Une introduction au laboratoire Worm: La culture de Worms à la mutagenèse

Summary

Le dépistage de mutants avec des défauts phénotypique est une méthode simple pour identifier les gènes qui fonctionnent dans un processus biologique donné. Dans cet article, nous décrivons comment les vers la culture vivante gratuit (par exemple,

Abstract

Ce protocole décrit les procédures pour maintenir les nématodes dans le laboratoire et la façon de les mutagénéiser en utilisant deux méthodes alternatives: méthanesulfonate d'éthyle (EMS) et 4, 5, 8-trimethylpsoralen combinée avec la lumière ultraviolette (TMP / UV). Les nématodes sont de puissants systèmes biologiques pour les études génétiques en raison de leur plan d'organisation simple et le système d'accouplement, qui est composé d'auto-fertilisation hermaphrodites et mâles qui peuvent générer des centaines de descendants par animal. Les nématodes sont maintenus dans des boîtes de gélose contenant un tapis de bactéries et peuvent être facilement transférés d'une plaque à l'autre en utilisant un médiator. EMS est un agent alkylant couramment utilisés pour induire des mutations ponctuelles et de petites délétions, tandis que la TMP / UV induit principalement des suppressions. Selon l'espèce de nématode utilisé, les concentrations de l'EMS et TMP devront être optimisés. Pour isoler des mutations récessives de l'pacificus nématodes Pristionchus, les animaux de la génération F2 étaient visuellement dépistage de phénotypes. Pour illustrer ces méthodes, nous mutagénisées vers et cherché non coordonnés (UNC), plutôt moche (dpy) et transformateur (TRA) des mutants.

Protocol

Partie 1: Préparation de milieux de croissance des nématodes (NGM) boîtes de Pétri

Nématodes expérimentale tels que C. elegans et P. pacificus sont généralement cultivées en laboratoire le 6 boîtes de Pétri contenant un milieu de croissance cm nématode (NGM) ^1. Worms sont conservés à 20 ° C, mais peuvent être incubés à une gamme de températures (entre 4 ° C - 25 ° C), selon les espèces de nématodes et la conception expérimentale. Pour préparer les plaques avec le NGM, des techniques standard de stériles doivent être utilisés pour prévenir la contamination fongique et bactérienne. Voici le protocole pour préparer des plaques NGM:

1. Peser 15 g d'agar, 2,4 g de NaCl, 2 g de tryptone, et 2,72 g de KH ₂ PO ₄ en 2 flacon L conique, faire du volume à 1 L avec de l'eau, l'autoclave et laisser refroidir à 60 ° C dans un bain d'eau.
2. Ajouter 0,8 ml de chacune des 1 M CaCl _2, le cholestérol (5 mg / ml dans l'éthanol), et 1 M MgSO _4. Pour éviter la contamination fongique et bactérienne, une ml de streptomycine (100 mg / ml) et la nystatine 1ml (10 mg / ml) peut être ajouté à chaque litre de milieu.
3. Utiliser une machine Unispense et le maintien des conditions stériles, versez les médias dans les plaques désiré. Les plaques doivent être remplis à environ 2 / 3 ^ème plein. Un standard de 60 mm de diamètre plateau nécessite environ 10 ml de la presse. Ne pas déplacer les plaques jusqu'à ce que l'agar est totalement gélifiée, sinon il y aura une surface inégale de la gélose, ce qui rend difficile de se concentrer vers sur le stéréomicroscope.
4. Une fois séchées, les plaques peuvent être ensemencées immédiatement ou conservés à 4 ° C jusqu'à l'ensemencement avec des bactéries.

