מבוא מעבדה תולעת: מ תולעים culturing כדי mutagenesis

Summary

הקרנת עבור מוטנטים עם מומים פנוטיפי היא שיטה פשוטה לזיהוי גנים פונקציה בתהליך ביולוגי נתון. במאמר זה אנו מתארים כיצד לשחרר את התרבות תולעים חיים (למשל,

Abstract

פרוטוקול זה מתאר את ההליכים כדי לשמור על נמטודות במעבדה וכיצד mutagenize אותם באמצעות שתי שיטות חלופיות: sulfonate מתאן אתיל (EMS) ו - 4, 5 ', 8-trimethylpsoralen בשילוב עם אור אולטרה סגול (TMP / UV). נמטודות הן מערכות ביולוגיות עוצמה עבור מחקרים בגנטיקה בגלל תוכנית פשוטה הגוף שלהם ואת מערכת הרבייה, המורכבת עצמית זבול הרמפרודיטים וזכרים כי ניתן להפיק מאות צאצאים לכל בעלי החיים. נמטודות נשמרות צלחות אגר המכיל דשא של חיידקים ניתן להעביר בקלות מהצלחת אחד למשנהו באמצעות להרים. EMS הוא סוכן אלקילציה נפוץ לגרום מוטציות נקודתיות ומחיקות קטן, בעוד tmp / UV גורמת בעיקר מחיקות. בהתאם מינים של נמטודות בשימוש, ריכוזים של EMS ו TMP יהיה חייב להיות מותאם. כדי לבודד מוטציות רצסיביות של פקיפיקוס נמטודות Pristionchus, בעלי חיים של דור F2 הוקרנו חזותית עבור פנוטיפים. כדי להמחיש את השיטות הללו, אנו mutagenized תולעים וחיפשתי מתואמים (UNC), גוצה (Dpy) ו שנאי (טרה) מוטנטים.

Protocol

חלק 1: הכנת צמיחה נמטודות מדיה (NGM) צלחות פטרי

נמטודות ניסויית כגון C. elegans ו פ פקיפיקוס הם בדרך כלל בתרבית במעבדה על 6 צלחות פטרי ס"מ המכיל צמיחה נמטודות בינוני (NGM) ^1. תולעים נשמרים 20 ° C, אבל יכול להיות מודגרות בטווח של טמפרטורות (בין 4 ° C - 25 ° C), בהתאם למין נמטודות ותכנון ניסויים. כדי להכין צלחות עם NGM, טכניקות סטרילי תקן צריך לשמש כדי למנוע זיהום פטרייתי חיידקי. להלן פרוטוקול להכין צלחות NGM:

1. לשקול 15 אגר גרם, 2.4 גרם NaCl, 2 גרם Tryptone, ו 2.72 גרם KH ₂ PO ₄ בבקבוק 2 ליטר חרוטי, לעשות נפח של עד 1 ליטר עם החיטוי מים, ומצננים עד 60 ° צלזיוס באמבט מים.
2. הוסף 0.8 מ"ל כל אחד 1 M CaCl _2, כולסטרול (5 מ"ג / מ"ל אתנול), ו 1 מ ₄ MgSO. כדי למנוע זיהום פטרייתי חיידקי, סטרפטומיצין 1 מ"ל (100 מ"ג / מ"ל) ו nystatin 1ml (10 מ"ג / מ"ל) ניתן להוסיף ליטר כל אחד בינוני.
3. באמצעות מכונת Unispense ושמירה בתנאים סטריליים, לשפוך את התקשורת לתוך צלחות הרצוי. צלחות צריך להיות מלא עד בערך 2 / 3 ^rd מלא. צלחת בקוטר 60 מ"מ סטנדרטי דורש כ 10 מ"ל של התקשורת. אין להזיז את הצלחות עד אגר הוא gelified לחלוטין, אחרת לא יהיה משטח אחיד של אגר, ולכן קשה להתמקד תולעים על stereomicroscope.
4. לאחר מיובשים, צלחות ניתן seeded מיד או מאוחסנים 4 ° C עד זריעת עם חיידקים.

