웜 실험실 소개 : Culturing 웜에서 돌연변이 유발하는

Summary

phenotypic 결함과 돌연변이에 대한 심사는 특정 생물 학적 과정에서 기능 유전자를 확인하는 간단한 방법입니다. 이 문서에서 우리는 어떻게 문화 무료 생활 웜 (예에 대한 설명

Abstract

자외선 (TMP / UV)와 함께 에틸 메탄 설 폰 산염 (EMS)와 4, 5 ', 8 trimethylpsoralen :이 프로토콜은 실험실과 방법이 다른 방법을 사용하여 mutagenize에 nematodes을 유지하기 위해 절차를 설명합니다. Nematodes 때문에 자기 비옥하게하는 나온것과 동물마다 자손의 수백을 생성할 수 있습니다 남성 구성되어 있습니다들의 간단한 신체 계획 및 짝짓기 시스템의 유전학 연구에 대한 강력한 생물 학적 시스템입니다. Nematodes는 박테리아의 잔디를 포함하는 한천 플레이트에 유지되며 쉽게 한 접시에서 선택을 사용하여 다른 전송할 수 있습니다. TMP / UV 주로 삭제를 유도하면서 EMS는 일반적으로 포인트 돌연변이와 작은 삭제를 유도하는 데 사용 alkylating 요원입니다. 사용중인 선충류의 종류에 따라, EMS 및 TMP의 농도 최적화해야합니다. 선충류 Pristionchus의 pacificus의 열성 변이를 분리하려면 F2 세대의 동물은 시각 phenotypes에 대한 상영되었다. 이러한 방법을 설명하기 위해, 우리는 벌레를 mutagenized 및 Uncoordinated (UNC), 덤피 (Dpy)와 변압기 (트라) 돌연변이에 대한 보았다.

Protocol

1 부 : 준비 선충류의 성장 미디어 (NGM) 페트리 접시

이러한 C. 엘레간스 및 P.으로 실험 nematodes pacificus은 일반적으로 선충류 성장 매체 (NGM) ^1을 포함 6cm 페트리 접시에 연구실에 양식 있습니다. 웜 20 ° C에 보관하지만, 온도 범위 (° C 넷 사이 - 25 ° C)에서 incubated 수있는 선충류의 종류와 실험 설계에 따라. NGM와 접시를 준비하려면, 표준 살균 기술은 곰팡이와 세균 오염을 방지하는 데 사용해야합니다. 다음은 NGM 번호판을 준비하는 프로토콜입니다 :

1. 15g의 한천, 2.4 g NaCl, 2g Tryptone, 그리고 2.72 g KH ₂ PO ₄ 2 패 원뿔형 플라스크에 물, 압력솥 1 L에 볼륨을 만들어하고 60 물을 욕조에 몸을 ° C를 냉각 허용 무게.
2. 0.8 ML 1 M CaCl _2의 각 콜레스테롤 추가 (5 MG / 에탄올에 ML), 1 M MgSO _4. 곰팡이와 박테리아 오염 1 ML의 스트렙토 마이신 (100 MG / ML)과 1ml nystatin (10 MG / ML) 방지하기 위해 매체의 각 리터에 추가할 수 있습니다.
3. Unispense 기계를 사용하고 살균 조건을 유지, 원하는 접시에 미디어를 부어. 접시는 ^차 3분의 2에 대한 전체에 가득해야합니다. 표준 60mm 직경 판은 미디어의 약 10 ML이 필요합니다. 한천이 완전히 gelified 때까지 접시 움직이 지마, 그렇지 않으면 어려운 stereomicroscope에 벌레를 집중할 수 있도록, 한천의 고르지 않은 표면에있을 것입니다.
4. 일단 건조, 접시는 4 즉시 씨앗하거나 저장할 수 있습니다 ° C를 박테리아와 시딩까지.