Partie 2: Préparation des bactéries OP50 et l'ensemencement des boîtes de Petri NGM

P. pacificus est cultivée en laboratoire par l'alimentation sur la souche E. coli OP50. OP50 a une croissance limitée sur des plaques NGM, formant ainsi une pelouse fine qui facilite la visualisation des vers ^1. Pour développer une culture de la OP50, utiliser LB-bouillon:

1. Ajouter 5 g bactotryptone, 2,5 g extrait de levure et 2,5 g de NaCl à une bouteille de 500 ml bouchon à vis, faire monter le volume à 500 ml avec de l'eau distillée et autoclave.
2. Inoculer le bouillon avec une seule colonie de OP50 de la plaque de culture dans des conditions stériles et laisser pousser une nuit à 37 ° C.
3. LB-OP50 est prêt à être utilisé et peut être conservé à 4 ° C pendant plusieurs mois si la stérilité est maintenue. Chaque fois que les plaques doivent être ensemencées, versez une petite quantité de bouillon dans un petit bécher stérile et cela aidera à prévenir la contamination de la culture mère.
4. Pour plaques de graines, de distribuer 100 à 120 pl de la OP50 sur le 60 mm de diamètre NGM boîte de Pétri et agiter pour la répandre.
5. Incuber ces plaques ensemencées nuit à température ambiante pour la pelouse de croître. Ces plaques ensemencées peuvent désormais être conservés à 4 ° C pendant 3 semaines au maximum. Le stockage dans une position inversée permet d'éviter un séchage rapide.

Partie 3: Faire un choix

Dans cette section, nous décrivons comment faire un choix pour les vers. La pioche est utilisé pour transférer les vers d'un endroit à l'autre. La pioche est faite de calibre 30 en platine iridié de fil de 90% à 10%, bien que certains chercheurs préfèrent des compositions métalliques légèrement différente:

1. Coupez environ 3-4 cm de fil de fer, placer 0,5 cm de l'intérieur de la pointe d'une pipette Pasteur (dont la pointe était cassée à une petite longueur), puis le sceller dans le verre sur un bec Bunsen. La longueur du fil qui dépasse du verre est d'environ 3-3,5 cm, mais peut varier en fonction des préférences individuelles.
2. Aplatir la fin du fil qui est en saillie à l'aide d'un marteau ou une pince. Puis plier la partie aplatie vers le haut pour former une boule.
3. Lisser les arêtes vives de la reprise avec un papier de sable pour éviter d'endommager le ver ou l'agar.

Partie 4: Cueillette des vers

1. Pour ramasser des vers, stériliser le fil de platine sur une flamme et faites glisser la pointe aplatie de la camionnette le long de la pelouse bactérienne pour bien enrober la pointe avec une épaisseur de bactéries collant, en prenant soin de ne pas percer ou d'endommager la surface de la gélose.
2. Utilisation de la loupe binoculaire, très légèrement collante brosse à la pointe contre les vers ver / être pris jusqu'à la vis sans fin sur les bâtons à la bactérie sur le pick.
3. Une fois que le ver est à la pointe de la pioche, le transférer immédiatement à la nouvelle plaque en touchant ou en faisant glisser la pointe de la reprise de la pelouse contre les bactéries de la plaque de nouveau, et le ver doit ramper hors tension. Des précautions doivent être prises pour ne pas endommager la surface de la gélose sur la plaque reste les vers rampent dans les trous qui rend difficile de les récupérer. Si le ver reste sur le pick pendant trop longtemps, il pourrait dessécher.

Partie 5: EMS mutagenèse

Méthanesulfonate d'éthyle (EMS) induit un large spectre de mutations dans le génome de la 2. Mutants peuvent être identifiés par des défauts comme la ponte, une anomalie musculaires, la détermination du sexe, de la formation dauer, le comportement et la formation des gonades. Le protocole d'EMS mutagenèse est similaire à celle décrite pour C. elegans ^1.