חלק 2: הכנת OP50 חיידקים זריעת NGM צלחות פטרי

פ פקיפיקוס בתרבית במעבדה על ידי האכלה על המתח E.coli OP50. OP50 יש צמיחה מוגבלת על צלחות NGM, ובכך יוצרים הדשא דק המאפשר ראיה של תולעים ^1. כדי לגדול תרבות של OP50, להשתמש LB-מרק:

1. הוסף 5 גרם bactotryptone, 2.5 לחלץ גרם שמרים 2.5 גרם NaCl על בקבוק 500 מ"ל כובע בורג, לפצות את נפח 500 מ"ל מים מזוקקים החיטוי.
2. לחסן את המרק עם מושבת יחיד של OP50 מהצלחת התרבות בתנאים סטריליים ולתת לו לגדול בין לילה בשעה 37 ° C.
3. LB-OP50 הוא מוכן להיות בשימוש, ניתן לאחסן 4 ° C למשך מספר חודשים אם עקרות נשמר. בכל פעם צלחות צריך להיות מנוקה מגרעינים, לשפוך כמות קטנה של מרק לתוך מבחנה סטרילית קטן זה יעזור למנוע זיהום של התרבות המניות.
4. כדי צלחות זרע, לוותר 100-120 μl של OP50 על גבי צלחת בקוטר 60 מ"מ פטרי NGM ו מערבולת להפיץ אותו.
5. דגירה אלה צלחות seeded לילה בטמפרטורת החדר למשך הדשא לצמוח. הצלחות אלו זורעים כעת ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד 3 שבועות. אחסון אותם בעמדה הפוכה עוזר למנוע ייבוש מהיר.

חלק 3: ביצוע לבחור

בחלק זה אנו מתארים כיצד להכין לבחור עבור תולעים. לבחור משמש להעברת תולעים ממיקום אחד למשנהו. להרים עשוי 30% 90 מד חוט פלטינה אירידיום 10%, אם כי חוקרים אחדים עשויים להעדיף יצירות מתכת שונה במקצת:

1. חותכים כ 3-4 ס"מ של חוט, מקום של 0.5 ס"מ זה בתוך קצה פיפטה פסטר (אשר קצה נשברה לאורך קטן יותר) ולאחר מכן לאטום אותו לתוך הכוס מעל מבער בונזן. אורכו של חוט בולטות מן הכוס הוא כ 3-3.5 ס"מ, אך יכול להשתנות על פי העדפותיו.
2. שטחו את קצה של חוט, כי הוא בולט באמצעות פטיש או צבת. ואז לכופף כלפי מעלה חלק שטוח כדי ליצור סקופ.
3. Smoothen את הקצוות החדים של לקחת את הנייר עם חול כדי למנוע פגיעה תולעת או אגר.

חלק 4: תולעים קטיף

1. כדי לאסוף תולעים, לעקר את חוט פלטינה על להבה וגרור את קצה שטוח של להרים יחד הדשא חיידקים מעיל קצה עם חיידקים דביק עבה, נזהרת שלא לנקב או לפגוע משטח אגר.
2. שימוש stereomicroscope, מאוד קל לצחצח את קצה דביק נגד תולעים תולעת / להיות נטל עד התולעת מקלות על החיידקים על לבחור את.
3. לאחר התולעת הוא על קצה לבחור את, להעביר אותו מיד צלחת החדש על ידי נגיעה או הזזה קצה לבחור את הדשא נגד חיידקי של צלחת החדש, התולעת צריך לזחול משם. יש להקפיד לא לפגוע משטח של אגר בצלחת אחר התולעים לזחול לתוך החורים ולכן קשה לשלוף אותם. אם התולעת נשאר לבחור את זמן רב מדי, זה עלול ליבש.

חלק 5: EMS mutagenesis

Sulfonate אתיל מתאן (EMS) מעוררת קשת רחבה של מוטציות ב הגנום 2. מוטאנטים ניתן לזהות פגמים כמו הנחת ביצה, פגם שרירים, קביעת מין, היווצרות dauer, התנהגות, היווצרות אשך. פרוטוקול עבור EMS mutagenesis דומה לזה שתואר על C. elegans ^1.