2 부 : OP50 박테리아를 준비하고 시딩 NGM 페트리 접시

P. pacificus은 E.coli OP50 변형에 먹이로 실험실에서 배양해 있습니다. OP50되므로 벌레 ^1의 시각화를 용이 얇은 잔디를 형성, NGM의 접시에 제한된 성장을하고 있습니다. OP50의 문화를 성장, LB - 국물을 사용합니다

1. 500 ML 스크류 캡 병으로, 증류수 및 압력솥 500 ML에 볼륨을 만들어 5g bactotryptone, 2.5 g 효모 추출물 및 2.5 g NaCl을 추가합니다.
2. 무균 조건 하에서 문화 판에서 OP50의 단일 식민지로 국물을 예방하고 37 밤새기를 ° C.
3. LB - OP50는 사용 준비가되고 불임이 유지하는 경우 4 ° C 몇 달 동안 저장할 수 있습니다. 접시가 씨앗을해야 때마다 작은 살균 비커에 국물의 작은 금액을 부어 이것은 주식 문화의 오염을 방지하는 데 도움이됩니다.
4. 종자 접시하려면, 60mm 직경 NGM 페트리 접시 그것을 확산하기 위해 소용돌이에 OP50의 100-120 μl를 분배.
5. 성장 잔디에 대한 실온에서 하룻밤이 씨앗 번호판을 품어. 이러한 씨앗 플레이트는 이제 최대 3 주 4 ° C에 저장할 수 있습니다. 거꾸로 위치에서 그들을 저장하면 빠른 건조를 방지하는 데 도움이됩니다.

3 부 : 선택 만들기

이 섹션에서 우리는 벌레에 대한 선택을하는 방법에 대해 설명합니다. 선택 한 위치에서 다른 위치로 웜을 전송하는 데 사용됩니다. 일부 연구자들은 약간 다른 금속 성분을 선호하는 수도 있지만 선택은 30 게이지 90 % 백금 10 % 이리듐 와이어로 만들어진 것입니다 :

1. 와이어 3~4센티미터에 대한 잘라내기, 장소는 다음 파스퇴르 피펫 (그의 팁 작은 길이로 고장 난 것)의 팁, 그리고 안에 0.5 cm은 알콜 램프를 통해 유리에 그것을 봉인. 유리에서 튀어나온 철사의 길이는 약 3-3.5 cm이지만, 개인의 선호에 따라 달라질 수 있습니다.
2. 망치 또는 펜치를 사용하여 튀어나와 철사의 끝을 평평하게. 그렇다면 특종을 형성하기 위해 평평 부분 위쪽 구부 러.
3. 웜 또는 한천 손상을 방지하기 위해 모래 종이 선택의 날카로운 가장자리를 Smoothen.

부 4 : 피킹 웜

1. , 웜을 선택 불꽃에 백금 와이어를 소독하고 주사 또는 손상 한천 표면에 치료하지 복용, 코팅 두께 스티커 박테리아와 팁을에 세균성 잔디밭을 따라 선택의 평평 팁을 드래그하십시오.
2. stereomicroscope를 사용하여 매우 가볍게 웜이 선택에있는 박테리아에 스틱까지 뽑힐 수있는 웜 / 웜으로부터 쓰는 팁을 브러시.
3. 벌레가 선택의 끝에되면, 만지거나 새 접시의 세균성 잔디에 대한 선택의 팁을 슬라이딩하여 새 접시에 즉시 전송하고, 웜은에서 크롤 링해야합니다. 케어는 다른 벌레가 어려운 이들을 검색할 수 있도록 구멍으로 기어 접시에 한천의 표면을 손상하지 않도록해야합니다. 벌레가 너무 오래를위한 선택 좋다면, 그것은 마르다 수 있습니다.

제 5 부 : EMS 돌연변이 유발

에틸 메탄 설 폰 산염 (EMS)는 게놈 2에 돌연변이의 광범위한 스펙트럼을 유도. 돌연변이 달걀 부설, 근육의 결함과 같은 결함에 의해 확인할 수 있습니다S, 섹스 결정, dauer 형성, 행동, 및 생식선 형성. EMS 돌연변이 유발에 대한 프로토콜은 C.에 대한 묘사와 비슷합니다 엘레간스 ^1.