1. Préparer 500 ml (ou plus) de NaOH 1N.
2. Prenez 4-5, 6 cm de diamètre boîtes de Pétri pleine de vers, contenant quelques centaines de vers à la troisième juvéniles larvaire (J3) stade et laver les vers off en utilisant 2-3 ml de solution stérile M9 par plaque.
3. Ramassez tous les vers dans un stérile, jetable 15 ml tube à centrifuger. Centrifuger à 1500 xg pendant 5-7 minutes ou jusqu'à ce que les vers forment un culot.
4. Aspirer le liquide et l'utilisation de 2 ml de M9 à suspendre à nouveau les vers. Ajouter 20 ul EMS dans un tube contenant 2 ml de M9 et secouez-le pour le dissoudre. Puis ajouter cette solution à l'EMS 2ml de suspension ver et remuer doucement. La concentration finale de l'EMS sera de 47 mM. Attention: EMS est un mutagène très fort et doit être manipulé sous une hotte. Tous les matériaux (gants, pipettes, conseils) qui entrent en contact avec cet agent mutagène doivent être traités avec NaOH 1N à l'état inactif du SME. Porter des gants à double lors de la procédure de mutagenèse EMS entier. Éliminer les déchets dangereux, conformément aux directives de votre institution.
5. Placez le tube de centrifugeuse et couvrir le bouchon avec du parafilm, le placer horizontalement dans la hotte et de laisser les vers incuber pendant 3,5 heures. Le tube peut aussi être placé sur une bascule basse vitesse.
6. Tourner le tube et le bouchon couvercle avec du parafilm et placer en position verticale et incuber jusqu'à ce que le puits de vers.
7. Aspirer le surnageant et le jeter dans un bécher / fiole contenant du NaOH 1N. Ce sera inactiver les EMS.
8. Ajouter 5 ml M9 aux vers, inverser le tube de 25 à 30 heures pour se laver les vers, centrifuger à 1500 xg pendant 5-7 minutes ou jusqu'à ce que les vers forment un culot. Aspirer le surnageant et jeter dans le bécher de NaOH 1N.
9. Répéter l'étape de lavage au moins 3 fois.
10. Après le lavage final, remettre en suspension le culot à vis sans fin en quantité minime (~ 500 pi) de M9 et les pipettes sur des plaques à NGM contenant un tapis de bactéries OP50. À ce stade, vous n'avez plus besoin de travailler dans la hotte chimique.
11. Laissez le liquide sécher pendant quelques minutes et ensuite choisir et de transfert d'apparence saine J4 larves fraîches plaques ensemencées. Jeter la plaque d'origine, conformément aux directives de votre établissement des déchets dangereux.
12. Laissez l'auto mutagénisées vers fertiliser. En utilisant un microscope stéréoscopique, l'écran les phénotypes des mutants génération F2 récessive d'intérêt.

Partie 6: psoralène mutagenèse

Dans cette section, nous décrivons la procédure de mutagenèse utilisant TMP en conjonction avec grande longueur d'onde ultraviolettes (UV). TMP / UV méthode de mutagenèse est largement utilisé pour induire des mutations dans un génome de suppression ^3.

1. Recueillir les vers de 4-5, 6 assiettes cm de Pétri de diamètre dans un tube de 15 ml à centrifuger comme décrit dans la procédure précédente.
2. Ajouter 10 ml M9, inverser 20 fois pour laver les vers, et centrifuger à 1500 xg pendant 5 minutes. Jeter le surnageant et répéter le lavage pour un total de 3 fois. Aspirer le liquide et remettre en suspension les vers dans environ 10 fois leur volume d'M9 contenant 30 ug / ml de TMP. Pipeter 20 ul de TMP (3 mg / ml) dans 2 ml de M9. Comme EMS, TMP est un puissant cancérigène et doit être manipulé en prenant les mesures de sécurité appropriées. Afin de prévenir de tout risque potentiel de l'oeil aux UV bonne lumière porte doit être utilisé. Les produits jetables doivent être jetés dans des sacs appropriés Biohazard.
3. Incuber le tube dans l'obscurité pendant 15 minutes à température ambiante sur une bascule basse vitesse (40 UPM). Réglez le tube vertical recouvert pendant 10 minutes pour permettre à tous les vers l'évier.
4. Retirez les vers du fond du tube avec une pipette Pasteur et de les transférer sur une plaque non ensemencée NGM. Jeter le surnageant suivant les directives de votre établissement chimiques dangereux.
5. Conservez la plaque dans l'obscurité jusqu'à ce que la TMP excès est absorbé dans l'assiette.
6. L'utilisation d'un mètre de l'intensité des UV, définir la distance entre la source UV à ondes longues et la plaque de telle sorte que l'intensité de la plaque est de 500 uW / cm ^{2 4.} Retirez le couvercle en aluminium et le couvercle et le couvercle et exposer la plaque contenant les vers TMP traitée aux rayons UV à ondes longues de 50 secondes.
7. Couvrez et laissez les vers dans l'obscurité pendant 5 heures à température ambiante.
8. Pick et le transfert d'apparence saine J4 larves fraîches plaques ensemencées. Jeter la plaque d'origine suivant les directives de votre établissement chimiques dangereux.
9. En utilisant un microscope stéréoscopique, l'écran de l'phénotypes génération F2 pour la mutation d'intérêt.