1. הכן 500 מ"ל (או יותר) של 1N NaOH.
2. קח 4-5, 6 ס"מ קוטר צלחות פטרי מלא תולעים, המכיל כמה מאות תולעים בבית השלישי הזחל נעורים (J3) במה לשטוף את התולעים את שימוש 2-3 מ"ל של M9 סטרילי לכל צלחת.
3. לאסוף את כל התולעים סטרילית, חד פעמי שפופרת 15 מ"ל צנטריפוגות. צנטריפוגה XG ב 1500 5-7 דקות או עד התולעים צורה כדורית.
4. לשאוב את הנוזל והשימוש 2 מ"ל של M9 מחדש להשעות את התולעים. הוסף 20 μl EMS אל צינור המכיל 2ml של M9 ולנער לפזרו. לאחר מכן להוסיף את הפתרון הזה EMS כדי 2ml ההשעיה תולעת מערבולת בעדינות. הריכוז הסופי של EMS יהיה 47 מ"מ. זהירות: EMS היא mutagen מאוד חזק יש לטפל במנדף קטר. כל החומרים (כפפות, טפטפות, טיפים) כי בא במגע עם mutagen זה יש להתייחס 1N NaOH ל פעיל EMS. לבשו כפפות כפול במהלך ההליך כולו EMS mutagenesis. השליכו פסולת מסוכנת על פי הנחיות המוסד שלך.
5. מניחים את הצינור צנטריפוגות ולכסות את הכובע עם parafilm; למקם אותו אופקית למכסה המנוע קטר ולתת את התולעים דגירה עבור 3.5 שעות. הצינור ניתן גם דגש על כיסא נדנדה במהירות נמוכה.
6. סובבו את הצינור לכסות את המכסה עם parafilm; מקום במצב אנכי דגירה ועד כיור התולעים.
7. לשאוב supernatant וזורקים אותו לתוך כוס / בקבוק המכיל 1N NaOH. זה יהיה להשבית EMS.
8. הוסף 5 מ"ל M9 של תולעים, להפוך את הצינור 25-30 פעמים כדי לשטוף את התולעים, צנטריפוגה XG ב 1500 עבור 5-7 דקות או עד התולעים צורה כדורית. לשאוב supernatant וזורקים לתוך כוס NaOH 1N.
9. חזור על השלב כביסה לפחות 3 פעמים.
10. לאחר לשטוף הסופי, מחדש להשעות את התולעת גלולה בסכום מינימלי (~ 500 μl) של M9 ו פיפטה אותם לצלחות NGM המכיל הדשא של OP50 חיידקים. בשלב הזה אתה כבר לא צריך לעבוד במנדף כימי.
11. תנו לנוזל להתייבש במשך כמה דקות ולאחר מכן לבחור ולהעביר בריא מחפש J4 הזחלים כדי טריים צלחות seeded. מחק את הצלחת המקורי בהתאם להנחיות מסוכנים המוסד שלך פסולת.
12. תן את עצמי תולעים mutagenized להפרות. שימוש stereomicroscope, המסך פנוטיפים בדור F2 עבור מוטציות רצסיביות של עניין.

חלק 6: Psoralen mutagenesis

בחלק זה אנו מתארים את הליך mutagenesis באמצעות TMP בשיתוף עם אולטרה סגול באורך גל ארוך (UV). Tmp / UV שיטת mutagenesis נעשה שימוש נרחב כדי לגרום מוטציות מחיקה בתוך הגנום ^3.

1. איסוף תולעים 4-5, 6 ס"מ קוטר צלחות פטרי לתוך שפופרת 15 מ"ל צנטריפוגות כמתואר בהליך הקודם.
2. הוסף 10 מ"ל M9, להפוך 20 פעמים כדי לשטוף את תולעים צנטריפוגות XG ב 1500 במשך 5 דקות. בטל supernatant וחזור הכביסה עבור סכום כולל של 3 פעמים. לשאוב את הנוזל מחדש להשעות את התולעים בערך 10 פעמים את היקפן של M9 המכילות 30 מיקרוגרם / מ"ל ​​של TMP. פיפטה 20 μl של TMP (3 מ"ג / מ"ל) לתוך 2 מ"ל של M9. כמו EMS, TMP הוא קרצינוגן חזק ויש לטפל נקיטת אמצעי בטיחות נאותה. כדי למנוע סיכון פוטנציאלי של העין UV באור הנכון לובש אמור לשמש. Disposables חייב להיות מושלך בשקיות Biohazard הנכון.
3. דגירה צינור בחושך במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר על כיסא נדנדה במהירות נמוכה (40 UPM). הגדר את צינור אנכי מכוסה במשך 10 דקות כדי לתת את כל כיור תולעים.
4. הסר את התולעים מהחלק התחתון של הצינור עם פיפטה פסטר ולהעביר אותם לצלחת NGM unseeded. בטל supernatant עמידה בהנחיות מסוכנים המוסד שלך כימיים.
5. שמור את הצלחת בחושך עד TMP עודף נספג לתוך הצלחת.
6. בעזרת מד עוצמת קרינת UV, להגדיר את המרחק בין מקור UV גל ארוך ואת צלחת כזו שעוצמת על הצלחת הוא 500 μW / ^{2 4} ס"מ. הסר את מכסה האלומיניום המכסה לכסות ולחשוף את צלחת המכילה את התולעים TMP שטופלו על קרינת UV גל ארוך של 50 שניות.
7. מכסים ומניחים את התולעים בחושך במשך 5 שעות בטמפרטורת החדר.
8. איסוף והעברת בריא מחפש J4 הזחלים כדי טריים צלחות seeded. מחק את הצלחת המקורי מסוכנים בעקבות הנחיות המוסד שלך כימיים.
9. שימוש stereomicroscope, המסך פנוטיפים בדור F2 עבור מוטציה של עניין.