1. 1N NaOH 500 ML (또는 이상) 준비합니다.
2. , 웜 가득 6cm 직경 페트리 접시를 4-5을 가지고 세 번째 애벌레 청소년 (J3) 단계에서 몇 백 벌레가 포함된 플레이트마다 멸균 M9로부터 2-3 ML을 사용하여 해제 벌레를 씻으십시오.
3. 멸균, 일회용 15 ML의 원심 분리기 튜브의 모든 벌레를 수집합니다. 벌레가 펠렛을 형성 때까지 5~7분 또는 1,500 XG에 원심 분리기.
4. 액체를 대기음 다시 중단 웜을 M9 2 ML을 사용합니다. M9의 2ml를 포함하는 튜브 20 μl EMS를 추가하고 그것을 해산하는 흔들. 그런 다음 부드럽게 웜 서스펜션과 소용돌이의 2ml이 EMS 솔루션을 추가합니다. EMS의 최종 농도 47 MM 것입니다. 주의 : EMS는 아주 강한 mutagen이며 퓸 후드에서 처리되어야합니다. 이 mutagen 접촉 모든 자료 (장갑, pipettes, 도움말) 비활성 EMS에 1N NaOH로 치료해야합니다. 전체 EMS의 돌연변이 유발 절차 중에 이중 장갑을 착용한다. 귀하의 기관의 지침에 따라 유해 폐기물을 배출.
5. 원심 분리기 튜브를 삽입하고 parafilm으로 뚜껑을 커버하며 퓸 후드의 수평을 장소 및 3.5 시간 동안 품어 벌레를 보자. 튜브 또한 저속 락커에 둘 수 있습니다.
6. 튜브를 켜고 parafilm으로 뚜껑 커버, 벌레 싱크까지 수직 위치 및 부화에서 개최합니다.
7. 뜨는을 대기음하고 1N NaOH를 포함하는 비커 / 플라스크에 폐기하십시오. 이것은 EMS를 inactivate 것입니다.
8. 웜 5 ML M9를 추가 웜은 펠렛을 형성 때까지 5-7 분 또는 1500 XG에서 웜, 원심을 씻어 관에게 25-30 번 반전. 뜨는을 대기음하고 1N NaOH의 비커에 폐기합니다.
9. 세척 단계 적어도 3 회 반복합니다.
10. 최종 세척 후, M9의 최소한의 금액 (~ 500 μl)에 벌레 펠렛을 다시 정지 및 OP50 박테리아의 잔디를 포함 NGM 접시에 그들을 피펫. 이 시점에서 당신은 더 이상 화학 후드에서 일할 필요가 없습니다.
11. 몇 분 동안 액체가 건조 해하고 선택하고 신선한 씨앗 판으로 건강 찾고 J4 애벌레를 전송할 수 있습니다. 귀하의 기관의 유해 폐기물의 지침에 따라 원래의 번호판을 폐기하십시오.
12. mutagenized 벌레 자체가 비옥하자. stereomicroscope를 사용하여 관심있는 열성 돌연변이에 대한 F2 세대 phenotypes를 화면.

6 부 : Psoralen 돌연변이 유발

이 섹션에서 우리는 긴 파장의 자외선 (UV)과 함께 TMP를 사용하여 돌연변이 유발에 대한 절차를 설명합니다. 돌연변이 유발의 TMP / UV 방법은 널리 게놈 ^세 이내에 삭제 변이를 유도하는 데 사용됩니다.

1. 로 이전 절차에서 설명한 15 ML의 원심 관에 4-5, 6cm 직경 페트리 접시에서 벌레를 수집합니다.
2. 5 분 1,500 XG에서 웜 및 원심 분리기를 씻어 20 회 반전, 10 ML M9을 추가합니다. 뜨는을 취소하고 3 회 총 세탁을 반복합니다. 액체를 기음과 M9 자신의 부피가 30 μg / TMP의 ML을 포함하는 약 10 배에서 벌레를 다시 일시 중지합니다. M9 2 ML로 TMP의 피펫 20 μl (3 MG / ML). EMS와 마찬가지로, TMP는 강력한 발암 물질이고 적절한 안전 대책을 복용 처리되어야합니다. 자외선 적절한 눈 착용의 잠재적인 위험으로부터 방지하기 위해 사용해야합니다. disposables은 적절한 생물 학적 가방에 폐기해야합니다.
3. 저속 로커 (40 UPM)에 실온에서 15 분 어둠 속에서 튜브를 품어. 모든 벌레 싱크를 수 있도록 10 분 동안 수직으로 적용 튜브를 설정합니다.
4. 파스퇴르 피펫으로 튜브의 바닥에서 벌레를 제거하고 unseeded NGM 판에 그들을 전송합니다. 귀하의 기관의 유해 화학 물질 지침에 따라 뜨는 폐기하십시오.
5. 초과 TMP가 접시에 흡수 될 때까지 어두운 접시 보관하십시오.
6. 자외선 강도 측정기를 사용하여 접시에 강도가 500 μW / cm ^{2 4되는} 긴 웨이브 UV 소스와 같은 접시 사이의 거리를 설정합니다. 알루미늄 커버와 덮개를 제거 50 초 동안 긴 웨이브 UV 방사선에 TMP 처리 벌레가 들어있는 접시를 커버하고 노출.
7. 커버 및 실온에서 5 시간 동안 어둠 속에서 벌레를 두십시오.
8. 선택 신선한 씨앗 접시에 건강 찾는 J4 애벌레를 전송할 수 있습니다. 귀하의 기관의 유해 화학 물질 지침에 따라 원래 번호판을 폐기하십시오.
9. stereomicroscope를 사용하여 관심의 돌연변이에 대한 F2 세대 phenotypes를 화면.