Partie 7: Résultats Représentant

Certains des P. phénotypes mutants pacificus résultant de la mutagenèse (soit par EMS ou TMP / UV) sont présentés dans la figure 1. Chaque mutant a un phénotype caractéristique qui se distingue facilement de l'animal de type sauvage. Du verqui ont été traités avec le mutagène, 30 J3/J4 larves de la génération parentale (P0) ont été placés dans des assiettes séparées et autorisés à pondre des oeufs, qui sont de la génération F1. Des plaques qui ont montré saine descendance F1, un total de 1000 F1 ont été transférés sur des plaques individuelles et la descendance F2 a été projeté pour les phénotypes. Les animaux atteints Dumpy ^{5,6, 6} et non coordonnée transformateur ⁷ phénotypes ont été trouvés.

Figure 1. Pristionchus pacificus type sauvage et les animaux mutants. A. B. poids poids hermaphrodites mâles de C. dpy mutant D. unc mutant E. TRA mutant. Haut deux panneaux montrant type sauvage hermaphrodites (à gauche) et mâle (à droite) afin de comparer les animaux avec les différents mutants dans les panneaux restants.

Discussion

La mutagenèse est une technique largement utilisée pour des études génétiques dans divers organismes modèles expérimentaux. Expériences de mutagenèse sont souvent utilisés pour identifier la fonction d'un gène ^2. Les procédures de mutagénèse décrites ici peuvent être utilisées non seulement pour P. pacificus, mais aussi pour C. elegans et d'autres espèces de nématodes connexes. Nous décrivons ici deux méthodes, EMS et TMP / UV mutagenèse.

EMS est une substance chimique qui induit des mutations ponctuelles ou de petites délétions dans le génome ^3,8. Psoralène mutagenèse (TMP / UV) provoque souvent des mutations de délétion dans l'ADN dus aux bris possibles induites par la lumière UV. Les fragments de suppression sont typiquement dans la gamme de 0,10 à 15 kb de longueur ^3.

Nous avons sélectionné pour les phénotypes qui sont relativement communs à trouver. Dans un écran utilisant le SME, pour chaque 400 plaques avec des animaux F2, environ une plaque avait une dpy, UNC ou Tra. Dpy peut être reconnue par ses courtes taille ^7, UNC pour son mouvement anormal ⁶ et Tra pour avoir un phénotype masculin et un caryotype XX ^7. TMP / UV mutagenèse a une fréquence inférieure de générer des mutants par rapport aux EMS ^3, mais il génère plus de suppressions.

Pour les nématodes, la larve stade de fin du quatrième ou le jeune adulte est le stade de développement le plus efficace pour réaliser la mutagénèse parce qu'ils ont le nombre maximum de noyaux de la lignée germinale. Il est donc utile de commencer l'expérience avec une population synchronisée parentale avec de nombreuses larves quatrième. Une façon simple de faire des cultures synchronisée est en faisant de nouvelles cultures avec des œufs au lieu de vers adultes. Dans la génération suivante, la plupart des vers sera environ le même âge. Mutations récessives peuvent être détectées en inspectant la descendance des individus F1, qui produisent environ 25 pour cent des homozygotes.

La puissance de cribles génétiques chez les nématodes peuvent être exploitées davantage en modifiant la conception de l'écran ^9. La combinaison du mode de vie hermaphrodites et temps de génération rapide rend nématodes idéal pour les études de génétique.