6, 6} e ⁷ descoordenada Transformer fenótipos foram encontrados.

Figura 1. Pristionchus tipo pacificus selvagens e animais mutantes. A. wt wt hermafrodita masculino B. C. D. DPY mutante unc mutante E. tra mutante. Top dois painéis mostrando tipo selvagem hermafrodita (esquerda) e macho (à direita) animais para comparar com os mutantes diferentes nos painéis restantes.

Discussion

Mutagênese é uma técnica amplamente empregada para estudos genéticos em vários organismos modelo experimental. Experimentos de mutagênese são freqüentemente usados ​​para identificar a função de um gene ^2. Os procedimentos de mutagênese descritos aqui podem ser usados ​​não apenas para P. pacificus, mas também para C. elegans e de outras espécies de nematóides relacionados. Aqui nós descrevemos dois métodos, EMS e TMP / UV mutagênese.

EMS é uma substância química que induz a mutações pontuais ou pequenas deleções em todo o genoma ^3,8. Psoraleno mutagênese (TMP UV /), principalmente a exclusão induz mutações no DNA, devido à possível quebra induzida pela luz UV. Os fragmentos de exclusão são geralmente na faixa de 0,10 a 15 kb de comprimento ^3.

Nós selecionados para fenótipos que são relativamente comuns de encontrar. Em uma tela usando EMS, para cada 400 placas com animais F2, cerca de um prato tinha um DPY, Unc ou Tra. DPY pode ser reconhecido pelo seu menor tamanho ^7, Unc para seu movimento anormal ⁶ e Tra por ter um fenótipo masculino e um cariótipo XX ^7. TMP / UV mutagênese tem uma menor freqüência de geração de mutantes em comparação com EMS ^3, mas gera exclusões maiores.

Para nematóides, a larva estágio final do quarto ou jovem adulto é o estágio de desenvolvimento mais eficaz para levar a cabo mutagênese, porque eles têm o número máximo de núcleos de linha germinal. É, portanto, útil para iniciar o experimento com uma população sincronizado dos pais com larvas estágio muitas quarto. Uma maneira simples de fazer culturas sincronizado está fazendo novas culturas com ovos em vez de vermes adultos. Na geração seguinte, a maioria dos worms será aproximadamente a mesma idade. Mutações recessivas podem ser detectadas por inspeção da progênie de indivíduos F1, que irá produzir cerca de vinte e cinco por cento dos homozigotos.

O poder de telas genética em nematóides podem ser mais bem explorada, modificando o desenho da tela ^9. A combinação do estilo de vida hermafroditas e tempo de geração rápido faz nematóides ideal para estudos genéticos.