חלק 7: תוצאות נציג

חלק פ ' פקיפיקוס פנוטיפים מוטנטים הנובע mutagenesis (או על ידי EMS או TMP / UV) מוצגות באיור 1. מוטציה לכל אחד יש פנוטיפ אופייני בקלות להבדיל בינו ובין החיה סוג בר. מ התולעיםשטופלו עם mutagen, 30 J3/J4 הזחלים מן הדור של ההורים (P0) הונחו צלחות נפרדות מותר להטיל ביצים, שהם דור F1. מתוך צלחות שהראו צאצאים F1 בריא, סך של 1000 F1s הועברו על צלחות הפרט צאצאים F2 הוקרן עבור פנוטיפים. בעלי חיים עם ^5,6 הרעוע, ⁶ תיאום שנאי ⁷ פנוטיפים נמצאו.

באיור 1. Pristionchus סוג פקיפיקוס בר וחיות מוטציה. א ב wt wt אנדרוגינוס זכר ג dpy מוטציה ד UNC מוטציה E. tra מוטציה. למעלה שני פאנלים מראה סוג הרמפרודיט בר (משמאל) זכר (מימין) חיות להשוות עם מוטנטים שונים לוחות הנותרים.

Discussion

Mutagenesis היא טכניקה מועסקים נרחב עבור מחקרים גנטיים שונים של אורגניזמים מודל ניסיוני. ניסויים mutagenesis משמשים לעתים קרובות כדי לזהות את הפונקציה של הגן ^2. הנהלים mutagenesis המתואר כאן ניתן להשתמש לא רק על פ פקיפיקוס, אלא גם עבור ג אלגנס ושאר מיני נמטודות בנושא. כאן אנו מתארים את שתי השיטות, EMS ו-tmp / UV mutagenesis.

EMS הוא חומר כימי שגורם מוטציות נקודה או מחיקות קטנות לאורך הגנום ^3,8. Psoralen mutagenesis (TMP / UV) בעיקר גורם מוטציות מחיקה ב-DNA עקב שבירה אפשרי המושרה על ידי אור UV. שברי המחיקה הם בדרך כלל בטווח של 0.10-15 kb באורך ^3.

אנו לגילוי פנוטיפים כי הם נפוצים יחסית למצוא. במסך באמצעות EMS, עבור כל 400 צלחות עם חיות F2, על צלחת אחת היתה Dpy, UNC או Tra. Dpy יכול להיות מוכר על ידי גודל קצרים שלה ^7, UNC עבור תנועה חריגה שלו ⁶ ו Tra עבור בעל פנוטיפ הזכר קריוטיפ XX ^7. Tmp / UV mutagenesis יש תדר נמוך של יצירת מוטציות לעומת EMS ^3, אבל זה יוצר מחיקות גדולות.

עבור נמטודות, הזחל מאוחר השלב הרביעי או מבוגר צעיר הוא השלב ההתפתחותי היעילה ביותר לבצע mutagenesis כי יש להם את המספר המרבי של גרעינים קו נבט. לכן כדאי להתחיל את הניסוי עם אוכלוסייה ההורים מסונכרן עם זחלים רבים השלב הרביעי. דרך פשוטה של ​​קבלת תרבויות מסונכרן היא על ידי ביצוע תרבויות חדשות עם ביצים במקום תולעים בוגרות. בדור הבא, רוב התולעים יהיו בערך באותו גיל. מוטציה רצסיבית יכולים להתגלות בבדיקת הצאצאים של אנשים F1, אשר ייצרו כ - חמישה אחוזים עשרים הומוזיגוטים.

כוחה של מסכי גנטי נמטודות ניתן לנצל עוד יותר על ידי שינוי העיצוב של המסך ^9. השילוב של סגנון חיים hermaphroditic וזמן הדור מהיר עושה נמטודות אידיאלי עבור מחקרים בגנטיקה.