7 부 : 대표 결과

P. 일부 돌연변이 유발 (중 EMS 또는 TMP / UV에 의해)으로 인한 pacificus 돌연변이 phenotypes는 그림 1에 표시됩니다. 각 돌연변이가 야생 동물 종류에서 쉽게 구별되는 특성 표현형 있습니다. 벌레에서mutagen, 부모 세대 (P0)에서 30 J3/J4 애벌레 별도의 접시에 배치하고 F1 생성 아르 달걀을 낳기 위해 허용되었다 취급다고. 건강 F1 자손을 보여주 접시에서 1000 F1s의 총 개인 접시에 양도되었고 F2 자손은 phenotypes에 대한 검사를했습니다. 덤피 ^5,6, Uncoordinated ⁶ 변압기 ⁷ phenotypes과 동물이 발견되었습니다.

그림 1. Pristionchus pacificus 야생 유형 및 돌연변이 동물. A. WT 남녀 추니 B. WT 남성 C. dpy 돌연변이 디 UNC 돌연변 E. 트라 돌연변이. 나머지 패널에있는 여러 돌연변이와 비교 야생 유형 남녀 추니 (왼쪽)와 수컷 (오른쪽) 동물을 보여주는 상위 2 패널.

Discussion

돌연변이 유발 다양한 실험 모델 생물의 유전자 연구 널리 고용 기법입니다. 돌연변이 유발 실험은 종종 유전자 ^2의 기능을 식별하는 데 사용됩니다. 여기에 설명된 돌연변이 유발 절차 P.을 위해뿐만 아니라 사용할 수 있습니다 pacificus뿐만 아니라, C.위한 엘레간스 및 기타 관련 선충류 종. 여기서 우리는 두 가지 방법, EMS 및 TMP / UV 돌연변이 유발을 설명합니다.

EMS는 게놈에 걸쳐 ^3,8 점 돌연변이 또는 작은 삭제를 유도 화학입니다. Psoralen 돌연변이 유발 (TMP / UV)은 주로 자외선에 의해 유도 가능한 파손에 의한 DNA의 삭제 변이를 유도. 삭제 조각의 길이는 ³ 0.10-15 kb 범위에서 일반적으로있다.

우리는 찾을 수 일반화되어 phenotypes에 대한 검사. F2 동물 각 400 접시를 위해 EMS를 사용하여 화면에서 약 판은 Dpy, 삼촌이나 트라했다. Dpy은 남성의 표현형 및 XX 핵형 ⁷ 것에 대해서는 비정상적인 운동 ⁶ 트라에 대한 짧은 크기 ^7, 삼촌으로 인식된다. TMP / UV 돌연변이 유발은 EMS ^세에 비해 돌연변이를 생성 낮은 주파수를 갖고 있지만, 그것은 더 삭제를 생성합니다.

nematodes 들어, 후반 네번째 무대 유충이나 젊은 성인들은 세균 라인 핵의 최대 개수를 가지고 있기 때문에 돌연변이 유발을 수행하는 가장 효과적인 발달 단계입니다. 그것은 많은 네번째 무대 애벌레와 동기 부모 인구 실험을 시작하는 것이 유용합니다. 동기 문화를 만드는 간단한 방법은 계란 대신 성인 웜 새로운 문화를 만드는 것입니다. 다음 세대에서 대부분의 벌레는 동일한 나이 것입니다. 열성 돌연변이 homozygous의 25%에 대한 생산됩니다 F1 개인의 자손을 조사하여 감지가 가능하다.

nematodes의 유전자 화면의 힘은 더욱 화면 ^9의 디자인을 수정하여 이용할 수 있습니다. 자웅 동체 생활과 빠른 세대 시간의 조합은 유전학 연구에 이상적인 nematodes을합니다.